朱秀清，鄧筱琪，朱 穎, ，王喜泉，李玉玲，夏曉雨,4

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.東北農業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.哈爾濱中央紅集團股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150010；4.黑龍江省農業(yè)科學院大豆研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）具有優(yōu)質、廉價的特點且功能特性廣泛，在許多行業(yè)被廣泛使用[1]。大豆粉碎后經低溫脫脂、堿溶酸沉工藝后提取即可得到SPI，SPI中大豆蛋白含量達到88%以上[2]。大豆分離蛋白具有許多功能特性，如凝膠性[3?6]、乳化性[7?8]、持水性[9]、持油性[10]以及溶解性等。SPI的功能特性與其中7S（β-conglycinin）和11S（glycinin）組分密切相關。因此，探究蛋白質組成結構的構效關系是研究與開發(fā)大豆分離蛋白產品的基礎。

近些年來，大豆蛋白制品越來越豐富，應用十分廣泛，其中蛋白凝膠制品受關注度最高。蛋白凝膠是指大豆蛋白經變性后與相鄰的蛋白分子之間通過化學作用力形成的一類三維網絡結構，也可與轉谷氨酰胺酶、硫酸鈣（CaSO4）等相互作用形成蛋白凝膠制品。蛋白凝膠作為包埋不穩(wěn)定小分子活性物質（維生素、益生菌等）的載體，其凝膠特性也是蛋白質最重要的功能特性[11]。影響大豆蛋白凝膠形成的因素可分為兩大類：內在因素和外在因素。其中內在因素主要是大豆蛋白的組成（7S蛋白、11S蛋白以及兩種蛋白存在的濃度和比例、鹽離子濃度以及多糖、脂質與蛋白之間的相互作用等）；而外部環(huán)境因素則是物理、化學及生物等前處理方式引起大豆蛋白改性導致的凝膠性改變（如熱處理、超聲波處理、高壓處理、擠壓處理、菌誘導和酶水解等）[12?13]。研究表明：在不同因素影響下大豆蛋白產生凝膠，天然大豆蛋白聚集體的穩(wěn)定性較差，其結構在持續(xù)發(fā)生解離，變性蛋白聚集體的穩(wěn)定時間一般為一周左右，這表明蛋白質在變性時形成了更加持久穩(wěn)定的化學鍵以維持聚集體，從而提高蛋白凝膠制品的穩(wěn)定性[2]。

凝膠的形成是多種因素共同作用的結果，各因素的變化會導致形成具有不同性質差異的凝膠。本文主要通過綜述前人對蛋白質凝膠形成機理及穩(wěn)定性的研究，對大豆蛋白構象及組成、多糖、脂質間的相互作用等內在影響因素，以及物理、化學、生物等前處理加工方式進行深入探討及解析。

1 蛋白質凝膠成膠機理

蛋白質凝膠的形成是一個復雜的過程，包含蛋白質變性、解離、聚集和凝膠化等多個物理化學反應，目前普遍認為加熱是蛋白質膠凝過程中必不可少的步驟[14]。蛋白質分子受熱導致蛋白質變性，天然蛋白質的構象發(fā)生改變，蛋白質的二、三、四級結構遭到破壞，使蛋白質分子從天然的折疊狀態(tài)舒展開，內部隱藏的活動位點以及功能性基團暴露（包括巰基或疏水基團），然后通過疏水、靜電及氫鍵、巰基二硫鍵等交換反應進行相互作用，使分子間進行交聯(lián)，形成可逆的蛋白質聚集體，導致粒徑增大。當聚集體的濃度足夠時，分子間發(fā)生進一步的聚集，形成三維網絡狀結構，即蛋白凝膠形成[15?17]。而當?shù)鞍踪|的濃度較低時，聚集可能會導致蛋白質發(fā)生沉淀。除熱處理外，還有加酸、加酶、加鹽以及離子誘導等方式均可形成蛋白質凝膠[18?21]，其中加酸通過改變體系pH，影響蛋白所帶凈電荷數(shù)，從而改變蛋白存在的點和環(huán)境，影響凝膠的形成；加鹽或離子誘導則是通過改變蛋白與蛋白間或蛋白與環(huán)境間的靜電斥力，影響蛋白分子量的分布和蛋白粒徑的大小，從而影響凝膠的形成，大豆蛋白冷凝膠通常就是通過添加鹽、植酸等凝固劑形成的，見圖1。

