覃順旺，王躍華*，俸世洪，文詩(shī)玉，閻婷婷，張益嘉

(1.成都大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 610106；2.成都第一制藥有限公司，四川成都 610930；3.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610106)

山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]為茄科山莨菪屬多年生宿根草本植物，是青藏高原上特有的藥用植物;生長(zhǎng)環(huán)境是海拔2 200～4 200 m的土坡、河灘及避風(fēng)向陽(yáng)的山谷[1-3]。山莨菪始載于《月王藥診》，藥用歷史悠長(zhǎng)，藏族民間以根或種子入藥，其藥效成分主要是莨菪烷類生物堿，具有鎮(zhèn)靜麻醉、止痛解痙、止咳平喘等功效[4-6]。山莨菪植物在自然條件下，通常是通過(guò)種子繁殖，但存在種子萌發(fā)率低、出苗時(shí)間長(zhǎng)和出苗不整齊等問(wèn)題，嚴(yán)重影響山莨菪大規(guī)模的人工繁育，且過(guò)度采挖導(dǎo)致山莨菪野生資源破壞嚴(yán)重，現(xiàn)已被列為《中國(guó)國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》二級(jí)保護(hù)植物[7-9]。

開(kāi)展山莨菪種子的組織培養(yǎng)消毒技術(shù)研究，高效獲取大量?jī)?yōu)質(zhì)無(wú)菌苗，不僅為山莨菪快繁體系建立奠定基礎(chǔ)，也為其育種研究、基因工程和植物脫毒苗生產(chǎn)等提供材料，有利于山莨菪資源的保護(hù)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。山莨菪種皮十分堅(jiān)硬，抑制種子萌發(fā)，且種子表面布滿褶皺，易隱藏大量的微生物，極大增加了山莨菪種子在組培過(guò)程中的消毒難度。因此，建立一套染菌率低、萌發(fā)率高的山莨菪種子消毒方法是至關(guān)重要的。該試驗(yàn)以成熟的山莨菪種子為材料，研究不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)山莨菪種子消毒和萌發(fā)的影響，從中篩選出最佳的消毒處理組合，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)山莨菪優(yōu)質(zhì)無(wú)菌苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料山莨菪種子于2021年8月份采自青海省西寧市湟中縣，經(jīng)四川師范大學(xué)馬丹煒教授鑒定為茄科山莨菪屬植物山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]的種子。采集的種子待其自然干燥后，置于4 ℃儲(chǔ)存。

試驗(yàn)藥品HgCl2(含量>99.5%)購(gòu)于利祥汞業(yè)化工有限公司；NaClO(有效氯含量>8%)購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司；C2H5OH(含量>99.7%)購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1升汞消毒處理。將山莨菪種子用蒸餾水清洗3次，去除漂浮的種子，放入超凈工作臺(tái)。先使用75%乙醇預(yù)處理30 s 后，再使用0.05%的升汞溶液分別處理0(對(duì)照組)、2、4、6、8、10和12 min，蒸餾水清洗5次。后續(xù)處理置于0.08%(m/m)的無(wú)菌赤霉素(GA3)溶液中浸泡24 h，經(jīng)蒸餾水清洗3次后，接種于含有3%蔗糖+0.7%瓊脂的MS培養(yǎng)基上，置于溫度為(22±1)℃的黑暗條件下進(jìn)行種子萌發(fā)培養(yǎng)。

1.2.2次氯酸鈉消毒處理。將山莨菪種子用蒸餾水清洗3次，去除漂浮的種子，放入超凈工作臺(tái)。先使用75%乙醇預(yù)處理30 s后，再使用25%、50%和75%的次氯酸鈉溶液分別處理0(對(duì)照組)、10、20和30 min，蒸餾水清洗5次。后續(xù)處理與“1.2.1”項(xiàng)下相同。

1.2.3消毒劑組合消毒處理。將山莨菪種子用蒸餾水清洗3次，去除漂浮的種子，放入超凈工作臺(tái)。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，即采用75%乙醇、75%次氯酸鈉和0.05%升汞對(duì)山莨菪種子進(jìn)行聯(lián)合消毒處理，每種消毒劑使用后都用蒸餾水清洗4次。后續(xù)處理與“1.2.1”項(xiàng)下相同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 23.0和和Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)是胚根突破種皮0.3 cm以上。計(jì)算公式如下：

