李夢嬌 石洪爽 王 威 武 昕 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110000）

外陰鱗狀細(xì)胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC）是女性生殖道惡性腫瘤之一，約占外陰惡性腫瘤的90%，好發(fā)于老年女性［1］。近年來，一些流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)這種腫瘤的發(fā)生有年輕化趨勢，且與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關(guān)，主要為HPV16、18和33 型，HPV 的E6、E7 基因與宿主的P53 和RB 基因結(jié)合，導(dǎo)致宿主基因失活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［2］。因此，腫瘤免疫微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展。淫羊藿屬草本植物，在中醫(yī)應(yīng)用中已有數(shù)千年歷史。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿提取物中的主要成分，為黃酮類化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)ICA具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)心肌干細(xì)胞分化、預(yù)防類固醇相關(guān)骨壞死的作用［3-5］。近年來，ICA 在改善免疫功能、抗腫瘤方面的作用備受關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)ICA 可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，起到局部抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用［6-8］。同時發(fā)現(xiàn)ICA 通過一些信號通路抑制癌基因表達(dá)，起到抗腫瘤作用，如女性的子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌和卵巢癌，但在女性外陰癌中尚未有相關(guān)報道［9-11］。

本研究在體外利用細(xì)胞系研究ICA 是否對VSCC 增殖有抑制作用，并從有絲分裂災(zāi)變的角度探討ICA 抑制腫瘤生長的可能機(jī)制，為后續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ICA（20 mg，純度HPLC：98.53%）購自中國科學(xué)院成都生物研究所；VSCC 細(xì)胞系SW962購自浙江如耀生物科技有限公司；Vimentin 抗體、Chk1（Ser345）抗體、CDC25C 抗體（貨號：A19607、AP0578、A12234，ABclonal）；α-tubulin（貨號：A01080，Abbkine）；cyclin B1 抗體（貨號：12231，CST）；CDK1抗體（貨號：13127，SAB）；GAPDH（貨號：sc-25778，Santa Cruz）；caspase-3 抗體（貨號：ER30804，華安生物科技有限公司）；cleaved caspase-3（貨號：ab49822，Abcam）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich）；碘化丙啶（PI，采用PBS 配制成2 mg/ml 母液，4 ℃保存）、DAPI（甲醇溶解，配制成1 mg/ml母液，-20 ℃避光保存）、抗熒光淬滅劑（索萊寶試劑公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，CAS號：298-93-1，Amersco）；光學(xué)顯微鏡（DM500，Leica）；流式細(xì)胞儀（Life Attune，ABI）；FlowJo V10（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW962 使用含10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml） 和鏈霉素（100 μg/ml）的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測 在96孔板中接種SW962細(xì)胞（2 000 個/孔），同時在孔板底部放置蓋玻片，進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、200、400、800 μmol/L的ICA 37 ℃處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 時 滴 加10 μl MTT（5 mg/ml 溶于PBS）加入各孔中，并在37 ℃孵育持續(xù)4 h。除去培養(yǎng)基，將150 μl DMSO 加至各孔，振蕩5 min。使用酶標(biāo)儀在570 nm 處測量吸光度。每個濃度在每個時間點(diǎn)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3 HE 染色 在6 孔板中接種SW962 細(xì)胞 （2×105個/孔），同時在孔板底部放置蓋玻片，進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、200、400、800 μmol/L 的ICA 處理36 h。取出細(xì)胞爬片，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗后進(jìn)行蘇木精和伊紅染色。95%乙醇脫水烘干后，二甲苯透明，滴加中性樹膠進(jìn)行封片，通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，OPLENIC系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。

