鄭陽(yáng) 武密山

腦卒中是威脅人類(lèi)生命健康及生活質(zhì)量的主要病變之一,具有較高的致死率和致殘率。臨床治療的目的在于使大腦缺血部位再灌注,挽救瀕死的神經(jīng)組織[1]。藥物是治療腦卒中的主要治療手段,常用藥物包括溶栓藥、抗血小板藥、抗凝藥,存在作用機(jī)制單一,長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生不同程度不良反應(yīng)[2]。甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,能補(bǔ)中益氣,緩急止痛,調(diào)和藥性,祛痰解毒,適用于脾胃虛弱、咳嗽痰多、心悸氣短、癰腫瘡毒等癥的治療。甘草的主要活性成分包括三萜類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物,具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗?jié)?、?zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、神經(jīng)保護(hù)的作用[3]。其中甘草酸及其鹽統(tǒng)稱(chēng)為甘草甜素,能夠抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá),對(duì)腦出血、局灶性腦缺血引起的腦損傷具有保護(hù)作用[4]。18β-甘草次酸是甘草酸的主要生物水解代謝物,能抗腦線粒體損傷,對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[5]。甘草酸能促進(jìn)腦內(nèi)膽堿能的傳遞,減輕腦組織氧化應(yīng)激及炎性損傷,顯著改善神經(jīng)元功能,增強(qiáng)記憶功能[6]。本文綜述了甘草及活性成分防治腦卒中的作用機(jī)制,為甘草的臨床研究提供循證支持。

1 甘草及活性成分通過(guò)抗炎減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷

1.1 抑制HMGB1功能

高遷移率族蛋白B1 (high mpbility group box 1,HMGB1)在體內(nèi)作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子,可由壞死細(xì)胞釋放進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境,并被巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞積極分泌,從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá),且不通過(guò)經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基途徑進(jìn)行[7]。HMGB1/ TLR4/NF-κB是腦組織損傷的重要信號(hào)通路,可參與腦組織炎癥、凋亡和增殖,核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是炎癥途徑的重要調(diào)節(jié)因子,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,1L-6)、重組人白細(xì)胞介素-1β(human IL-1 beta protein,IL-1β)等多種細(xì)胞因子的分泌,許多炎癥刺激能促使NF-κB激活,并誘導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),進(jìn)一步參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]。

Yan等[9]將甘草酸(15、30 mg/kg)用于右大腦中動(dòng)脈閉塞建立的局灶性腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能縮小大鼠的腦梗死面積,緩解腦水腫癥狀,降低神經(jīng)功能缺損程度及血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,促進(jìn)SOD的分泌,抑制HMGB1/ TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),表明,甘草酸可通過(guò)抑制HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減輕腦缺血性損傷。喬會(huì)敏等[10]將甘草甜素(5、10、50 mg/kg)用于手術(shù)建立的腦梗死大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草甜素能夠顯著降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分,呈劑量依賴性減輕肺水腫的癥狀及縮小腦梗死體積,抑制腦組織HMGB1、Toll樣受體4重組蛋白(recombinant toll like receptor4,TLR4)、NF-kB、隨機(jī)激活基因表達(dá)(random activation of gene expreion,RAGE)、claudin-5蛋白及基因的表達(dá),表明甘草甜素可通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-kB信號(hào)通路抗炎癥反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)作用。Zhang等[11]將甘草酸(1、2、5 mg/kg)用于右頸總動(dòng)脈夾閉建立的局灶性腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能顯著抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HMGB1的分泌,減輕神經(jīng)功能缺損程度和梗死面積,表明甘草酸可通過(guò)抑制HMGB1-TLR4-IL-17A信號(hào)通路減輕神經(jīng)元損傷。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn),甘草酸(20 mg/kg)能有效抑制骨髓分化初級(jí)反應(yīng)基因88(Myd88)的表達(dá),有助于減輕糖尿病加重腦缺血再灌注損傷,進(jìn)一步降低TLR4,HMGB1和NF-κB的表達(dá),減輕神經(jīng)元丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞活化,其機(jī)制與甘草酸抑制HMGB1/TLR4-Myd88/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。Kim等[13]使用甘草酸(1、5、10 mg/kg)用于大腦動(dòng)脈閉塞建立的腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能縮小腦腦梗死體積,顯著降低mNSS評(píng)分,顯著降低腦組織中IL-1β、TNF-α、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2, COX-2)、iNOS的表達(dá),減輕腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,阻止小膠質(zhì)細(xì)胞分泌HMGB1,并阻斷HMGB1磷酸化和易位,表明甘草酸可通過(guò)抑制HMGB1分泌以減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Jin等[14]將18β-甘草次酸(17.5 μg/ mL)用于小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),18β-甘草次酸能有效抑制HMGB1易位和小膠質(zhì)細(xì)胞極化轉(zhuǎn)化,降低光化學(xué)誘導(dǎo)的腦梗死面積,降低CD16/32的表達(dá),阻止神經(jīng)元的喪失,表明18β-甘草次酸可抑制HMGB1以減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

