邵慧娟, 李初誼, 于曉輝, 張久聰

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學, 甘肅 蘭州, 730000; 2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院 消化內科, 甘肅 蘭州, 730050)

幽門螺桿菌(Hp)是一種螺旋形、微需氧、有鞭毛的革蘭氏陰性桿菌，主要定植于胃的黏液層，部分也可附著于分泌黏液的胃上皮細胞表面。2015年《京都全球幽門螺桿菌胃炎共識報告》[1]將Hp引起的胃炎定義為一種感染性疾病，具有傳染性和致病性。機體感染Hp可引起慢性胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、胃癌等疾病[2], 根除Hp不僅可減輕患者的癥狀，最大限度地降低感染嚴重并發(fā)癥的風險，同時降低胃癌發(fā)生率[3-4]。Maastricht V/Florence共識[5]已將Hp感染者的根除治療范圍擴大至無癥狀感染者。目前，中國Hp的根除治療以至少2種抗生素為主，主要有克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮、四環(huán)素等，但隨著抗生素的廣泛使用, Hp對抗生素的耐藥性也易導致治療失敗，研究[6]發(fā)現主要耐藥機制為抗菌靶基因發(fā)生突變可使細菌逃避抗菌藥物的作用。本研究就Hp對抗生素耐藥的分子機制、新型檢測及治療方案進行綜述。

1 Hp耐藥機制

目前報道Hp的感染率在全球范圍內超過50%[7], 同時Hp對抗生素的耐藥率逐年上升，以克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑最為顯著，研究[8]表明印度和中國在亞洲地區(qū)都出現了克拉霉素的高水平耐藥，中國對克拉霉素的耐藥率普遍較高，多在20%以上。KOCSMR é等[9]發(fā)現在克拉霉素初治的Hp感染者中, 5.5%的患者出現耐藥; 在原發(fā)性耐藥中, 98.7%起源于耐藥菌株的感染, 1.3%來自于耐藥基因的突變，并且性別差異不顯著; 在繼發(fā)性耐藥中，克拉霉素的耐藥率與患者的性別、年齡相關。由于甲硝唑可廣泛用于治療各種感染，如厭氧菌和寄生蟲感染、腹瀉、牙科和婦科疾病等，導致甲硝唑出現高耐藥率，多數地區(qū)高達40%以上[8]。中國的一項多中心研究[10]得出，2010—2016年Hp對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四環(huán)素的初次耐藥率分別為78.2%、22.1%、19.2%、3.4%和1.9%, 由于克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的高耐藥率，使得標準三聯(lián)療法的效果大大降低[11]。因此，對Hp感染者耐藥狀況進行監(jiān)測并實施個體化治療已成為必要，但目前對中國人群Hp耐藥的大規(guī)模、多區(qū)域研究還不夠充分。

2 耐藥基因突變位點

2.1 克拉霉素

克拉霉素屬于大環(huán)內酯類抗生素，其抑菌機制主要是與細菌核糖體50 s亞基結合，通過阻斷轉肽作用及mRNA的移位而抑制Hp蛋白質的合成。近年來Hp對克拉霉素產生耐藥，且多為Hp的23SrRNA的V區(qū)發(fā)生點突變，使核糖體的構象發(fā)生變化，進而改變結合位點，使二者親和力減弱，不能很好地抑制Hp蛋白質的合成，導致根除治療失敗。

研究[12]進一步證實Hp對克拉霉素耐藥最常見的點突變是23SrRNA基因V區(qū)的A2142G和A2143G。在一項回顧性研究[13]中發(fā)現A2142G點突變率為37.7%, 其中A2143G單突變最常見，其次是A2142G和雙點突變，并指出在A2142G突變組中三聯(lián)與四聯(lián)療法的有效率無顯著差異，但在A2143G或A2142G和A2143G同時突變時，三聯(lián)和四聯(lián)療法的根治率分別為25.8%和92.1%(P<0.001), 可見針對A2143G突變者，四聯(lián)療法顯著優(yōu)于三聯(lián)療法[14]。PARK C G等[15]對295例Hp感染者菌株的23SrRNA行DNA測序分析，發(fā)現A2143G是最常見的點突變(24.7%), 其次是A2182T突變(11.5%), 攜帶A2143G者克拉霉素三聯(lián)療法根除失敗率高達60%, 表明A2143G是Hp根除失敗的高危突變基因，并且A2143G的存在與既往根除病史和性別有關，因此提出基于23SrRNA基因的個體化治療可提高根除成功率。

