陳林林，楊茜瑤，李偉，宋佳琪，王玲

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，哈爾濱 150028)

紫蘇在古代漢語中又被稱為紫蘇子[1]，一年生直立草本植物[2]，其葉片通常是折疊的，一側(cè)為綠色，另一側(cè)為紫色，是一種含有大量揮發(fā)性成分的天然植物，常被人們用作調(diào)味品或香料[3-4]。紫蘇具有降低血脂水平、改善心血管疾病、改善視力、促進大腦神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育等作用[5-6]，其主要含有多酚等抗氧化成分，可以清除細胞內(nèi)的自由基[7-10]；在我國主要被用作香料或藥物，或者泡茶、煮粥使用，也可作為臨床藥物使用[11]。紫蘇籽提煉油脂后所得的副產(chǎn)品為紫蘇粕，紫蘇粕中富含紫蘇油脂、多糖、纖維素、蛋白質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等[12]。其中多酚和抗氧化肽等抗氧化物質(zhì)具有抗腫瘤、抗衰老等功效，經(jīng)常被用于保健食品中。

近年來，為提高紫蘇粕的生物利用價值，多采用提取和純化的途徑來獲得紫蘇粕中的有效成分。Wang等[13]采用超聲-酶輔助萃取和液-液萃取的方法提取紫蘇葉中的多酚，粗提物中多酚含量較高，對DPPH·、O2-·、ABTS+·的清除能力分別是VC的1.71，2.40，1.14倍。Huang等[14]將紫蘇籽經(jīng)微波處理，冷榨提取紫蘇籽油，提高了紫蘇籽油的總生育酚、植物甾醇含量和抗氧化能力，實現(xiàn)了紫蘇的高附加值綜合利用。由此可見，不同加工提取方式對紫蘇性能有很大的影響。Yang等[15]從紫蘇種子副產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)并用堿性蛋白酶水解，從水解物中提純抗氧化肽。獲取兩種具有較強抗氧化活性的肽，能高效地淬滅自由基(DPPH·、ABTS+·和·OH)并顯示出高氧自由基吸收能力。

為實現(xiàn)紫蘇粕中有效成分的高附加值利用，結(jié)合降低酶解反應(yīng)成本，本文選用酵母菌和雙歧桿菌復(fù)配進行紫蘇餅粕混合發(fā)酵，通過發(fā)酵過程酶解提高紫蘇粕中抗氧化物質(zhì)活性。探究發(fā)酵條件對發(fā)酵后產(chǎn)物的活性成分含量和體外自由基清除活性的影響，并對抗氧化活性指標進行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇粕：黑龍江省樺南農(nóng)盛園食品有限公司；發(fā)酵菌種：酵母菌(Saccharomycescerevisiae)131、雙歧桿菌(Bifidobacteria)sq-1，保存于本實驗室；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會社；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司；三氯化鐵：天津市雙船化學試劑廠；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、吐溫80：天津市泰興試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BKQ-B75L立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津歐諾儀器儀表有限公司；TGL-16高速臺式離心機 上海醫(yī)療器械六廠；UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱量紫蘇餅粕粉500 g，取1 500 mL的石油醚對其浸泡30 min脫脂，棄去上層油脂清液。重復(fù)上述操作3次，將脫脂后的紫蘇粕通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余石油醚。對紫蘇粕進行抽提后置于80 ℃烘箱中進行烘干，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

參考文獻[16]的方法配制雙歧桿菌的培養(yǎng)基，將雙歧桿菌的培養(yǎng)基置于已滅菌的錐形瓶中，常溫放置，備用。準確稱取6.24 g雙歧桿菌培養(yǎng)基，加入100 mL的無菌水，100 ℃攪拌至溶解，120 ℃條件下滅菌20 min，取出冷卻，放置備用。

酵母菌培養(yǎng)基的制備：稱取26.00 g麥芽汁培養(yǎng)基(實驗室自制)，加入200 mL的無菌水，100 ℃攪拌至溶解，120 ℃條件下滅菌20 min，取出冷卻，備用。

1.3.3 菌種活化

準確稱取雙歧桿菌0.50 g，接種在100 mL已滅菌的雙歧桿菌培養(yǎng)基中，混合均勻后封口置于32 ℃無氧條件下恒溫靜置培養(yǎng)24 h。準確稱取酵母菌0.50 g于200 mL的酵母菌培養(yǎng)基中，封口后置于35 ℃恒溫水浴振蕩器中65 r/min培養(yǎng)24 h。上述兩種菌液可作為一代菌液。分別吸取一代菌液1%于各自的培養(yǎng)基中，與上述培養(yǎng)條件一致，即可獲得二代菌液。