1.2 阻斷p-38MAPK、NF-κB信號(hào)通路

p-38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的成員,參與多種炎癥細(xì)胞因子的激活,與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞應(yīng)激等生理進(jìn)程密切相關(guān),可進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路激活,引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),造成血腦屏障損傷及細(xì)胞凋亡一系列病理反應(yīng)[15]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPK信號(hào)通路重要分支,可由IL-1、TNF-α、EGF、應(yīng)激等多種因素激活,可造成腦組織缺血再灌注損傷,造成慢性炎癥反應(yīng),加重神經(jīng)細(xì)胞損傷[16]。

姚自同等[17]將甘草酸二銨(5 mL/天)用于可逆性線栓法建立的急性腦缺血再灌注損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸二銨降低Zea-Longa評(píng)分,降低p-38MAPK、NF-κB、MMP-9的表達(dá),表明甘草酸二銨可阻斷p-38MAPK、NF-κB信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng),對(duì)缺血再灌注腦組織發(fā)揮保護(hù)作用。Gong等[18]將甘草酸(2、4、10 mg/kg)用于中動(dòng)脈閉塞建立的局灶性腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能顯著降低大鼠梗死體積及神經(jīng)功能缺損程度,抑制大鼠血清HMGB1的水平,HMGB1與腦細(xì)胞凋亡存在關(guān)聯(lián)性,還能進(jìn)一步降低大腦皮層TNF-α、iNOS、IL-1β、COX-2和IL-6的表達(dá),表明,甘草酸能通過(guò)抑制HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),調(diào)控大腦中的p38和JNK信號(hào)通路以減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上,甘草酸、18β-甘草次酸能通過(guò)抑制HMGB1活性,甘草酸二銨可通過(guò)阻斷p-38MAPK、NF-κB、JNK信號(hào)通路,發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)作用,有助于減輕神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷。

2 甘草及活性成分通過(guò)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷

2.1 增強(qiáng)SOD的活性

腦缺血過(guò)程中可形成過(guò)量的游離氧自由基,并與多不飽和脂防酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),引起MDA的水平升高,加重腦組織損傷,SOD是種自由基清除劑,可將腦缺血形成的超氧自由基轉(zhuǎn)化為活性較低的過(guò)氧化氫形式[19]。

Akman等[20]將80 mg/kg的甘草酸用于手術(shù)建立的局灶性腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能顯著降低MDA水平,升高SOD、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)的水平,減輕腦組織水腫、細(xì)胞變性、空泡形成、神經(jīng)元損傷等多種病理學(xué)改變,降低Caspase-3、Caspase-9的活性,降低NIHSS評(píng)分,表明甘草酸能通過(guò)抗氧化作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。季瑋等[21]將異甘草素(2、4、8 μg/mL)用于神經(jīng)細(xì)胞PC12進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),異甘草素能呈依賴性改善PC12的形態(tài),提高細(xì)胞活力,阻止缺氧引起的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)升高,提高SOD的活性,表明異甘草素可通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)。

2.2 激活Nrf2信號(hào)通路

Nrf2能調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),可誘導(dǎo)多種抗氧化蛋白,降低活性氧及親電體引起的細(xì)胞損傷,維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡[22]。HO-1是Nrf2的下游轉(zhuǎn)錄因子,能將促氧化血紅素降解為一氧化碳、膽紅素、游離鐵,參與抗細(xì)胞凋亡及腦組織保護(hù)[23]。