2.2 甲硝唑

甲硝唑屬于硝基咪唑類藥物，研究[16-17]表明Hp對甲硝唑產生耐藥性主要與RdxA和FrxA基因失活有關，其中RdxA基因編碼對氧不敏感的NADPH硝基還原酶,FrxA基因編碼黃素氧化還原酶。LEE S M等[18]研究發(fā)現, RdxA的無義突變降低了Hp的根除效果(P=0.009), 并且與RdxA(+)FrxA(+)相比，在二者基因均不表達的耐藥菌株中, hefA表達顯著升高 (P<0.001), 這表明hefA可能參與甲硝唑的耐藥。有研究[19]發(fā)現RpsU基因參與Hp菌體蛋白質合成的同時也與甲硝唑耐藥相關。

此外，在甲硝唑耐藥和敏感的菌株中均發(fā)現大量RdxA的錯義突變，且FrxA突變僅在RdxA突變存在時增強Hp的耐藥性[20]。值得注意的是，除了無義突變和移碼突變外, RdxA中的氨基酸替換包括R16H、Y46H、P51L和A67V, 已被報道為可能導致甲硝唑耐藥的原因[21], 這表明很難通過檢測基因突變位點來識別甲硝唑的耐藥性，限制了PCR在檢測甲硝唑耐藥方面的應用。因此, Hp對甲硝唑耐藥可能還存在其他未知的突變位點[22], 對其耐藥基因還需進一步深入研究。

2.3 左氧氟沙星

左氧氟沙星是一種廣譜抗生素，屬于第3代喹諾酮類藥物，主要通過抑制細菌DNA回旋酶的活性來抗Hp, 阻斷細菌DNA的合成和復制，從而產生殺菌作用。DNA回旋酶由2個亞基組成，即gyrA和gyrB, 且分別由gyrA基因和gyrB基因編碼。研究[23]報道gyrA發(fā)生點突變導致gyrA空間構象改變，使左氧氟沙星不能結合gyrA, 阻斷了抑制Hp基因組的復制而導致耐藥。目前已確定gyrA基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的Asn87和Asp91點突變與左氧氟沙星產生耐藥相關[24-26]。另外，還有gyrA的其他突變位點包括Ala88、Ala97和Met191, 以及gyrB的Phe438、Glu463、Asp481和Arg484突變[27]。YE L P等[28]發(fā)現gyrA的Asn87較Asp91突變對左氧氟沙星可產生更強的耐藥性，二者同時突變進一步增強耐藥性，而gyrB中Asp481和Arg484同時突變則不會明顯增強耐藥性。

2.4 阿莫西林

阿莫西林通過與青霉素結合蛋白(PBPs)結合來抑制Hp細胞壁的合成，從而抑制細菌的生長[29]。近年來隨著阿莫西林用量的逐漸增加，根除治療失敗后全球Hp菌株對阿莫西林耐藥性有所增加[30]。研究[31]報道導致阿莫西林對Hp產生低到中等耐藥性的主要機制是PBP1基因的點突變。KUO C J等[32]研究發(fā)現PBP-1A的C末端區(qū)域存在多個突變。研究[33]表明多數胃黏膜標本在-80 ℃超低溫保存3個月后可檢測出Hp對阿莫西林的耐藥率有所下降，而超低溫保存后PBP1和HEFC基因均未發(fā)現突變，可能與編碼膜結構和轉運功能的相關基因下調有關。值得注意的是, rfaF保守序列的突變率很高，可通過降低細胞膜對藥物的通透性，從而使Hp對抗生素產生耐藥, rfaF突變可導致Hp對阿莫西林、四環(huán)素和克拉霉素耐藥，其中以K331R突變最常見(占突變總數的44.44%)[34]。

