遲 杰，羅 潔，譚明霞，童銀棟

（天津大環(huán)境科學與工程學院，天津 300072）

隨著塑料制品的大量使用，產(chǎn)生的塑料廢棄物在土壤中不斷積累.截至2015年，全球64億噸的塑料垃圾有大約 79%積累在陸地垃圾填埋場或自然環(huán)境[1].其中，長期殘留于土壤環(huán)境中的塑料薄膜會在各種環(huán)境因子和生物作用下逐漸老化破碎形成粒徑小于5mm的微塑料，最終導致薄膜源的微塑料逐漸在土壤中蓄積[2].此外，用來改善土壤肥力的污水污泥再利用是土壤微塑料的主要來源.由于具有粒徑小、比表面積大的特點，微塑料對有機污染物具有較強的吸附作用[3].被吸附的污染物可隨微塑料進入食物鏈，對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在影響.微塑料還會改變土壤理化性質(如孔隙度、團粒結構等)或成為土壤團聚體的一部分，進而改變微生物活性[4].這些變化都將影響土壤中有機污染物的遷移轉化行為.

蚯蚓作為土壤中普遍存在的動物，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的肥力、代謝、結構與功能的維持方面發(fā)揮著重要作用，已被廣泛用于評價土壤中污染物的生物有效性和生態(tài)風險.蚯蚓的活動還可以促進微塑料在土壤內(nèi)的移動，使微塑料與土壤的接觸更充分，有助于微塑料對污染物的吸附[5].同時，蚯蚓可以吞食吸附污染物的微塑料，使其體內(nèi)濃度發(fā)生改變.因此，研究土壤中污染物的消減對蚯蚓和微塑料共存的響應機制具有重要意義.

阿特拉津是一種有機氯農(nóng)藥.自投入商業(yè)生產(chǎn)以來，在世界范圍內(nèi)得到了大面積的推廣和使用.近年來，阿特拉津在污染地區(qū)被普遍檢測出[6-7].有研究表明，無論是陸地動物還是水中的魚類甚至是人類，長期接觸阿特拉津都會有致癌的風險[7].與新制微塑料相比，老化后微塑料表面出現(xiàn)裂縫，孔容和比表面積增大，表面含氧官能團增加，致使微塑料吸附污染物的能力發(fā)生改變[8].為此，筆者選取了新制和老化聚乙烯(PE和 APE)，研究了它們對阿特拉津的吸附特性，并考察了有無蚯蚓情況下微塑料對土壤和孔隙水中阿特拉津濃度以及菌群結構的影響.在此基礎上，探究了這兩種微塑料對土壤中阿特拉津消減的影響機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

聚乙烯(PE)微塑料購于東莞市中誠塑膠原料經(jīng)營部(粒徑范圍 0.106～0.180mm).甲醇浸泡、干燥后備用.將清洗后的 PE微塑料置于培養(yǎng)皿中，加入50mL的H2O2(體積分數(shù)18%)，蓋上石英玻璃片，暴露于紫外線下300h[9].期間每24h搖勻1次并及時補充溶液.取出微塑料，清洗、干燥后過篩，得到粒徑范圍0.106～0.180mm的老化微塑料(APE).

表層土壤(0～10cm)采自天津市津南區(qū)(北緯38°58′59″，東經(jīng) 117°20′59″).風干、過 2mm 篩后，取1/6質量實驗土壤，加入阿特拉津的丙酮溶液.待丙酮揮發(fā)，用余下的 5/6未染毒土壤與已染毒土壤混合，過 3次 2mm 篩后得到染毒土壤(阿特拉津濃度＝10.01mg/kg).土壤基本理化性質：pH值為8.62，有機質含量為 1.54%，機械組成為 7.23%砂粒/56.72%粉粒/36.05%黏粒.

實驗采用威廉環(huán)毛蚓(Pheretimaguillelmi).使用前，將蚯蚓放到未染毒的土壤(含水率為 65%)中馴養(yǎng) 7～14d.期間保持溫度((20±3)℃)和透氣.馴養(yǎng)結束后，選擇成年(有明顯生殖環(huán))的蚯蚓進行清腸處理，稱重后備用.