圖1 大豆蛋白熱、冷凝膠形成機理Fig.1 Soy protein hot and cold gel formation mechanism

李云[22]通過加熱、加酸及加酶三種不同的處理方式，制備了5種具有不同功能特性的大豆蛋白聚集體，將其與天然大豆蛋白混合后制成熱凝膠，結果表明添加少量的蛋白聚集體可提高大豆蛋白的凝膠性質，但過量的蛋白聚集體則會使大豆蛋白的凝膠性降低。Yang等[23]發(fā)現(xiàn)，低pH處理能夠明顯提高SPI的疏水性和糖基化能力，增強凝膠粒子在溶液中的穩(wěn)定性。因此，蛋白聚集對凝膠質構的影響主要是在微觀形態(tài)上對相分離程度和膠凝速度產生影響。

2 7S、11S蛋白組成對蛋白凝膠的影響

按照溶解特性，可將大豆蛋白分為球蛋白與清蛋白，其中球蛋白大約占總蛋白質含量的90%。根據(jù)蛋白質在緩沖液（pH7.6，0.5 mol/L）中的沉降系數(shù)不同，又可將大豆球蛋白分為四個組分，分別是：2S（15%）、7S（34%）、11S（41.9%）和 15S（9.1%）[24]。2S 組分包含：Bowman-Birk 和 Kunitz 型胰蛋白酶抑制劑、細胞色素C等[15]。7S組分主要是β-伴大豆球蛋白，但也包含γ-伴大豆球蛋白、脂肪氧合酶、α-淀粉酶和凝集素[25]。11S蛋白和15S蛋白分別是大豆球蛋白和它的聚合體。研究表明，不同比例的7S蛋白與11S蛋白會影響大豆蛋白質的凝膠性，通過調節(jié)二者比例可以形成具有不同凝膠特性的大豆蛋白凝膠[26]。因此，亞基組成比例對大豆蛋白功能性的影響一直是相關學者研究的重點。

2.1 7S蛋白組成對大豆蛋白凝膠的影響

7S球蛋白是一種三聚體共軛型的糖蛋白（150～200 kDa），由α亞基（72 kDa）、α′亞基（76 kDa）和β亞基（53 kDa）三種亞基組成，該三種亞基通過氫鍵及疏水相互作用力隨機排列組合在一起，形成平面三角形緊密堆積成7S蛋白分子[27?29]，并形成七種不同的存在形式：βββ、ββα′、ββα、βαα′、βαα、ααα′和ααα[30?32]。不同亞基組成導致蛋白質凝膠化效果不同，同時亞基間的相互作用也會影響蛋白質凝膠的穩(wěn)定性。

7S球蛋白的α′亞基（76 kDa）與α亞基（72 kDa）分子質量極其相似，通常作為一個對象進行研究。在研究α′與α亞基對大豆蛋白的凝膠特性的影響中，該兩種亞基均表現(xiàn)出了與凝膠特性的顯著相關性。袁德保等[31]探討了大豆蛋白α、α′、β與堿性亞基各亞基間的熱聚集凝膠化行為機制，結果指出α、α′和β亞基對蛋白的熱聚集反應均起到抑制作用，其中α、α′亞基抑制效果強于β亞基。Mohamad等[33]對比完整7S蛋白與缺失α′亞基的7S蛋白制備的內脂豆腐凝膠，缺少α′亞基的豆腐凝膠硬度較高，故推斷7S蛋白α′亞基對內脂豆腐硬度和凝膠強度產生了明顯的負作用。

2.2 11S蛋白組成對大豆蛋白凝膠的影響

11S球蛋白是一種六聚體型的非糖蛋白（300～380 kDa），由酸性亞基A（35～37 kDa）和堿性亞基B（20 kDa）通過二硫鍵作用組成11S球蛋白單體[34?35]。Utsumi等[36]根據(jù)11S球蛋白酸性亞基和堿性亞基的N-端氨基酸序列將11S球蛋白亞基區(qū)分為以下五個主要的亞基：A1aB1b、A1bB2、A2B1a、A3B4和A5A4B3。