2.5 多重耐藥

Hp的多重耐藥問題日益嚴重，其中亞洲國家的多重耐藥率普遍高于西方國家[35]。研究[36]發(fā)現HP0939、HP0497和HP0471轉運蛋白在多重耐藥菌株中高表達，導致Hp對抗生素的外排能力增強，同時抑制生物膜的形成，當這3種轉運蛋白基因敲除時，會增加Hp對多種抗生素的敏感性，說明他們與多重耐藥密切相關。胃黏膜表面形成生物膜是Hp難以根除的重要原因, ZHAO Y C等[37]研究表明中性粒細胞激活蛋白(NAPA、HP0243)促進過氧化氫誘導的生物被膜形成，進而參與Hp的多重耐藥。Hp菌株生物被膜的形成降低了其對阿莫西林和甲硝唑的敏感性[38]。因此，針對Hp生物被膜最低抑菌濃度的研究對開發(fā)根除方案具有重要意義。

此外，藥物外排泵的過度表達也是Hp多重耐藥的原因。外排泵是一種存在于Hp細胞膜上的多藥轉運蛋白，該泵將抗菌藥物輸送出細胞，降低了細胞內抗菌藥物的濃度，從而增加了耐藥性[39]。值得注意的是，研究[40]表明外排泵基因Hp605、Hp971、Hp1327、Hp1489、Hp118和Hp1174的表達在可形成生物膜的Hp中顯著高于浮游細菌，這意味著外排泵和生物膜協(xié)同作用增加Hp的耐藥性。

3 耐藥基因突變位點的檢測

通過檢測Hp耐藥基因突變位點可替代耗時的藥敏試驗。一項利用聚合酶鏈式反應-高分辨熔解曲線(HRM-PCR)對甘肅地區(qū)Hp克拉霉素耐藥表型的檢測發(fā)現，其與傳統(tǒng)E-Test藥敏方法一致性高達96.23%, 或可代替E-Test成為一種便捷、快速的新方法，從而指導臨床用藥。黃聲雷等[41]對上海80例胃黏膜組織標本使用HRM-PCR檢測得出的Hp陽性率為86.2%, 克拉霉素的突變位點主要為23SrRNA第2142或2143位，突變率34.8%, DNA測序法得出Hp陽性率為80.0%, 突變位點主要為A2143G, 兩種方法檢測Hp耐藥基因突變的陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為87.0%、95.1%和92.2%, Kappa系數為0.829, 進一步證明兩者一致性較好。

環(huán)介導的等溫擴增法(LAMP)靈敏度高、反應時間短，與快速尿素酶法(RUT)在檢測Hp方面一致性較高(Kappa值為0.923,P<0.001), 并且LAMP檢測A2182C點突變與DNA測序符合率達97.7%(42/43)[42]。ZHAO Y等[43]研究發(fā)現操作簡便的TaqMan-MGB探針多重實時PCR法在診斷Hp感染的同時可檢測左氧氟沙星和克拉霉素的16SrDNA、23SrDNA、gyrA基因的部分序列和突變位點，結果與金標準Sanger測序的Kappa值均超過90%, 表明該法更適合缺乏技術人員的基層醫(yī)療機構。此外，基因芯片法診斷Hp感染的敏感性、特異性和準確性分別為96.1%、85.0%和93.6%, 同時檢測克拉霉素、左氧氟沙星以及阿莫西林耐藥基因突變位點與DNA測序的一致率均在95%以上[44]。這些新型的、操作簡單的檢測方法有助于臨床醫(yī)生為患者提供個體化的治療，將為耐藥Hp的檢測提供新的視角，有利于避免抗生素濫用，進而抗擊Hp的全球流行。