1.2 實驗設計

1.2.1 吸附實驗

分別稱取 5mg的 PE或 APE到 40mL的Agilent瓶中.加入 40mL不同初始濃度的阿特拉津溶液(1000～14000μg/L；為避免溶劑效應，引入甲醇的體積分數(shù)不超過0.1%)，蓋上蓋子，置于25℃恒溫搖床上以 150r/min的速度、避光條件下振蕩 48h使吸附達平衡(吸附動力學預實驗結果顯示這兩種微塑料吸附阿特拉津到達平衡時間為 36h).取出樣品瓶，靜置 30min.將樣品瓶中溶液轉移至玻璃離心管中在 4000r/min下離心 20min，取出上清液，用高效液相色譜儀測定阿特拉津的濃度.所有實驗做 3個平行.

1.2.2 降解實驗

分別設置5個有蚯蚓和無蚯蚓的處理組，包括土壤(CK)、添加 0.2%(0.2%PE和 0.2%APE)和 2%微塑料的土壤(2%PE和 2%APE).同時設置相應的滅菌處理組(添加0.2% HgCl2，質量比).每個處理組3個平行.向一系列 500mL玻璃燒杯中加入 200g不含或含有微塑料的染毒土壤.充分混勻后，加去離子水使土壤飽和含水率為 65%.另外，在蚯蚓處理組中向每個燒杯加入5條健康的蚯蚓，再用紗布覆蓋燒杯口以防止蚯蚓逃逸.將所有燒杯放在培養(yǎng)箱中，控制溫度為(25±1)℃，定期補水以控制含水率.實驗共運行28d.

采集實驗初始和結束的土壤樣品，分為 3份.一份土壤樣品用于測定孔隙水中污染物濃度；另外兩份土壤樣品冷凍干燥 24h后，一份用于測定土壤菌群結構，另一份研磨過 80目篩后用于測定阿特拉津濃度.此外，實驗結束時從蚯蚓處理組中取出蚯蚓，然后用去離子水洗凈并做清腸處理，然后冷凍干燥，用于測定蚯蚓體內(nèi)阿特拉津濃度.

1.3 分析方法

1.3.1 微塑料的表征

采用紅外光譜儀測定PE和APE微塑料樣品的表面官能團.根據(jù)紅外光譜結果計算微塑料的羰基指數(shù)(CI).CI是羰基帶最大吸光度與參考帶的比值[10]，計算公式為

1.3.2 水相阿特拉津的測定和吸附等溫線模型

采用高效液相色譜(紫外檢測器)測定吸附實驗上清液和土壤孔隙水中阿特拉津的濃度.色譜柱為C18(4.6mm×150mm)，柱溫 30℃，流動相為 95%的甲醇溶液，流速為 0.5mL/min，進樣量為 10μL.樣品出峰時間約為6min.

用 Freundlich模型擬合阿特拉津在微塑料上的吸附行為.模型公式為

式中：Ce為吸附質的平衡濃度，μg/L；Qe為平衡時的吸附量，μg/kg；Kf是吸附能力系數(shù)，；N表示點能量不均勻因子，可以反映特定吸附過程中能量的大小和變化，通常用來表示非線性的程度.

1.3.3 土壤中阿特拉津的測定

采用超聲法提取土壤中阿特拉津[11].簡而言之，稱取過篩后的土壤樣品于安捷倫瓶中，加入正己烷與丙酮的混合液(1∶1，體積比).超聲、離心后，將上清液轉移至K-D濃縮管.重復操作3次，合并濾液.濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)至近干后轉移至硅膠柱凈化.將收集的洗脫液氮吹至近干后定容，用 GC-MS測定阿特拉津的濃度.氣相色譜柱的升溫程序如下：初始溫度100℃，以20℃/min升溫至280℃，保持2min，共運行 9min；不分流進樣；檢測器與進樣口的溫度均為250℃；接口溫度為280℃.質譜四級桿溫度為150℃，離子源溫度為 230℃，EI源為 70eV，氦氣流量為1.0mL/min.土壤中阿特拉津回收率為 87.8%～90.0%.

1.3.4 蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的測定

將冷凍干燥后的蚯蚓在研缽中磨碎.將蚯蚓粉末置于 50mL離心管中，加入 20mL丙酮超聲萃取30min后于搖床上以 200r/min速度振蕩 30min.取出離心管，于4000r/min速度下離心30min.吸出萃取液至K-D濃縮管中.重復上述步驟3次，合并萃取液.后續(xù)步驟和GC-MS條件同第1.3.3節(jié).