11S蛋白凝膠形成是11S蛋白亞基相互作用的結果。Nakamura等[37]揭示了11S蛋白凝膠形成的機理（圖2）：在短時加熱過程中（約15 s），蛋白質分子形成包含6個11S蛋白亞基的線狀聚集體Ⅰ（鏈Ⅰ），此時線狀聚集體Ⅰ中的蛋白亞基仍是球狀；接著線狀聚集體Ⅰ發(fā)生自身聚集，形成長度較長的直鏈聚集體Ⅱ（鏈Ⅱ），直鏈聚集體Ⅱ進一步與自身發(fā)生聚集形成長度更長的直鏈型聚集體或與線狀聚集體Ⅰ形成支鏈型聚集體，統(tǒng)稱聚集體Ⅲ（鏈Ⅲ），該聚集體Ⅲ即為構成11S蛋白凝膠網絡結構的基本單位。

圖2 11S大豆球蛋白凝膠化形成聚合物過程Fig.2 11S soybean globulin gel forming polymer process

James等[38]通過選取11S球蛋白完整以及缺失11SA4亞基的大豆來制備豆腐，結果表明11SA4亞基缺失對豆腐凝膠組織結構及硬度具有積極影響，因此缺失該亞基可以提高豆腐的凝膠硬度以及保水能力。Yang等[39]探討不同蛋白含量大豆蛋白11SA4亞基的缺失與其中7S和11S蛋白水平的相關性關系時發(fā)現(xiàn)，11SA4亞基的缺失與大豆蛋白凝膠的保水力呈正相關。在蛋白質含量較高時選擇性去除11SA4亞基可以提高凝膠組織硬度和保水能力。這和James的研究結果相似。Bainy等[40]在對蛋白質亞基組成與大豆分離蛋白的凝膠特性的相關性研究中發(fā)現(xiàn)：11S球蛋白的A3亞基的存在阻礙了凝膠網狀結構的形成。Tezuka等[41]的研究證實，大豆中11S蛋白A1和A2亞基含量較多更易發(fā)生聚集。綜上所述，11S蛋白的亞基組成對蛋白凝膠的性質有顯著影響。

2.3 7S和11S蛋白比例對大豆蛋白凝膠的影響

7S伴大豆球蛋白主要影響蛋白凝膠的黏性和彈性，11S大豆球蛋白影響的則是蛋白凝膠的硬度和咀嚼性。兩種蛋白的影響效果并不是獨立的，在Yang等[39]的研究中發(fā)現(xiàn)11SA4亞基的缺失會引起7S蛋白的代償性積累。因此，應綜合分析7S和11S蛋白對凝膠性的影響。截止目前，可以確定兩種蛋白的占比不同形成的凝膠性質有顯著差異。Ji等[42]發(fā)現(xiàn)11S蛋白占比較高時形成的豆腐凝膠具有較強的硬度和內聚力。Nakamura等[37]的研究得出了相似的結論：在相同的條件下對比11S和7S蛋白形成的凝膠，發(fā)現(xiàn)11S蛋白凝膠的強度要強于7S蛋白凝膠。為探討兩種蛋白形成凝膠的差異來源，單獨加熱兩種組分，7S蛋白不會生成凝膠或只形成透明且較為柔軟的凝膠，11S蛋白則形成硬度和黏彈性較高的凝膠。通過對其結構進行對比分析發(fā)現(xiàn)，產生這種差異的原因是11S蛋白在形成凝膠的過程中形成了較多的二硫鍵[43]。

隨著研究的不斷深入，更多的實驗數(shù)據(jù)表明，在加熱過程中7S蛋白和11S蛋白的變性溫度不同，7S蛋白的變性溫度高于11S蛋白[44]。加熱凝膠化過程中向11S蛋白中加入分離的7S蛋白可防止11S蛋白及其亞基的熱聚集，而當兩種蛋白共同加熱凝膠化時，11S的B亞基和7S的β亞基通過靜電力優(yōu)先締合[45?46]。He等[47]證實了這個結論，當加熱溫度高于11S蛋白的變性溫度后，11S蛋白的AB亞基均會發(fā)生不同程度的變性解離，解離后的肽鏈B會通過靜電相互作用與7S的β亞基形成可溶性的復合物B-β，或與自身通過疏水相互作用形成致密且體積更大的聚集體，而酸性亞基A與α、α′亞基則通過二硫鍵相互作用形成寡聚體或單體（圖3）。這種聚集體B-β被認為是大豆蛋白凝膠強度較大的直接原因。王洪晶[25]的研究證實了這個結論，他發(fā)現(xiàn)可溶性的蛋白聚集體會增強蛋白凝膠的物化性質，而不溶性的蛋白聚集體則會破壞蛋白凝膠的物化性質。在凝膠過程中，蛋白亞基間的共價作用使不溶性的蛋白聚集體無法解離或充分伸展，因而阻礙凝膠的形成。