1.2.4 DAPI 染色 SW962 細(xì)胞在6 孔板中進(jìn)行爬片后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、200、400、800 μmol/L 的ICA 處理36 h。棄去培養(yǎng)基，滴加 1 ml 4%多聚甲醛，室溫固定20 min。0.3%Triton X-100 孵育10 min 進(jìn)行細(xì)胞破膜，PBS 清洗3 次，每次5 min。采用1 μg/ml DAPI（終濃度）對細(xì)胞核染色10 min。使用熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.5 免疫熒光 SW962 細(xì)胞進(jìn)行爬片后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、200、400、800 μmol/L的ICA處理36 h。滴加4%多聚甲醛，冰上固定20 min。采用0.3%Triton X-100 孵育10 min 進(jìn)行細(xì)胞破膜，1%BSA 室溫下封閉處理30 min。滴加兔抗人 Vimentin 和α-tubulin 抗體（1∶50）在4 ℃的濕室中孵育過夜。再采用羊抗兔IgG-FITC 488 nm 抗體（1∶100）在室溫黑暗中孵育1 h。采用1 μg/ml DAPI 對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，滴加抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片。使用熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測 收集0、200、400、800 μmol/L的ICA 處理36 h 的SW962 細(xì)胞（5×105個）。加入預(yù)冷PBS 洗滌2 次后500 g 離心。滴加300 μl PBS 重懸細(xì)胞。在渦輪振蕩器下緩慢滴加700 μl無水乙醇（-20 ℃預(yù)冷）。4 ℃固定細(xì)胞1 h，500 g 離心5 min后，去上清。預(yù)冷PBS清洗2次后，加入0.5 ml 染色液（2 mg/ml PI 10 μl，50 mg/ml RNase 1 μl，1×BD buffer 489 μl）室溫避光孵育30 min。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，結(jié)果采用FlowJo V10進(jìn)行分析。

1.2.7 Western blot 收集0、200、400、800 μmol/L ICA 處理36 h 的SW962 細(xì)胞（5×105個）。采用RIPA裂解緩沖液冰上裂解細(xì)胞10 min。4 ℃下10 000 g 離心15 min。轉(zhuǎn)移上清，混勻，在樣品緩沖液中煮沸。取5 μl 用于BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測。蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。孵化的膜在室溫下采用5%脫脂奶粉封閉1 h，添加兔抗人一抗chk1（Ser345）/cdc25c/cyclin B1/cleaved casepase-3/caspase-3 和內(nèi)參抗體GAPDH（1∶1 000），在4 ℃下孵育過夜。TBST 緩沖液沖洗膜，羊抗兔IgG-HRP 二抗孵育1 h，TBST 洗滌后，將條帶暴露于ECL 發(fā)光液中，通過UVP儀進(jìn)行曝光拍攝。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究的所有數(shù)據(jù)均以3 次重復(fù)的±s表示。所有結(jié)果均使用GraphPad Prism 8.0軟件處理。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)行Tukey's 事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICA 對SW962 細(xì)胞活性及核形態(tài)的影響 不同劑量ICA 作用于SW962 細(xì)胞后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞表層黃色析出物為ICA，在高濃度ICA 作用下未見明顯細(xì)胞形態(tài)變化（圖1A）。HE 染色結(jié)果顯示（圖1B），200 μmol/L ICA 作用后，便可觀察到SW962 細(xì)胞核出現(xiàn)多級分裂，細(xì)胞核出現(xiàn)異型，并400、800 μmol/L ICA 作用后 SW962 細(xì)胞胞質(zhì)部位出現(xiàn)明顯空泡樣變。DAPI 染色結(jié)果顯示（圖1C），細(xì)胞在ICA 處理后，出現(xiàn)巨大多核細(xì)胞，除主核外還觀察到較多微核結(jié)構(gòu)，極個別細(xì)胞甚至主核消失。MTT 檢測細(xì)胞活性結(jié)果顯示（圖1D），ICA作用36 h 后，與0 μmol/L ICA 對照組相比細(xì)胞活性顯著下降。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用ICA 處理36 h 后為檢測時間點(diǎn)。與HE染色及DAPI染色觀察到的結(jié)果相同，200、400 和800 μmol/L ICA 作用后，SW962 細(xì)胞核均出現(xiàn)多級分裂，細(xì)胞核出現(xiàn)異型，800 μmol/L ICA作用后，多核細(xì)胞出現(xiàn)概率最多（圖1E）。

圖1 ICA對SW962細(xì)胞形態(tài)及活性的影響Fig.1 Effect of ICA on morphology and activity of SW962 cells

2.2 ICA 通過誘導(dǎo)SW962 細(xì)胞有絲分裂災(zāi)變抑制癌癥發(fā)展 免疫熒光檢測Vimentin和α-tubulin蛋白分布表達(dá)情況（圖2）。結(jié)果顯示：ICA 作用下，Vimentin 和α-tubulin 蛋白在分裂核周出現(xiàn)凝聚，且 呈現(xiàn)多極分布。而未經(jīng)ICA 處理的SW962 細(xì)胞 α-tubulin 主要均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，Vimentin 則主要以兩極分布為主。

圖2 免疫熒光檢測細(xì)胞Vimentin 和α-tubulin 蛋白分布、 表達(dá)情況Fig.2 Distribution and expression of cell Vimentin and α- tubulin protein were detected by immunofluorescence