1.3.4 不同發(fā)酵條件對紫蘇粕抗氧化活性的影響

將雙歧桿菌和酵母菌混合接種在滅菌后的紫蘇餅粕上，按復(fù)配混合菌總接種量為4%，考察菌種復(fù)配比(酵母菌和雙歧桿菌的比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、料液比(紫蘇粕和水的比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、發(fā)酵時間(12，24，36，48，72 h)、pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)和發(fā)酵溫度(26，28，30，32，34 ℃)5個因素對發(fā)酵后紫蘇粕抗氧化活性的影響。

將發(fā)酵后的紫蘇粕置于高速離心機中，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液作為待測液。測定抗氧化活性和抗氧化活性成分并分析抗氧化活性與活性成分之間的相關(guān)性。

1.3.4.1 DPPH·清除能力的測定

參考文獻[17]進行修改，取2 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液和2 mL配制好的DPPH·無水乙醇溶液；取2 mL無水乙醇溶液和2 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液；取2 mL的無水乙醇溶液與2 mL DPPH·無水乙醇溶液，反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光值，分別記為A1、A2、A0，清除能力按式(1)進行計算：

(1)

式中：SC1為DPPH·的清除率；A1為2 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液+2 mL DPPH的吸光值；A2為2 mL無水乙醇+2 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.3.4.2 ·OH清除能力的測定

取紫蘇粕發(fā)酵上清液適量，將其稀釋10倍，取1 mL稀釋后的紫蘇粕發(fā)酵上清液，依次加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L 水楊酸溶液、1 mL 9.9 mmol/L H2O2溶液，測定吸光值(510 nm)，記為A1；用蒸餾水替代H2O2溶液，測定吸光值(510 nm)，記為A2；用蒸餾水作對照，測定吸光值(510 nm)，記為A0，按式(2)計算·OH清除能力[18]:

(2)

式中：SC2為·OH的清除率；A1為1 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光值；A2為1 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL蒸餾水的吸光值；A0為1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光值。

1.3.4.3 O2-·清除能力的測定

取8.8 mL濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液于10 mL試管中，25 ℃下水浴20 min，取出立即加入25 ℃預(yù)熱過的7 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL，將二者的混合溶液定容至10 mL，此時開始進行氧化反應(yīng)，待反應(yīng)啟動后1 min開始計時，在325 nm處進行測定，每隔30 s測定一次吸光值，共記錄數(shù)據(jù)6次，繪制曲線，曲線斜率為鄰苯三酚自氧化速率。同樣取紫蘇粕發(fā)酵上清液1.0 mL，加入配制好的鄰苯三酚，可以得到溶液的自氧化速率，按式(3)進行計算[19]：

(3)

式中:SC3為O2-·的清除率；A0為鄰苯三酚的自氧化速率；AX為加入紫蘇粕發(fā)酵上清液后的鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.4.4 ABTS+·清除能力的測定

在試管中加入1 mL的紫蘇粕發(fā)酵上清液和5 mL ABTS+·反應(yīng)液，25 ℃下反應(yīng)10 min，在734 nm處測吸光值為As，以不加紫蘇粕發(fā)酵上清液的ABTS+·溶液為空白對照測其吸光值為A0。按式(4)計算ABTS+·的清除能力[18]：

(4)

式中：SC4為ABTS+·的清除率；A0為1 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液+5 mL ABTS+·反應(yīng)液的吸光值；AS為1 mL紫蘇粕發(fā)酵上清液+5 mL蒸餾水的吸光值。

1.3.4.5 FRAP總還原能力的測定

參照文獻[20]的方法，配制pH 3.6的0.3 mol/L醋酸緩沖液，10 mmol/L TPTZ溶液，用40 mmol/L HCl溶液定容于20 mmol/L氯化鐵(FeCl3)溶液中。將上述溶液以10∶1∶1的比例混合制成FRAP(ferric reducing ability of plasma)工作液。取1 mL上清液與6 mL FRAP工作液于試管中，37 ℃反應(yīng)10 min。測其吸光值A(chǔ)(593 nm)，吸光值越大，表示總還原能力越強。