1.3.5 土壤菌群結構

土壤樣品中菌群結構和多樣性分析，以 16s rDNA V3-V4區(qū)測序結果為數(shù)據(jù)基礎.土壤DNA經(jīng)提取、擴增和凈化后進行文庫構建和上機測序[12].

1.3.6 統(tǒng)計分析

使用 Excel 2010進行數(shù)據(jù)計算與列表；使用Origin 9.0作圖.用 SPSS 25.0對不同指標間進行Pearson相關性分析(α＝0.05).

2 結果與討論

2.1 微塑料的表征

圖1為兩種微塑料的紅外光譜圖.可見，PE在2920cm-1、2850cm-1、1467cm-1、1375cm-1和721cm-1處出現(xiàn)了聚乙烯的亞甲基振動峰[13].除了上述特征峰，APE還在1720cm-1處出現(xiàn)了羰基拉伸振動峰，在 1610cm-1處出現(xiàn)了芳環(huán) C＝C或酮、醛類以及羧化物的 C＝O伸縮振動峰[12].通常 1610cm-1處的振動峰作為1720cm-1處峰的肩峰同時出現(xiàn).

圖1 PE和APE的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of PE and APE

已有的研究指出，聚合物在老化過程中形成了多種不同的化學基團，主要包括羰基(1690～1810cm-1，集中在 1715cm-1)和羥基(3100～3700cm-1，集中在 3300～3400cm-1).其中，羰基吸收帶位置穩(wěn)定，強度高，無干擾帶，是跟蹤光解過程的理想指示物[14].本研究中，老化后羰基的變化最明顯，與文獻[15-16]結果一致.根據(jù)式(1)計算得到，老化后PE的CI值從0.04升至0.27.這說明老化后PE的表面極性增加.

2.2 微塑料對阿特拉津的吸附

圖2為兩種微塑料吸附阿特拉津等溫線.吸附等溫線與 Freundlich模型吻合良好(R2＝0.96～0.97).PE和APE吸附阿特拉津等溫線的N值分別為 0.89和 0.85，接近 1，說明老化前后 PE對阿特拉津的吸附均由分配作用主導.這與文獻[17]報道結果一致.

圖2 PE和APE對阿特拉津的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherms of atrazine to PE and APE

從吸附能力看，APE的 lgKf值(1.29)略高于PE(1.27).本研究的 FT-IR結果顯示，老化后 PE的CI值增大，表面極性增加.阿特拉津屬于極性化合物.老化后微塑料表面極性的增大是影響阿特拉津在微塑料上吸附量的主要原因.這與 Gao等[18]的研究結果一致.

2.3 土壤菌群結構

有蚯蚓和無蚯蚓土壤樣品中細菌多樣性結果如表1所示.可見，添加微塑料分別使無蚯蚓和有蚯蚓土壤OTUs降低了 7.2%～22.6%和 10.6%～21.1%；蚯蚓的存在使 OTUs下降了 27.9%～39.4%.多樣性指數(shù)(Shannon與Simpson)的變化趨勢與OTUs基本一致.這些數(shù)據(jù)說明蚯蚓的存在和微塑料的添加都會改變土壤菌群的多樣性.

表1 土壤樣品中細菌的多樣性Tab.1 Bacterial diversity in soil samples

從相對豐度前20的菌屬中檢出了7個具有降解阿特拉津能力的菌屬(見表2)，包括 Aeromonas、Bacillus、Rhodococcus、Nocardioides、Shewanella、Sphingomonas和Arthrobacter[6-7,19].有蚯蚓土壤中優(yōu)勢阿特拉津降解菌的相對豐度之和(13.0%～25.1%)是無蚯蚓土壤中(8.7%～12.1%)的 1.1～2.7倍，這與Aeromonas相對豐度顯著增加有關.據(jù)報道，Aeromonas是蚯蚓糞便中的優(yōu)勢菌屬，其最高占比可達 39%[6].此外，無蚯蚓情況下，添加微塑料使土壤中阿特拉津降解菌相對豐度之和降低了 4.0%～17.8%.有蚯蚓情況則相反，添加微塑料使優(yōu)勢降解菌相對豐度之和增加了 39.9%～92.7%.這是因為添加微塑料可能會刺激蚯蚓產(chǎn)生更多的腸道黏液，對土壤菌群豐度的增加產(chǎn)生積極的影響[5].