種子萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100%

種子染菌率=污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 升汞對(duì)山莨菪種子消毒和萌發(fā)的影響試驗(yàn)采用0.05%的升汞溶液分別對(duì)山莨菪種子進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理，18 d后統(tǒng)計(jì)各組山莨菪種子的染菌率和萌發(fā)率。從表1可以看出，當(dāng)0.05%的升汞溶液處理2 min時(shí)，山莨菪種子的染菌率最高，為40.0%，但萌發(fā)率也最高，為59.2%；當(dāng)0.05%的升汞溶液處理12 min時(shí)，種子的染菌率最低，僅為5.8%，萌發(fā)率也最低，僅為22.5%。通過(guò)與對(duì)照組(CK)的比較可知，0.05%的升汞溶液對(duì)山莨菪種子的萌發(fā)具有抑制作用，處理時(shí)間越久，抑制作用越強(qiáng)，但消毒效果越好。

由表1可知，0.05%的升汞消毒時(shí)間在2～12 min，隨著消毒時(shí)間的不斷增加，山莨菪種子的染菌率和萌發(fā)率均呈下降趨勢(shì)，染菌率從最高的40.0%下降至5.8%，萌發(fā)率從最高的59.2%下降至22.5%。這是因?yàn)樯捷馆蟹N子表面凹凸不平，布滿大量溝狀褶皺，其中易滋生大量的病菌；同時(shí)，粗糙的表面產(chǎn)生大量氣泡依附在種子表面，很大程度上阻礙了升汞溶液與山莨菪種子表面的直接接觸，大大地降低了升汞的消毒效果(圖2)；若延長(zhǎng)消毒時(shí)間，消毒劑升汞(HgCl2)溶液的重金屬離子會(huì)造成植物種胚損傷，進(jìn)而抑制生長(zhǎng)，最終表現(xiàn)為種子萌發(fā)率也大大降低[10-12]。

表1 升汞對(duì)山莨菪種子消毒的影響

圖2 山莨菪種子(A)及其消毒過(guò)程中種皮表面產(chǎn)生的氣泡(B)Fig.2 Anisodus tanguticus seeds(A)and the bubbles generated on the seed coat surface during sterilization(B)

2.2 次氯酸鈉對(duì)山莨菪種子消毒和萌發(fā)的影響該試驗(yàn)采用濃度為25%、50%和75%的次氯酸鈉溶液對(duì)山莨菪種子分別進(jìn)行10、20和30 min的消毒處理，9 d后統(tǒng)計(jì)山莨菪種子的染菌率和萌發(fā)率。從表2可以看出，當(dāng)使用25%次氯酸鈉消毒10 min時(shí)，種子的污染率最高，達(dá)到了43.3%；當(dāng)使用75%次氯酸鈉消毒30 min時(shí)，種子的消毒效果最好，污染率為0，但此時(shí)的萌發(fā)率僅為10.0%，遠(yuǎn)低于75%次氯酸鈉消毒10 min時(shí)的萌發(fā)率(94.6%)。通過(guò)與對(duì)照組的萌發(fā)率比較可知，通常情況下次氯酸鈉對(duì)山莨菪種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，這是因?yàn)樯捷馆袌?jiān)硬的種皮抑制萌發(fā)[13]，而次氯酸鈉的腐蝕作用能削弱種皮，促進(jìn)萌發(fā)；但濃度過(guò)大、消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的情況下，次氯酸鈉也會(huì)損傷種胚，嚴(yán)重抑制萌發(fā)。

表2 次氯酸鈉溶液對(duì)山莨菪種子消毒和萌發(fā)的影響

由表2可知，從山莨菪種子染菌率的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，隨著3種不同濃度的次氯酸鈉消毒時(shí)間由10 min增加至30 min，各組種子的染菌率均呈明顯下降趨勢(shì)。從山莨菪種子萌發(fā)率的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，其種子的萌發(fā)率變化趨勢(shì)有2種情況：①當(dāng)采用25%次氯酸鈉處理種子時(shí)，隨著消毒時(shí)間由10 min增加至30 min，種子萌發(fā)率呈逐漸增加趨勢(shì)，當(dāng)消毒時(shí)間為30 min時(shí)，山莨菪種子的萌發(fā)率可達(dá)到85.8%；②當(dāng)采用50%或75%的次氯酸鈉溶液消毒山莨菪種子時(shí)，隨著消毒時(shí)間由10 min增加至30 min，種子萌發(fā)率呈逐漸下降趨勢(shì)，其中山莨菪種子萌發(fā)率最高的處理是采用75%次氯酸鈉消毒10 min，其種子萌發(fā)率最高，為94.6%。