1.3.5 發(fā)酵紫蘇粕中多酚含量的測定

標準曲線的繪制(沒食子酸)：配制濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。準確稱量0.25 g FeSO4試劑和1.25 g酒石酸鈉,用蒸餾水定容在250 mL 容量瓶中得到酒石酸亞鐵顯色劑。取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 配制好的沒食子酸標準溶液，加2 mL 酒石酸亞鐵顯色劑和5 mL pH 7.5的PBS緩沖溶液，定容至10 mL容量瓶中，測定此時溶液的吸光值(540 nm)，以沒食子酸濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光值A(chǔ)為縱坐標，繪制標準曲線：y=0.014 7x+0.000 7，R2=0.992 4，計算多酚含量。

1.3.6 發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的測定

參考文獻[21]的方法，稱取0.10 g考馬斯亮藍試劑將其溶解在50 mL 95%的乙醇中，加入100 mL 85%(質(zhì)量和體積比)磷酸后，用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾制得考馬斯亮藍溶液，以標準蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)為橫坐標、吸光值(595 nm)為縱坐標，繪制標準曲線y=0.707 9x-0.002 71，R2=0.992 4，根據(jù)標準曲線計算得出發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，顯著性水平P<0.05，采用Pearson進行線性相關(guān)分析，用Origin 2018軟件繪圖，得出實驗結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對紫蘇粕抗氧化活性的影響

2.1.1 菌種復(fù)配比對抗氧化性的影響

由圖1可知，當酵母菌和雙歧桿菌復(fù)配比在3∶1～1∶3的范圍內(nèi)，DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·4種自由基的清除效果趨勢大致相同，總體為先上升后下降。當雙歧桿菌的含量過高時，阻礙發(fā)酵粕中多酚的釋放，使整體抗氧化活性降低[22—23]，在菌種比為2∶1時DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除率均達到最大(P<0.05)，分別為50.60%、43.4%、46.15%、67.65%。菌種比對DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除率影響顯著(P<0.05)，這與張雪等[24]的實驗結(jié)果一致。

圖1 菌種復(fù)配比對紫蘇粕抗氧化性的影響Fig.1 Effect of bacterial strain compound ratio on antioxidant activity of perilla meal

2.1.2 料液比對紫蘇粕抗氧化性的影響

由圖2可知，當料液比在1∶1～1∶5的范圍內(nèi)，DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·4種自由基的清除效果均逐漸下降。水含量逐漸升高使樣品濃度減少，導(dǎo)致多酚含量減少，使整體抗氧化活性呈下降趨勢[25]，在料液比為1∶1時，DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除率均達到最大(P<0.05)，分別為67.42%、59.65%、68.03%、73.58%。料液比對DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除率影響顯著(P<0.05)，且對4種自由基的清除能力呈一定的線性相關(guān)。

圖2 料液比對紫蘇粕抗氧化性的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on antioxidant activity of perilla meal

2.1.3 發(fā)酵時間對紫蘇粕抗氧化性的影響

由圖3可知，抗氧化活性隨發(fā)酵時間的增加而增大，多在72 h時達到最大后顯著下降(P<0.05)。原因是在12～72 h時菌株生長加快，處于對數(shù)生長時期[26]。發(fā)酵液中多糖對自由基的清除率在72 h時·OH、O2-·、ABTS+·的清除率達到最大，分別為74.54%、71.36%、75.91%；只有DPPH·的清除率在48 h時最大，為78.05%。因此，發(fā)酵時間以72 h為宜。

2.1.4 pH對紫蘇粕抗氧化性的影響

由圖4可知，抗氧化活性隨pH的增加而增大，在pH為7.0時達到最大(P<0.05)。酸性條件對乳酸菌和雙歧桿菌會產(chǎn)生影響，降低菌類的生物活性，使其產(chǎn)酶的能力下降，抑制酚酸的釋放[27]，當pH達到7.0時，達到最佳條件，DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除率均達到最大，分別為66.22%、53.27%、63.68%、82.98%。pH在3.00～7.00范圍內(nèi)，DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除能力分別上升了40.65%、16.28%、23.02%、15.43%，其中對ABTS+·的清除能力明顯高于對其他3種自由基的清除能力。因此，選擇pH為7.0。