圖3 7S與11S蛋白熱處理過程中的相互作用Fig.3 7S and 11S proteins interaction in the process of heat treatment

綜上所述，11S、7S兩種蛋白組分均會對蛋白凝膠產生影響。當只有11S蛋白存在時，形成了含有較多二硫鍵的蛋白凝膠，故其凝膠硬度明顯強于只有7S蛋白存在時形成的凝膠。當兩種組分同時存在時，11S蛋白堿性亞基B與7S蛋白β亞基形成可溶性聚合物，這種聚合物以沉淀的形式聚集，而A亞基與α亞基形成的單體或寡聚體以不溶性聚合物的形式聚集在上清液中，故認為B-β聚合物會對蛋白凝膠硬度產生直接影響。隨著體系中11S蛋白組分含量的提高或7S蛋白組分含量的降低，蛋白質凝膠的物化性質隨之提高。因此選擇具有特定蛋白組分的專有大豆品種進行大豆蛋白的加工研究可能是日后大豆蛋白加工研究的新基礎。

3 內在因素對大豆蛋白凝膠的影響

3.1 蛋白濃度對大豆蛋白凝膠的影響

蛋白質在不同濃度具有不同的熱穩(wěn)定性，這種性質是蛋白濃度對凝膠產生影響的重要原因之一。Yang等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白含量與蛋白凝膠質地的硬度間具有正相關效應。Elise等[48]的研究得到類似的結論，在豆?jié){酸化形成凝膠過程中，蛋白質濃度不會對凝膠形成的pH產生影響，但會顯著影響凝膠硬度，蛋白濃度為7%的豆?jié){形成凝膠其硬度顯著強于4%形成的凝膠。這是因為隨蛋白質濃度的增加，蛋白質分子之間的距離縮短，蛋白質分子間碰撞機會增多，因而更容易發(fā)生聚集，形成更加密集的三維網絡結構。

Tian等[49]研究在相同條件下（pH7，0 mmol/L NaCl），7S蛋白的溶液濃度從0.5 mg/mL 增大到10 mg/mL，7S蛋白的凈電荷顯著增加，蛋白間的靜電斥力增大，促進7S蛋白結構的展開和重排。其次，在蛋白質濃度較高的條件下，蛋白質熱聚集體的相對分子質量更大，并且凝膠開始形成的溫度降低。Su等[3]在對大豆分離蛋白-蛋清復合凝膠進行研究時發(fā)現(xiàn)，復合凝膠的硬度、彈性和持水性會隨著蛋白質濃度的增加而增加。綜上，當?shù)鞍诐舛仍黾?，形成的凝膠具有更好的彈性和持水性，這對凝膠的性能具有積極的影響。

3.2 鹽離子濃度對大豆蛋白凝膠的影響

蛋白質溶液中加入一定濃度鹽離子后，會影響體系的pH和凝膠形成時間[50]。7S和11S蛋白的變性溫度隨著鹽濃度增加逐漸升高，影響蛋白質凝膠的形成。隨著鹽離子濃度增加，7S蛋白形成凝膠的時間延長，得率降低，但凝膠的穩(wěn)定性增加[51]。

鹽離子可促進蛋白質分子的聚集。王逢秋節(jié)等[52]發(fā)現(xiàn)添加MgCl2顯著地改變了豆腐凝膠的整體特性，形成質地均勻且致密地豆腐凝膠。Chen等[53]的研究發(fā)現(xiàn)體系中加入低濃度的鹽離子可以屏蔽蛋白質分子間的靜電斥力，內部的酸、堿性亞基暴露，蛋白質間的相互作用增強而發(fā)生聚集。Tang等[19]的研究得出了類似結論，在pH2.0，溫度為80 ℃的條件下對大豆7S蛋白體系添加NaCl，隨著NaCl濃度的增加，大豆7S蛋白的纖維數(shù)量、長度增加，對形成凝膠有積極作用。Geng等[54]證實了以上結論，通過添加鹽離子（磷酸鹽）改變蛋白體系內的離子強度，離子強度的改變引起離子的靜電屏蔽效應，改變蛋白聚集體間排斥力，有利于蛋白解離后的重聚集，促進凝膠的形成。

鹽離子濃度與大豆蛋白凝膠地形成密切相關，形成的凝膠其凝膠微觀結構以及凝膠強度等凝膠特性都與鹽離子濃度呈高度依賴性。鹽誘導形成的大豆冷凝膠制品如MgCl2鹵水豆腐等已被廣泛應用于食品領域。