2.3 ICA 調(diào)控細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測ICA 處理后SW962 細(xì)胞周期變化，通過FlowJo V10 軟件進(jìn)行分析量化（圖3A、3B），結(jié)果表明ICA 處理后，處于G2/M 期的細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞 出現(xiàn)G2/M 期阻滯。Western blot 檢測有絲分裂災(zāi)變及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平（圖3C），結(jié)果表明： 200 μmol/L ICA 作用后，有絲分裂相關(guān)蛋白Chk1（ser345）、cyclinB1、CDK1及cdc25c表達(dá)在12 h時顯著 增 加（P＜0.05），在24～48 h 時 逐 漸 減 弱，而cleaved caspase-3 蛋白則在12～48 h 內(nèi)逐漸增強(qiáng)（P＜0.01，圖3D～H）。

圖3 ICA對SW960細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控Fig.3 Regulation of ICA on SW960 cell cycle and apoptosis

3 討論

有絲分裂災(zāi)變是一種消除高等真核生物有絲分裂無功能細(xì)胞的策略，由復(fù)雜且知之甚少的信號級聯(lián)驅(qū)動。有絲分裂災(zāi)變的特征是獨(dú)特的核改變，出現(xiàn)多核和/或微核。巨大的多核細(xì)胞來源于錯誤分離的未濃縮染色體簇，而微核細(xì)胞來源于后期的滯后染色體或染色體片段，這些染色體或染色體片段留在細(xì)胞分裂末期形成子核，從而產(chǎn)生除主核之外的微核［12］。從功能上，有絲分裂災(zāi)變可以定義為一種內(nèi)在的腫瘤抑制機(jī)制。有絲分裂驅(qū)動失敗后，細(xì)胞增殖水平減弱，最終走向死亡或衰老。因此，誘導(dǎo)有絲分裂災(zāi)變可以抑制腫瘤生長［13-14］。本研究首先通過MTT 法檢測ICA 能否抑制SW962 細(xì)胞生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ICA作用36 h后，細(xì)胞活性與對照組相比明顯下降。ICA對SW962細(xì)胞增殖具有抑制作用。其次，通過HE 染色和DAPI 染色觀察SW962 細(xì)胞形態(tài)和核改變。相差顯微鏡下觀察：不同劑量ICA 作用于SW962 后細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化。HE染色結(jié)果顯示：ICA 處理后，SW962 細(xì)胞核出現(xiàn)異型，多級分裂，且隨著濃度增加，細(xì)胞質(zhì)中可見明顯空泡樣變。DAPI 染色結(jié)果顯示：ICA 處理后，出現(xiàn)巨大多核細(xì)胞，除主核外還觀察到較多微核結(jié)構(gòu)。提示：ICA 誘導(dǎo)SW962 細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變。在有絲分裂進(jìn)程中需要各種細(xì)胞成分的參與，微管就是其一。它由α-tubulin 和β-微管蛋白等亞基組成［15］。有絲分裂開始，微管從細(xì)胞兩側(cè)的中心體發(fā)出，附著在染色體上，牽拉染色體移，構(gòu)成紡錘絲的一部分。Vimentin 在細(xì)胞力學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為有絲分裂紡錘體組織提供空間，并調(diào)節(jié)分裂細(xì)胞中肌動蛋白表層的穩(wěn)定性［16-17］。正常有絲分裂時，Vimentin在兩個子細(xì)胞間幾乎均勻分布。而在有絲分裂災(zāi)變中Vimentin 會凝聚在染色體附近，干擾有絲分裂紡錘體，導(dǎo)致異常有絲分裂，有絲分裂災(zāi)變［18］。為進(jìn)一步探討ICA 作用下SW962 細(xì)胞有絲分裂災(zāi)變的形成機(jī)制，選取α-tubulin 及Vimentin 蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：ICA 作用下，Vimentin 和α-tubulin蛋白在分裂核周出現(xiàn)凝聚，且呈多極分布，這一現(xiàn)象與DUARTE 等［18］及IZDEBSKA 等［19］的研究相類似。進(jìn)一步證實(shí)ICA 誘導(dǎo)SW962 細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變。