Zhou等[24]將甘草查耳酮B(30 mg/kg)用于腦卒中大鼠模型發(fā)現(xiàn),甘草查耳酮B能縮小腦梗死面積,降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),提高SOD、谷胱甘肽(glutathion,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)、白細(xì)胞介素-4(interleukin4,IL-4)的活性,降低MDA、iNOS的水平,表明甘草查耳酮B能激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。常江等[25]將甘草查爾酮A(60 mg/kg)用于右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞建立的局灶性腦缺血小鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草查爾酮A能顯著降低神經(jīng)功能評(píng)分,顯著縮小腦梗死體積,降低腦實(shí)質(zhì)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和陽(yáng)性凋亡細(xì)胞,抑制IL-6、TNF-α的水平,抑制HO-1蛋白的表達(dá),表明甘草查爾酮A能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

2.3 調(diào)節(jié)miR-20/PINK1信號(hào)通路

miR-205參與細(xì)胞增殖、遷移和血管生成,在腦組織缺血缺氧時(shí)呈低表達(dá),PINK1為線粒體膜蛋白,能保持線粒體功能的穩(wěn)定,其過(guò)度激活可促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡,加重腦組織損傷[26]。齊獻(xiàn)忠等[27]將甘草甜素(2.5、5 μmol/mL)用于大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RCMECs)的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草甜素能顯著提高RCMECs的細(xì)胞活性,降低細(xì)胞內(nèi)P21蛋白和PINK1基因的表達(dá),提高RCMECs內(nèi)miR- 205的表達(dá),表明甘草甜素能通過(guò)上調(diào)miR-205靶向下調(diào)PINK1來(lái)減輕氧化自由基引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上,甘草酸、異甘草素能通過(guò)增強(qiáng)SOD活性,甘草查耳酮A和B可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路,甘草酸調(diào)節(jié)miR-20/PINK1信號(hào)通路,發(fā)揮抗氧化活性,對(duì)腦組織發(fā)揮保護(hù)作用。

3 甘草及活性成分通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮腦卒中防治作用

Caspase-9被稱(chēng)為“凋亡啟動(dòng)者”,能激活Caspases-3誘導(dǎo)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的破壞,造成DNA碎片化,在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[28]。抑制Caspase-3信號(hào)通路有助于減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷。Lim等[29]將甘草酸(10、30、100 mg/kg)用于手術(shù)建立的缺血性腦卒中小鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸能顯著縮小腦梗死體積,降低神經(jīng)元缺損評(píng)分,下調(diào)Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),表明甘草酸能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白信號(hào)發(fā)揮防治缺血性腦卒中的作用。

HMGB1是一種損傷相關(guān)分子,可刺激和放大炎癥反應(yīng),最終誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4 ,GPX4)在氧化應(yīng)激下可清除脂質(zhì)過(guò)氧化物,GPX4失活會(huì)促進(jìn)過(guò)氧化脂質(zhì)過(guò)度形成,并導(dǎo)致線粒體損傷,加快神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡[30]。Zhu等[31]將甘草酸(20 mg/kg)用于幼鼠的腦組織進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,甘草酸能增加皮層區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)量,抑制神經(jīng)元中HMGB1的表達(dá),降低ATP5G3、CS、PTGS2、IREB2和RPL8等鐵死亡相關(guān)mRNA的表達(dá),減輕皮層線粒體氧化應(yīng)激損傷,降低TNF-α,IL-6和IL-1β等炎癥因子的表達(dá),表明甘草酸可通過(guò)抑制HMGB1/GPX4信號(hào)通路減輕神經(jīng)元鐵死亡。

綜上,甘草酸能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白分泌及抑制HMGB1/GPX4信號(hào)通路,有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)元鐵死亡,進(jìn)而發(fā)揮防治缺血性腦卒中的功效。

4 甘草及活性成分通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖發(fā)揮防治腦卒中療效

Akt信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、存活的關(guān)鍵調(diào)控因子,在細(xì)胞外刺激、生長(zhǎng)因子等多種因素刺激下,能促使Akt激活,進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝,控制細(xì)胞增長(zhǎng),抑制促凋亡蛋白Bad分泌,促使p21磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖[32]。神經(jīng)干細(xì)胞增殖可促使新神經(jīng)元的產(chǎn)生,并遷移至神經(jīng)功能區(qū)域進(jìn)行功能整合及神經(jīng)發(fā)生,對(duì)維持腦組織功能具有積極意義[33]。

唐鑄等[34]將甘草酸二銨(20 mg/kg)用于可逆性線栓法建立的腦缺血再灌注大鼠的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)甘草酸二銨能顯著降低神經(jīng)功能評(píng)分,增加神經(jīng)元尼氏小體的數(shù)量,降低Akt、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,表明甘草酸二銨能激活A(yù)kt信號(hào)通路減輕腦缺血再灌注損傷。劉雪芹等[35]將18α-甘草次酸(40 mg/kg)用于成年小鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),18α-甘草次酸能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及提高神經(jīng)干細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD1蛋白和基因的表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)ROS的堆積,促進(jìn)Nrf2基因及蛋白的表達(dá),表明18α-甘草次酸可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。