3.3 其他內在因素對大豆蛋白凝膠的影響

除上述因素外，大豆組成體系中還存在脂質、多糖等物質，也會對蛋白凝膠產生不同程度的影響。脂質作為蛋白凝膠的顆粒填充物，對凝膠的質構等特性也起著重要作用。不同脂肪濃度和含量的差異，對蛋白凝膠有顯著影響。

研究表明脂質會與蛋白質聚集體之間進行相互作用，促進蛋白質凝結，增強蛋白凝膠的硬度，使其具有更緊密的蛋白網絡[55]。Dian等[56]通過向SPI中添加不同類型和濃度的脂肪制成凝膠，添加的脂肪作為填充物改善了凝膠的硬度和性能，添加無水乳脂的SPI其凝膠性能優(yōu)于添加棕櫚油硬脂和添加大豆油的SPI凝膠，當無水乳脂添加濃度為2%時最佳。李菊芳[57]將磷脂添加到大豆蛋白粉中制成凝膠，結果表明磷脂的復合對凝膠硬度、內聚性、彈性均產生重要影響。這表明脂質在一定程度上有助于大豆蛋白凝膠網絡的形成，適量的脂質會改善大豆蛋白的凝膠特性，而脂質添加量過量或不足都會造成蛋白凝膠性質的減弱。

多糖通過與蛋白質之間的相互作用來改變蛋白凝膠化行為。Zhao等[58]向SPI中添加不同種類的多糖后采用硫酸鈣誘導形成凝膠，其中添加了魔芋膠的蛋白凝膠結構最為致密，實驗發(fā)現(xiàn)魔芋膠通過增強氫鍵使蛋白凝膠的斷裂應力增強，促進膠凝形成，增強凝膠強度。Wang等[59]研究發(fā)現(xiàn)涼粉草多糖富含羥基和羧基，可以促進大豆蛋白進一步聚集，使添加了涼粉草多糖的大豆蛋白凝膠具有良好的凝膠特性及流變學特性。

4 外在因素對大豆蛋白凝膠的影響

目前學術研究上常用于蛋白加工的前處理方式有熱處理、超聲處理、高壓均質處理、擠壓預處理等物理方式，還有通過酶改性，以及菌類誘導等生物改性方法。前處理一般通過改變蛋白的二、三級結構從而使蛋白變性。

4.1 熱處理對大豆蛋白凝膠的影響

大豆蛋白的熱變性被認為是形成凝膠的先決條件。熱處理會導致大豆蛋白發(fā)生不可逆變性，內部隱藏的疏水基團暴露出來并參與疏水相互作用，蛋白二、三級結構被破壞，肽鏈展開后發(fā)生重折疊形成新的蛋白結構，這是大豆蛋白形成凝膠所必需的。

加熱溫度對大豆蛋白凝膠的影響主要是基于不同加熱溫度下，大豆蛋白具有不同的變性程度，而蛋白質變性是凝膠形成的必要條件。在加熱過程中，大豆蛋白亞基發(fā)生解離和重排。Lakshmanan[60]與Nik 等[61]均證明大豆蛋白在約60～70 ℃和85～90 ℃表現(xiàn)出兩個峰值變性溫度，分別對應7S和11S的變性溫度。Nagano等[62]研究溫度對7S和11S蛋白動態(tài)流變性質的影響，隨著加熱溫度的升高，蛋白質凝膠形成所需的時間減少，得率增加。Renkema等[63]測定了76～94 ℃內不同溫度下蛋白質的變性程度與凝膠彈性模量相關性，結果表明在變性溫度范圍內隨溫度的升高，蛋白質變性程度增大，凝膠的彈性模量也越大，硬度越強。Wu等[64]將加熱溫度從85 ℃提高到100 ℃，大豆蛋白凝膠的破碎力增加了3倍，形成了結構更堅硬的大豆蛋白凝膠。加熱時間同樣對大豆蛋白的變性具有重要影響，將加熱時間從30 min延長到120 min，凝膠的破碎力增加了三分之一，但繼續(xù)延長加熱時間凝膠的破碎力反而下降。Zhang等[18]對比其他方法變性SPI制備形成的蛋白凝膠，發(fā)現(xiàn)熱濕變性SPI形成的凝膠具有更緊密的凝膠網絡結構以及更高的表面疏水性。這表明熱變性對SPI的凝膠性是具有正效應的，熱處理是一種相對安全且有效的處理手段。