表2 土壤樣品中阿特拉津降解菌豐度Tab.2 Abundance of atrazine-degrading bacteria in soil samples

2.4 微塑料對土壤孔隙水中阿特拉津濃度的影響

已有的研究認為，吸附到土壤或沉積物上的污染物只有解吸下來才能被微生物利用[12].因此本文通過測定土壤孔隙水中阿特拉津濃度的變化，探討老化前后 PE微塑料對土壤中阿特拉津生物可利用性的影響.從圖3數(shù)據(jù)可見，實驗期間無蚯蚓和有蚯蚓土壤孔隙水中阿特拉津的濃度均隨時間大幅下降.而且有蚯蚓處理組的降幅(86.0%～87.3%)顯著高于無蚯蚓處理組(56.8%～65.9%).這是因為蚯蚓的存在提高了降解菌的數(shù)量(見第 2.3節(jié))，加速了阿特拉津的降解.蚯蚓吸收也起一定作用.

圖3 實驗期間有無蚯蚓土壤孔隙水中阿特拉津的濃度Fig.3 Atrazine concentrations in porewater of soils with or without earthworms during the experiment

此外，孔隙水中阿特拉津濃度下降的幅度還隨著微塑料添加量的增加而增大.將實驗初始孔隙水中阿特拉津濃度與兩種微塑料的 lgKf值做相關性分析，結果顯示兩者之間顯著負相關(0.2%添加量：r＝－0.928，n＝9，p＝0.002；2%添加量：r＝－0.983，n＝9，p＝0.000).這說明微塑料吸附能力越強，對土壤中阿特拉津的固定作用越大，從而降低了土壤中阿特拉津的生物可利用性.

2.5 微塑料對土壤中阿特拉津消減的影響與機制

滅菌實驗結果顯示(圖4(a))，實驗期間各處理組土壤中阿特拉津濃度顯著變化(p＜0.05).其中，對照組土壤中阿特拉津的消減率(38.0%)顯著高于微塑料添加組(15.7%～25.8%)，說明非生物過程在阿特拉津消減中的作用不可忽視.由于滅菌實驗是在黑暗環(huán)境中進行的，排除了光解作用.可以認為，阿特拉津的消減是因化學水解所致，這與文獻[20]報道一致.

圖4(b)和(c)為實驗結束時未滅菌土壤中阿特拉津的殘留濃度和消減率.可見，無蚯蚓和有蚯蚓土壤中阿特拉津的濃度均顯著下降(p＜0.05).其中，對照組的降幅最小；微塑料的添加量越高降幅越大.與之對應的土壤中阿特拉津的消減率分別為 28.2%～54.5%和 42.1%～67.8%，顯著高于滅菌實驗，說明土壤中阿特拉津的消減途徑還包括微生物降解.這是由于相比于滅菌土壤，未滅菌土壤中阿特拉津降解菌(見第 2.3節(jié))中含有多種降解基因，參與調(diào)控了阿特拉津的脫氯、脫烷基、水解和開環(huán)過程，使其生成羥基阿特拉津、脫乙基阿特拉津、脫異丙基阿特拉津、脫異丙基羥基阿特拉津等一系列代謝產(chǎn)物[21].比如，Arthrobacter攜帶的atrB、atrC和trzN基因可以將阿特拉津轉化為毒性較低的氰尿酸[22]；再者，Rhodococcus也能通過 atrA基因有效降解阿特拉津生產(chǎn)脫烷基代謝產(chǎn)物[23]，通過兩種或多種降解菌的共代謝，阿特拉津最終完全降解為CO2和NH3.所以，土壤中阿特拉津降解菌的存在可以加速阿特拉津的降解.

圖4 實驗結束時土壤中阿特拉津濃度（柱）和消減率（線）Fig.4 Concentrations （column） and dissipation rates（line） of atrazine in the soil at the end of the experiment

但是，在有蚯蚓土壤中阿特拉津在蚯蚓體內(nèi)的富集也是潛在的消減途徑.實驗期間各處理組蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的濃度如圖5所示.可見，蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的濃度在1.48～2.94mg/kg之間.微塑料的加入顯著降低了蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的濃度；隨著微塑料添加量的增大蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的濃度下降(p＜0.05)，這與前人研究結果一致[24].蚯蚓對阿特拉津的富集主要包括兩個途徑：通過表皮吸收孔隙水中的阿特拉津，或者通過吞食含有阿特拉津的土壤.添加微塑料不僅降低了孔隙水中阿特拉津的濃度(見第2.4節(jié))，還能抑制被吞食土壤中阿特拉津的解吸.此外，由于被蚯蚓攝食的微塑料在其腸道停滯時間較短，無法使微塑料吸附的阿特拉津與腸液之間達到解吸平衡，也會導致蚯蚓富集阿特拉津量的較少[25].根據(jù)蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的濃度計算，蚯蚓富集對土壤中阿特拉津消減率增幅的貢獻很小(＜0.3%)，可以忽略不計.