2.3 不同消毒組合對(duì)山莨菪種子消毒和萌發(fā)的影響從上述使用升汞或次氯酸鈉對(duì)山莨菪種子消毒的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，為了獲得山莨菪種子高的萌發(fā)率與低的污染率的雙重效果，還需通過(guò)正交試驗(yàn)開(kāi)展進(jìn)一步研究，9 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。在以染菌率為指標(biāo)時(shí)，通過(guò)極差(R)分析表明3個(gè)因素的影響從大到小依次為C>B>A，即0.05%升汞的影響最大，75%次氯酸鈉次之，75%乙醇影響最小；根據(jù)各水平的均值大小，推理出山莨菪種子消毒的最佳組合為A1B3C3，即75%乙醇0.5 min+75%次氯酸鈉15 min+0.05%升汞1.5 min，正交表中找到對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組合，山莨菪種子萌發(fā)率達(dá)到90.0%，染菌率為0。在以萌發(fā)率為指標(biāo)時(shí)，通過(guò)極差分析3個(gè)因素的影響從大到小依次為C>A>B，即0.05%升汞的影響最大，75%乙醇次之，75%次氯酸鈉影響最?。桓鶕?jù)各水平的均值大小來(lái)看，推理出山莨菪種子萌發(fā)的最佳組合為A1B3C1，即75%乙醇0.5 min+75%次氯酸鈉15 min+0.05%升汞 0.5 min，因正交試驗(yàn)表中沒(méi)有與推導(dǎo)出的最佳消毒方法對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組合，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明此條件下山莨菪種子萌發(fā)率為93.8%，染菌率為18.8%。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

由方差分析(表4)可知，在3個(gè)因素中，因素C即升汞對(duì)山莨菪種子的消毒具有極顯著影響，升汞消毒在降低染菌率方面起著關(guān)鍵作用。因素A、B和C對(duì)山莨菪種子萌發(fā)都具有顯著影響，表明山莨菪種子的萌發(fā)對(duì)3種消毒劑的處理都較敏感，需要控制好消毒時(shí)間，保障種子的萌發(fā)率。

表4 方差分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮山莨菪種子的染菌率和萌發(fā)率，該研究采用A1B3C3作為山莨菪種子消毒的最佳方法，即75%乙醇消毒0.5 min+75%次氯酸鈉消毒15 min+0.05%升汞消毒1.5 min，此時(shí)山莨菪種子的萌發(fā)率為90.0%，染菌率為0。

3 結(jié)論與討論

山莨菪種子種皮質(zhì)地堅(jiān)硬，導(dǎo)致種子不透水、不透氣且萌發(fā)受到機(jī)械阻礙，這是自然狀態(tài)下山莨菪種子萌發(fā)低的原因[14]；同時(shí)山莨菪種子表面粗糙、布滿褶皺，微生物極易隱藏在其中，消毒工作十分困難。在組織培養(yǎng)中，為了獲得山莨菪種子低污染率和高萌發(fā)率的雙重效果，該試驗(yàn)研究了不同的消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)其消毒和萌發(fā)的影響。首先開(kāi)展了升汞和次氯酸鈉單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明2種消毒劑單獨(dú)使用都不能獲得良好的效果。為此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮染菌率和萌發(fā)率，設(shè)計(jì)了乙醇、次氯酸鈉和升汞的正交試驗(yàn)，得到山莨菪種子的最佳消毒方式為75%乙醇消毒0.5 min+75%次氯酸鈉消毒15 min+0.05%升汞消毒1.5 min，山莨菪種子的萌發(fā)率可達(dá)90.0%，染菌率最低為0。消毒劑組合消毒效果良好，認(rèn)為主要是次氯酸鈉具有腐蝕山莨菪堅(jiān)硬種皮的作用，使得本來(lái)堅(jiān)硬且凹凸不平、布滿褶皺的種皮變得較平滑和較薄軟，接著再使用一定濃度的升汞溶液消毒就能達(dá)到很好的消毒效果，并且山莨菪種子胚根也更容易突破處理后的種皮，消毒劑的聯(lián)合使用消毒效果更好，萌發(fā)率更高。

大量報(bào)道顯示，通過(guò)種子消毒得到無(wú)菌苗的過(guò)程，受到諸多因素的影響，如消毒劑種類、濃度、消毒時(shí)間、種皮厚度、種子休眠程度等，因此，根據(jù)種子自身特性選擇合適的消毒方法至關(guān)重要[15-16]。消毒方法不僅關(guān)乎種子的染菌率，同樣對(duì)種子的萌發(fā)率也具有較大的影響[17]。該研究以消毒效果和萌發(fā)率為依據(jù)，獲得了組織培養(yǎng)中山莨菪種子的最佳消毒方法，為山莨菪野生資源保護(hù)與大規(guī)模生產(chǎn)山莨菪優(yōu)質(zhì)種苗奠定基礎(chǔ)。