有絲分裂災(zāi)變的發(fā)生，對SW962 細(xì)胞的增殖和凋亡有何影響？通過流式細(xì)胞術(shù)、Western blot 方法檢測ICA 處理后細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示：流式細(xì)胞儀檢測觀察到SW962 細(xì)胞在ICA 處理后，G2/M 期被明顯阻滯。Western blot 檢測Chk1（ser345）、cyclinB1、CDK1 及cdc25c 蛋白在ICA處理12 h 時顯著增加，在24～48 h 時逐漸減弱。細(xì)胞周期進(jìn)程中主要是由CDKs、Cyclin、CKI 共同調(diào)控，Cyclin-CDK 復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞周期過程的核心元素。其中CyclinB1和CDK1是細(xì)胞周期G2/M 檢查點(diǎn)的主要調(diào)控元件，能介導(dǎo)G2/M 期轉(zhuǎn)換，啟動有絲分裂［20-21］。cdc25c 是CDK1/CyclinB1 的主要激活物，通過激活CDK1/CyclinB1 促進(jìn)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。檢查點(diǎn)效應(yīng)激酶Chk1 介導(dǎo)時間性細(xì)胞周期停滯，在G2/M 轉(zhuǎn)換中起重要作用［22-23］。一旦Chk1被異常激活，受損DNA 未完成修復(fù)便進(jìn)入G2期，提前進(jìn)入有絲分裂，將誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變，G2/M期阻滯也是有絲分裂災(zāi)變的一個特征［22，24］。本研究中Chk1（Ser345）在ICA 處理12 h 后表達(dá)顯著上升。提示在SW962 細(xì)胞中受損的DNA 提早進(jìn)入G2期。與此同時，G2/M 期轉(zhuǎn)換調(diào)控的CDK1/cyclinB1 及其激活物cdc25c 蛋白表達(dá)增加。細(xì)胞提前進(jìn)行G2/M期轉(zhuǎn)換。但在隨后24～48 h 內(nèi)，細(xì)胞的Chk1（Ser 345）、CDK1、cyclinB1 和cdc25c 蛋白水平逐漸降低，結(jié)合前面α-tubulin及Vimentin蛋白在分裂核周出現(xiàn)凝聚，并且呈現(xiàn)多極分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示隨著ICA濃度的增加，誘導(dǎo)SW962 細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變，細(xì)胞停滯在G2/M 期。CHEN 等［25］采用ICA 處理宮頸癌HeLa 和SiHa 細(xì)胞12 h 時，細(xì)胞周期停滯和凋亡不明顯，但處理24 h 后細(xì)胞周期停滯和凋亡明顯，與在外陰鱗癌SW962細(xì)胞中觀察的現(xiàn)象一致。XIN等［25］還發(fā)現(xiàn)ICA 誘導(dǎo)的活性氧促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞DNA 鏈斷裂和凋亡，研究中發(fā)現(xiàn)ICA 誘導(dǎo)VSCC 有絲分裂災(zāi)變可能與ICA 誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA 斷裂有關(guān)。進(jìn)一步加深對ICA 抑制癌細(xì)胞增殖潛在機(jī)制的認(rèn)識。ICA 阻滯細(xì)胞周期停滯、抑制細(xì)胞增殖，在不同的腫瘤細(xì)胞中作用點(diǎn)有所不同：前列腺癌PC-3細(xì)胞和慢性骨髓性白血病K562 細(xì)胞阻滯在G1期；急性骨髓樣白血病細(xì)胞和伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞阻滯在S期；誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期阻滯于S期［26］；ICA 通過抑制CyclinB、cdc2 和cdc25c 的表達(dá)將人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和檢測的外陰鱗癌SW962 細(xì)胞均阻滯在G2/M期，可能與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境不同有關(guān)［27］。

MATTIELLO 等［28］研究認(rèn)為Chk1 依賴的有絲分裂災(zāi)變，通常導(dǎo)致半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ICA誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過線粒體和fas 介導(dǎo)的caspase 依賴通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞凋亡［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)ICA 可誘導(dǎo)Chk1 依賴的VSCC發(fā)生有絲分裂災(zāi)變，為進(jìn)一步證實(shí)在VSCC 中ICA是否也誘導(dǎo)Caspase 依賴性的細(xì)胞凋亡，選取caspase-3 進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：cleaved caspase-3 蛋白在ICA處理后的12～48 h內(nèi)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。說明SW962 細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)變后細(xì)胞向半胱天冬酶依賴性凋亡方向轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞增殖。

T 淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的主要細(xì)胞，T 細(xì)胞表面表達(dá)Fas 分子，而一些腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)Fas受體（FasL），當(dāng)Fas 與FasL 結(jié)合將誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象。如上所述，ICA 可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，同時降低FasL 表達(dá)，使T 細(xì)胞的凋亡減少，從另一方面可以看出ICA 在抗VSCC 增殖的同時可能增加了免疫性T 細(xì)胞的功能，具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用［31］。