圖5 蚯蚓體內(nèi)阿特拉津的富集濃度Fig.5 Concentrations of atrazine in earthworms

從圖4(b)和(c)中還可以看出，蚯蚓的存在使各處理組土壤中阿特拉津的消減率顯著提升(p＜0.05，增幅為 24.5%～49.4%)，并且消減率增幅的順序為2%APE組＞0.2APE組＞2%PE組＞0.2%PE組＞對照組.這說明蚯蚓可以顯著加速土壤中阿特拉津的消減，而且微塑料老化和添加量對阿特拉津的消減也起重要作用.同樣地，Lin等[26]的研究表明蚯蚓的添加顯著促進了土壤中有機污染物的去除.這與蚯蚓的擾動增加了降解菌的數(shù)量，從而促進了有機污染物的微生物降解有關[27].進一步的相關性結果顯示，無論蚯蚓是否存在，土壤中阿特拉津的消減率與實驗初始孔隙水阿特拉津的濃度均顯著正相關(無蚯蚓：r＝0.973，n＝21，p＝0.000；有蚯蚓：r＝0.967，n＝21，p＝0.000).根據(jù)前面的分析可知，土壤中阿特拉津的消減不僅包括化學水解，還包括微生物降解，因此孔隙水中阿特拉津是其消減的主要來源.

根據(jù)物料守恒分別計算了無蚯蚓和有蚯蚓土壤中化學水解和生物降解對阿特拉津消減的貢獻(圖6).可見，無蚯蚓土壤中阿特拉津的生物降解的占比＜化學水解的占比(0.2%PE處理組除外，為生物降解的占比＞化學水解的占比).相反，有蚯蚓土壤中生物降解的占比＞化學水解的占比.蚯蚓的存在使土壤中阿特拉津生物降解的占比提高了 26.7%～52.2% (p＜0.05).這是因為蚯蚓的存在大幅提高了土壤降解菌的相對豐度(見第 2.3節(jié))，促進了阿特拉津的微生物降解.這也是蚯蚓加速土壤中阿特拉津消減的主要原因.

圖6 實驗結束時無蚯蚓和有蚯蚓土壤中阿特拉津的物料守恒Fig.6 Mass balances of atrazine in soil with and without earthworms at the end of the experiment

3 結 論

(1) 新制和老化 PE微塑料吸附阿特拉津的等溫線符合 Freundlich模型(R2＝0.96～0.97).老化后PE的吸附能力(lgKf)略有增強，與PE微塑料表面極性變化有關.

(2) 蚯蚓的存在和微塑料的添加均會影響土壤菌群結構.其中，蚯蚓是影響土壤菌群結構的主控因素.從土壤中檢出 7個具有降解阿特拉津能力的優(yōu)勢菌屬，包括 Rhodococcus、Sphingomonas、Aeromonas、Bacillus、Nocardioides、Shewanella 和Arthrobacter.蚯蚓的存在顯著增加了土壤中優(yōu)勢阿特拉津降解菌的相對豐度.無蚯蚓土壤中添加微塑料降低了優(yōu)勢阿特拉津降解菌的相對豐度，而有蚯蚓土壤中剛好相反.

(3) 蚯蚓的存在可以顯著加速土壤中阿特拉津的消減，而且微塑料的老化和添加量對阿特拉津消減率的變化也起重要作用.物料守恒結果顯示，化學水解和生物降解是土壤中阿特拉津消減的主要途徑.無蚯蚓土壤中阿特拉津生物降解的占比＜化學水解的占比(0.2%PE處理組除外).有蚯蚓土壤中則相反.蚯蚓通過提高土壤降解菌的相對豐度顯著提升了微生物降解的比例.這也是蚯蚓加速土壤中阿特拉津消減的主要原因.