綜上,甘草酸二銨能激活A(yù)kt信號(hào)通路,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖,18α-甘草次酸能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,以減輕腦缺血再灌注損傷。

5 甘草及活性成分通過(guò)維持血腦屏障的穩(wěn)定性治療腦卒中

Claudin-5、VE-Cadherin是細(xì)胞間的緊密連接蛋白,維持細(xì)胞正常的極性及功能,其水平異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)元組織間及血管內(nèi)皮間細(xì)胞通透性改變,進(jìn)一步加重腦組織水腫,引起血腦屏障功能改變[36]。HMGB1可從壞死神經(jīng)元中釋放,通過(guò)與RAGE、TLR2、TLR4等受體結(jié)合,促進(jìn)MMP-9的激活,導(dǎo)致緊密連接和神經(jīng)血管單位破壞,進(jìn)一步加重血腦屏障破壞,加劇神經(jīng)功能損傷[37]。

趙立文等[38]將甘草酸二銨(5.4 mg/天)用于頸動(dòng)脈夾閉的腦缺血再灌注損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甘草酸二銨能縮小腦梗死灶面積,降低Claudin-5、VE-Cadherin 的表達(dá)及空泡細(xì)胞的數(shù)量,提高腦組織Claudin-5蛋白的表達(dá),降低Rac-1蛋白的表達(dá)水平,表明,甘草酸二銨能通過(guò)保護(hù)血腦屏障的穩(wěn)定性來(lái)減輕神經(jīng)血管單元的損傷。Chen等[39]將甘草酸(15、30、60 mg/kg)用于急性腦卒中患者及頸動(dòng)脈夾閉建立缺血性腦卒中大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn),甘草酸能降低腦卒中患者血清硝基絡(luò)氨酸和HMGB1的水平,延長(zhǎng)模型大鼠T-PA治療后過(guò)氧亞硝酸鹽介導(dǎo)的HMGB1/TLR2信號(hào)的激活,有助于降低大鼠腦組織血管內(nèi)皮自由基的釋放,有助于抑制MMP-9的活性,減輕腦組織細(xì)胞凋亡和血腦屏障損傷,從而有效降低腦死亡率、腦出血、出血性轉(zhuǎn)化、神經(jīng)功能缺損,表明甘草酸可通過(guò)降低HMGB1/TLR2表達(dá)及MMP-9的激活,保護(hù)血腦屏障功能,以減輕出血性轉(zhuǎn)化進(jìn)程。Shen等[40]發(fā)現(xiàn),甘草酸(30 mg/kg)能延緩組織纖溶酶原激活物治療缺血性腦卒中的療效,抑制HMGB1-MMP-9信號(hào)通路,有效降低腦腫脹、死亡率、出血性轉(zhuǎn)化。

綜上,甘草酸二銨能維持血腦屏障的穩(wěn)定性,甘草酸能抑制HMGB1-MMP-9信號(hào)通路,減輕血腦屏障破壞,有助于降低腦卒中死亡率及出血性轉(zhuǎn)化。

6 結(jié)語(yǔ)

腦卒中患者的預(yù)后普遍較差,尋找積極有效的治療藥物對(duì)改善預(yù)后具有重要臨床意義。甘草作為常見(jiàn)的補(bǔ)氣中藥,其活性成分對(duì)腦卒中可發(fā)揮多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用,從多角度減輕腦組織損傷,保護(hù)血腦屏障,但也存在以下幾個(gè)問(wèn)題亟待解決。第一,甘草存在多種活性成分,各單體防治腦卒中的藥理機(jī)制異同尚未闡明完全。第二,甘草的活性成分通過(guò)血腦屏障的能力較差,生物利用度不好,藥代特征尚不明確。第三,甘草活血成分的有效藥物濃度在各研究存在較大差異,尚未獲得統(tǒng)一意見(jiàn)。第四,甘草活性成分用于腦卒中的研究多停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,在人體的療效需開(kāi)展臨床研究進(jìn)行確認(rèn)。推動(dòng)和加速甘草防治腦卒中新藥的研制與開(kāi)發(fā)仍任重道遠(yuǎn)。