4.2 超聲預處理對大豆蛋白凝膠的影響

超聲波是一種頻率高于20000 Hz的聲波，近年來廣泛運用于食品的物理加工領域，尤其是蛋白、膳食纖維、多糖及各種食品功能成分的改性與提取中。Hu等[65]在實驗中發(fā)現(xiàn)超聲波可通過破壞非共價相互作用改變聚集體的粒徑、表面疏水性、自由巰基含量等，改變蛋白質間的二硫鍵、疏水作用力等化學作用力，從而獲得物化性質各異的大豆蛋白凝膠。王小英等[66]研究了超聲波對大豆蛋白組分的改性作用，發(fā)現(xiàn)在蛋白濃度為12.5 mg/mL時在超聲功率為700 W的條件下處理20 min，大豆蛋白的NSI（nitrogen solubility index，NSI）值提高為原來的5.9倍。超聲處理后的大分子組分明顯增多，小分子組分降低，使蛋白質發(fā)生聚集行為。Zhao等[67]在研究中證實了蛋白質的聚集行為，超聲-熱處理使大豆蛋白的平均粒徑減小，表面疏水性和游離巰基含量均增加，改變了SPI的二、三級結構，具體表現(xiàn)為SPI中的α-螺旋和β-折疊有序結構增多，微觀結構比未超聲處理的SPI凝膠更加致密，形成了結構均勻、致密的改性蛋白凝膠。

Tian等[68]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理不僅可以提高SPI凝膠的生成速度，還增強了凝膠的儲能模量、凝膠強度和持水性。研究中發(fā)現(xiàn)超聲處理會破壞蛋白體系中的非共價相互作用，導致肽鍵斷裂，從而引起結構改變，暴露其中的作用位點，達到促進凝膠點快速形成，加速凝膠形成的效果。Huang等[69]的研究發(fā)現(xiàn)超聲通過空化效應產生的剪切力能有效減小蛋白聚集體的尺寸，使較大的蛋白聚集體解離成初級聚集體，大豆蛋白的二、三級結構發(fā)生改變。Ogemdi等[70]證實了這個觀點，認為較長時間的高強度超聲（High Intensity Ultrasound, HIU）處理，其超聲空化效應只改變SPI的二、三級結構，增強蛋白溶解性和表面疏水性，提高凝膠性能，但并不會影響蛋白質氨基酸的組成，因此超聲后的大豆蛋白被認為是更適用于應用的食品成分。

但超聲處理也會對SPI凝膠產生負面作用。劉冉等[71]采用不同功率的超聲波對SPI凝膠進行處理發(fā)現(xiàn)，低功率的超聲波會減弱SPI凝膠的形成能力；高功率的超聲波會使SPI發(fā)生降解，影響蛋白質分子間的交聯(lián)，延遲凝膠的形成時間；只有中功率（200～600 W）的超聲波處理通過改變SPI的黏彈結構，使SPI發(fā)生更為有序的交聯(lián)作用，能明顯提高SPI的凝膠性能。

4.3 高壓均質預處理對大豆蛋白凝膠的影響

高壓均質（High-pressure homogenization，HPH）處理具有高剪切力、高壓力作用，可以改變蛋白質原有的剛性二級結構。適度改變蛋白間的相互作用力，可改變蛋白的空間構象，是一種安全、有效的物理方法。呂博等[72]研究表明，經高壓均質處理，隨均質壓力的上升（0～40 MPa），大豆分離蛋白內部疏水基團暴露，展開的多肽鏈里暴露的官能團經疏水相互作用聚集形成致密的三維凝膠網絡結構，其凝膠特性和溶解性均得到了顯著改善。

Wang等[73]發(fā)現(xiàn)，隨著高壓均質壓力上升為200 MPa時，大豆蛋白的游離巰基含量顯著增加，隨著壓力進一步上升，游離巰基含量降低，破壞了蛋白質分子間的疏水性結構區(qū)域，改變了分子間的作用力平衡，使蛋白大分子熱聚集體轉為小分子的聚集體，熱致凝膠的凝膠性能下降。同樣的，Kang等[74]的研究中發(fā)現(xiàn)，高壓均質會導致大豆蛋白變性，其中它們的解離締合行為會引起大豆球蛋白中7S/11S組分的變化。Bi等[75]研究了均質壓力對大豆蛋白凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)高壓均質能夠增加SPI中凝膠形成的活性位點，提高SPI的凝膠形成能力，縮短SPI酸誘導凝膠的形成時間。