圖4 pH對紫蘇粕抗氧化性的影響Fig.4 Effect of pH on antioxidant activity of perilla meal

2.1.5 發(fā)酵溫度對紫蘇粕抗氧化活性的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，抗氧化活性基本顯示出先增大后減小的趨勢，抗氧化活性受發(fā)酵溫度的影響顯著(P<0.05)，由于發(fā)酵溫度較低，菌株生長緩慢，產(chǎn)酶能力差，阻礙酚酸的釋放[28]。當溫度達到36 ℃時，清除能力最弱，在32 ℃時清除能力最強，由大到小依次為ABTS+·(85.11%)>DPPH·(63.83%)>O2-·(62.04%)>·OH(55.70%)；其中對ABTS+·的清除能力明顯高于其他3種自由基。因此，發(fā)酵溫度為32 ℃時對抗氧化活性的影響顯著(P<0.05)。

圖5 發(fā)酵溫度對紫蘇粕抗氧化性的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on antioxidant activity of perilla meal

2.2 發(fā)酵紫蘇粕中抗氧化物質(zhì)與評價指標相關(guān)性分析

測定發(fā)酵后紫蘇粕發(fā)酵上清液的抗氧化活性指標及成分，經(jīng)過SPSS分析得相關(guān)性分析，見表1。

表1 發(fā)酵條件對紫蘇粕抗氧化活性影響的相關(guān)性Table 1 Correlation of effect of fermentation conditions on antioxidant activity of perilla meal mg/g

由表1可知，在改變菌種比時，紫蘇粕發(fā)酵上清液中蛋白質(zhì)含量與·OH、O2-·兩種自由基的清除能力的線性關(guān)系顯著[29](P<0.05)，與總還原能力的線性關(guān)系極顯著(P<0.01)；多酚含量與O2-·清除能力之間線性關(guān)系顯著，與總還原能力之間線性關(guān)系極顯著，與其他活性指標間的相關(guān)性不顯著。料液比對蛋白質(zhì)含量和多酚含量影響的評價方法中，蛋白質(zhì)含量與·OH、DPPH·的清除能力之間線性關(guān)系極顯著(P<0.01)；多酚含量與·OH、ABTS+·清除能力之間線性關(guān)系顯著，與DPPH·清除能力、總還原能力、蛋白質(zhì)含量之間線性相關(guān)性極顯著[25]，與其他活性指標間的相關(guān)性不明顯。發(fā)酵時間對蛋白質(zhì)含量和多酚含量影響的評價方法中，蛋白質(zhì)含量與ABTS+·清除能力、總還原能力之間線性關(guān)系顯著(P<0.05)；多酚含量與O2-·的清除能力之間線性關(guān)系極顯著(P<0.01)，與其他活性指標間無明顯相關(guān)性。pH值對紫蘇發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量和多酚含量影響中，蛋白質(zhì)含量與DPPH·、ABTS+·、O2-·清除能力之間線性關(guān)系顯著(P<0.05)，與·OH清除能力和總還原能力的線性關(guān)系極顯著(P<0.01)；多酚含量與·OH、ABTS+·、O2-·清除能力之間線性關(guān)系顯著(P<0.05)，與蛋白質(zhì)含量的線性關(guān)系極顯著(P<0.01)，與其他指標相關(guān)性不顯著。發(fā)酵溫度對蛋白質(zhì)含量和多酚含量影響的評價方法中，與文獻[30]的結(jié)果類似，蛋白質(zhì)含量與·OH、ABTS+·清除能力之間的線性關(guān)系顯著(P<0.05)，與O2-·清除能力的線性關(guān)系極顯著(P<0.01)；多酚含量與總還原能力、蛋白質(zhì)含量之間線性關(guān)系顯著(P<0.05)，與O2-·清除能力的線性關(guān)系極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

采用酵母菌和雙歧桿菌對紫蘇粕進行混菌發(fā)酵，以紫蘇粕發(fā)酵上清液的抗氧化活性為指標，確定混菌發(fā)酵的條件，并測定發(fā)酵后多酚含量和蛋白質(zhì)含量的變化。結(jié)果表明，經(jīng)過混菌發(fā)酵后，紫蘇粕清除自由基能力在不同的菌種比、料液比、發(fā)酵時間、pH和發(fā)酵溫度條件下均發(fā)生了明顯的變化，在酵母菌與雙歧桿菌的復(fù)配比為2∶1、料液比為1∶1、pH為7.0、發(fā)酵溫度為32 ℃、發(fā)酵時間為48 h時，紫蘇粕發(fā)酵上清液中蛋白質(zhì)含量可達1.33 mg/g；多酚含量達到20.82 mg/g；對DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·的清除能力分別為69.51%、74.54%、71.36%、85.11%，表明采用混菌發(fā)酵紫蘇餅粕具有較強的抗氧化能力，為紫蘇加工副產(chǎn)物的綜合利用提供了參考。