4 Hp新型治療方案

Hp的根除治療方案主要由抗生素和質子泵抑制劑組成，抗生素在根除病原體方面起主要作用，而PPI則抑制胃酸分泌，從而增強抗生素的效果。三聯(lián)療法由PPI聯(lián)合甲硝唑和阿莫西林或克拉霉素組成，由于Hp對克拉霉素的耐藥率增加，導致該方案療效下降，含鉍劑四聯(lián)療法已被證實是根除Hp的有效方案，特別是在抗生素耐藥的菌株中，大劑量質子泵抑制劑與阿莫西林聯(lián)合治療可減少抗生素的使用。目前隨著抗生素耐藥率的不斷上升，尋找具有抗Hp活性的新型藥物可作為其輔助治療。

標準抗生素聯(lián)合益生菌在治療Hp感染中起重要作用, KEIKHA M等[45]研究表明，益生菌除了可以減輕胃腸道癥狀外，還可以通過改變腸道微生物群來減少抗生素的副作用(尤其是腹瀉)，干酪乳桿菌、瑞氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏酵母菌均能有效抑制Hp感染。乳酸桿菌作為三聯(lián)療法的補充，可提高其療效，減少成人和兒童與療法相關腹瀉的發(fā)生率[46], 路氏乳桿菌作為單一治療可抑制Hp的生長，作為抗生素的佐劑，在提高治愈率的同時減輕胃腸道癥狀[47], 根除Hp可能導致腸道微生物群的多重轉移和改變。然而，補充枯草芽孢桿菌和屎腸球菌則可以保護和恢復腸道微生物群[48]。

一項在體外觀察溫度對Hp和甲硝唑的研究[49]發(fā)現，在41 ℃時, Hp的生長開始受到抑制，并且隨著培養(yǎng)時間延長，抑制作用更加顯著，同時降低了Hp對甲硝唑的耐藥性，其中氧化還原途徑可能是溫度誘導甲硝唑耐藥性變化的潛在驅動因素，同時測序證實了關鍵的耐藥基因RdxA、FrxA和FdxB不會隨著溫度的升高而發(fā)生突變。研究[50-52]表明哺乳動物的胃黏膜可以耐受高達46 ℃的溫度，局部溫度的升高有助于在體內根除Hp, 以此來輔助抗生素的治療。因此，可使用納米材料進行局部光熱/磁熱治療。研究[53]報道了一種口服發(fā)熱納米探針可以在紅外激光照射下靶向殺死動物胃黏膜中的Hp菌株。

磷霉素是一種廣譜抗生素，可抑制Hp細胞壁的合成，對多重耐藥的致病菌株有抗菌活性，磷霉素與克拉霉素、阿莫西林，特別是與甲硝唑聯(lián)合作用于多重耐藥的Hp菌株，可明顯提高抗菌作用[54]。值得注意的是，將罌粟科植物提取物與抗生素相結合，吸附到有機體細菌纖維素載體上，觀察到Hp的生物膜水平顯著下降，表明該化合物可抑制其生物膜的生長[55]。研究[56]發(fā)現芳香鏈霉菌甲醇提取物可作用于Hp耐藥菌株的細胞毒素相關基因，并顯著抑制Hp生長，這為根除Hp的治療提供了一種新的方案。

5 小 結

綜上所述, Hp具有傳染性和致病性, Hp根除治療失敗主要因抗生素耐藥導致，其機制包括抗生素耐藥基因突變、藥物外排泵及生物膜的作用，具體的機制尚不明確。目前治療方案主要以三聯(lián)/四聯(lián)方案為主，益生菌、中藥成分等可作為輔助治療。由于Hp耐藥率的逐年上升，基于藥敏試驗及新型檢測手段來進一步明確Hp耐藥的分子機制十分重要，有助于臨床醫(yī)生為Hp感染者制訂個體化的診療方案。