因此可以發(fā)現(xiàn)，高壓均質是通過高剪切、高壓改變蛋白聚集體二、三級結構和蛋白分子構象使蛋白變性，經高壓均質處理會縮短SPI形成凝膠的時間，同時也會增強蛋白凝膠的凝膠特性，使其具有更強的粘彈性、持水性和凝膠強度，形成結構更為致密均勻的凝膠。

4.4 擠壓預處理對大豆蛋白凝膠的影響

除以上物理方法外，擠壓也是常用的大豆蛋白物理改性方法之一，廣泛應用于食品加工中。擠壓技術是通過在擠壓過程中熱效應產生的高溫、高壓和高剪切力破壞大豆蛋白的天然結構，暴露出分子內部的疏水基團，在疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等的共同作用下形成分子量較大的蛋白質聚集體。

隨著擠壓加工溫度的升高，蛋白質的溶解性變差[76]。Silva等[77]發(fā)現(xiàn)在擠壓過程中游離巰基和總巰基含量增加，而二硫鍵含量下降。Fang等[78]研究了高濕環(huán)境下大豆蛋白擠壓技術，發(fā)現(xiàn)在該環(huán)境下擠壓，由于機械能的增加，由二硫鍵等化學鍵鏈接的聚合體解聚會導致大豆蛋白分子鏈伸展，蛋白溶解性增加。但Zheng等[79]發(fā)現(xiàn)，雖然高溫、高剪切的環(huán)境能改變蛋白的溶解度及分子量分布，但過高的螺桿轉速和溫度（高于150 ℃）會破壞已形成的蛋白聚集體結構，導致蛋白再次展開。

由于擠壓使蛋白內部埋藏的酶切位點暴露，有利于酶進行反應，因此擠壓技術也常作為前處理手段與酶法相結合對蛋白凝膠進行改性。Ma等[80]發(fā)現(xiàn)擠壓-酶解處理能顯著改善大豆蛋白的空間結構和功能性質。在我們之前的研究中也將擠壓技術與酶解法相結合研究大豆分離蛋白的功能性質，發(fā)現(xiàn)擠壓處理后進行酶水解，對大豆分離蛋白的結構性質具有積極影響[81]。這些結果表明擠壓技術可以作為一種有效的蛋白改性手段應用于食品工業(yè)中。

4.5 酶法對大豆蛋白凝膠的影響

傳統(tǒng)的“堿溶酸沉”法制備SPI通常因為加工過程及工藝參數(shù)的差異，導致SPI發(fā)生變性，其凝膠性質受到不同程度的破壞，所以通常對SPI進行改性。酶法修飾SPI與其他物理、化學改性方法相比較，具有高安全性、高專一性及作用方式溫和的特點，是近幾年的研究熱點。酶法修飾大豆蛋白是通過限制性水解肽鍵，改變蛋白質二、三級結構，使分子量顯著降低，其內部的官能團暴露量增加，提供更多的反應位點，催化凝膠形成的過程[82]。

4.5.1 TG酶 轉谷氨酰胺酶（Transglutaminase，簡稱TG酶或TGase）是一種催化?；D移反應的轉移酶，其催化作用可以明顯改善凝膠強度、保水能力以及流變性，同時反應條件溫和、反應速度快、生成的凝膠產物具有更復雜穩(wěn)定且不可逆的凝膠結構，有關學者關于TG酶對SPI凝膠的影響研究也最為廣泛和深入。TG酶影響SPI凝膠性是通過催化蛋白質的多肽發(fā)生分子間或分子內的共價交聯(lián)作用，形成高分子的聚合物來改變蛋白質的疏水性，從而形成結構致密的凝膠[83]。TG酶的作用機理具體可分為氨基導入交聯(lián)、共價交聯(lián)作用以及脫酰氨基反應三類[84?85]，其中氨基導入交聯(lián)是TG酶途徑糖基化的反應作用原理；共價交聯(lián)作用形成高分子聚合物改變SPI的溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性等性質；脫酰氨基反應則是改變蛋白的疏水相互作用從而改變蛋白凝膠性[86]。

Qin等[87]進一步研究發(fā)現(xiàn)TG酶作用后，可以誘導分子間二硫鍵的形成，蛋白質的無規(guī)卷曲增多，折疊結構打開，同時改變了蛋白凝膠的流變性。Zhang等[88]報告在雞蛋-大豆分離蛋白復合凝膠中，TG酶的主要作用是使復合凝膠中的SPI發(fā)生交聯(lián)化，顯著提高復合凝膠的凝膠硬度。但TG酶對蛋白凝膠的影響并不全是積極的。Luo等[89]的研究中指出，TG酶前處理顯著影響大豆分離蛋白的凝膠化行為，且高度依賴于凝膠反應過程中TG酶的酶濃度。低濃度（1或3 U/蛋白質）的TG酶前處理能增強SPI凝膠硬度，但高濃度（5 U/蛋白質）TG酶前處理會導致蛋白質過度交聯(lián)，形成粗糙的凝膠結構，破壞凝膠強度。

綜上，TG酶法是一種高效、綠色的蛋白質改性法。添加適量的TG酶可以促使蛋白質進一步交聯(lián)形成具有更高硬度的凝膠。目前TG酶法改性現(xiàn)已廣泛應用于改善多種食物蛋白凝膠的功能特性和質構特性中。

4.5.2 其他蛋白酶 除TG酶外，還有其他蛋白酶都對SPI凝膠有改性作用，如堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。酶改性蛋白的功能特性與蛋白酶種類呈強烈相關性。在之前的研究中采用堿性蛋白酶對SPI進行酶解，在酶解后SPI水解成小分子肽，形成多肽聚集體，其柔韌性和乳化性得到改善[81]。Tian等[68]選取堿性蛋白酶進行酶解，得到了類似的結論，這表明堿性蛋白酶與蛋白乳化性相關程度更高，會抑制蛋白的凝膠行為。趙新淮等[90]將SPI分別經胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解后，對比發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶處理后的SPI凝膠性得到顯著改善，原因是中性蛋白酶的催化反應位點比胰蛋白酶多，水解程度較大，降低了蛋白質-蛋白質間的相互作用，故形成的凝膠較弱。余留印[91]的研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶酶解處理SPI可以有效降低蛋白質的分子量，適度的酶促水解可使蛋白分子內部的非極性氨基酸殘基暴露，增強蛋白分子間的疏水相互作用，改善凝膠結構。

4.6 微生物因素對大豆蛋白凝膠的影響

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)在乳酸菌發(fā)酵過程中經過酸化、蛋白質水解、風味形成以及代謝產物的生產過程，該過程中能夠形成乳酸，可降低體系的pH，從而促使蛋白質變性加快，聚集形成凝膠。Yang等[92]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵誘導SPI形成凝膠能夠顯著提高了大豆蛋白凝膠的硬度和保水能力，且凝膠特性對發(fā)酵所用的乳酸菌具有依賴性，不同乳酸菌誘導的SPI凝膠具有各自的特殊性。微生物的接種量同樣也會影響凝膠的性質。李良等[93]通過植物乳桿菌發(fā)酵制備蛋白凝膠，發(fā)現(xiàn)接種量2%～4%時，蛋白凝膠強度隨接種量的增加而增強；接種量4%～6%時，凝膠強度無顯著差異；接種量大于6%時蛋白凝膠強度反而降低。這是由于乳酸菌接種量少時，微生物的產酸能力弱，形成凝膠所需的時間較長；而當接種量過高時，會影響蛋白質之間的聚集，凝膠性降低。

5 總結及展望

近幾十年，國內外學者對大豆分離蛋白分子結構及凝膠特性進行了廣泛而深入的研究。大豆蛋白凝膠的形成是一個復雜的過程，受到許多因素共同影響。由于天然大豆蛋白聚集體結構無規(guī)則，二硫鍵含量低，因此其凝膠特性較差，在凝膠食品中的發(fā)展與應用一直受到制約。目前可通過物理、化學、生物等手段使天然大豆蛋白結構展開，內部疏水基團暴露，表面疏水性增加，蛋白與蛋白間的非共價相互作用增強，而非共價相互作用是凝膠網絡的“骨架”，因此凝膠性得以提高。但從內在因素角度分析，大豆蛋白組分（7S、11S）差異對凝膠特性的研究尚未深入，蛋白質亞基對功能特性的表達機制尚不明晰。在今后的研究中，可在基于擠壓、酶解、超聲等物化改良手段上，將提高蛋白凝膠性與大豆蛋白組分差異性聯(lián)系起來，并對其機理進一步深入研究后，轉向應用研究，選擇性培育具有特定蛋白質亞基組成的大豆品種并進行相關功能性研究，進而制備具有高凝膠性的大豆蛋白凝膠產品。