李永霞 綜述，江 宇 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院呼吸科，重慶 401331)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種病因不明的間質(zhì)性肺疾病，其特征是肺泡上皮細胞及肺成纖維細胞異?；罨鲋?、分泌過多的細胞外基質(zhì)(ECM)，導(dǎo)致進行性呼吸困難、呼吸衰竭甚至死亡。近年來，IPF發(fā)病率呈上升趨勢，目前病因仍不明確，尚無有效的治療及預(yù)防措施，且此病預(yù)后極差，如不進行干預(yù)，確診后的中位生存期僅為2～3年[1]。 因此，明確IPF的發(fā)病機制對尋求有效治療靶點顯得十分必要，更是人類對健康的迫切要求。

1 IPF的發(fā)病機制

目前，IPF的確切發(fā)病機制尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素、遺傳因素、炎性反應(yīng)、病毒感染、氧化應(yīng)激等均在IPF的發(fā)病機制中起著重要作用[2-8]。一些流行病學(xué)研究表明，環(huán)境暴露對IPF的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。IPF的發(fā)病與煙草、二氧化硅、金屬粉塵之間存在顯著相關(guān)性[2]。病毒、真菌和細菌等微生物在IPF的發(fā)病機制中也發(fā)揮了作用。IPF患者與健康人相比，菌群組成較為不平衡[3]。

IPF的發(fā)生也與遺傳和基因型有關(guān)，研究表明高達1/5的IPF患者其家庭成員也患有肺纖維化。IPF中肺成纖維細胞與凋亡有關(guān)的某些凋亡相關(guān)基因的啟動子區(qū)域高度甲基化有關(guān)，低甲基化與p53誘導(dǎo)凋亡的成纖維細胞釋放的應(yīng)激反應(yīng)蛋白TP53INP1上調(diào)有關(guān)[2]。MUC5B也被證明與家族性間質(zhì)性肺炎和散發(fā)性IPF高度相關(guān)。還有報道TERT、TERC等位點也與IPF的發(fā)生密切相關(guān)[2]。作者對IPF表觀遺傳學(xué)的認識不斷增加，這可能會發(fā)現(xiàn)新的治療方法，比如表觀遺傳學(xué)基因調(diào)節(jié)劑的運用，也許可以有效地預(yù)防或延緩肺纖維化的進展。炎性反應(yīng)被認為是IPF發(fā)病的重要組成部分，在整個IPF發(fā)生過程中，特別是早期炎癥階段，多種炎癥因子參與其中，如核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素-8(IL-8)等[4-5]。當(dāng)機體受到損傷時，巨噬細胞立即產(chǎn)生細胞因子參與炎性反應(yīng)，隨后募集成纖維細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞進行修復(fù)，而機體受到持續(xù)性損傷時，可能造成肺上皮細胞受損、炎癥細胞浸潤和細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[5]。

肺組織處于含氧環(huán)境，比其他組織更容易受到氧化應(yīng)激損傷，有研究顯示，氧化、抗氧化機制失衡是IPF發(fā)病機制之一[6-7]。高濃度的活性氧會導(dǎo)致肺泡上皮細胞膜相結(jié)構(gòu)脂質(zhì)雙層的穩(wěn)定性降低，使DNA單鏈斷裂或破壞，促進含硫蛋白質(zhì)的交聯(lián)，使多肽直接斷裂成片段，導(dǎo)致細胞損傷和壞死。壞死細胞釋放出細胞內(nèi)的物質(zhì)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)并產(chǎn)生更多活性氧進一步損傷鄰近組織，可能引起IPF[8]。而其中涉及的DNA損傷也是可能造成IPF發(fā)生、發(fā)展的重要因素，但目前相關(guān)報道較少。

2 DNA損傷修復(fù)與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)

當(dāng)細胞受到外源性或內(nèi)源性因素攻擊時會發(fā)生DNA損傷，DNA損傷方式包括DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂。如果DNA單鏈斷裂不能及時修復(fù)則可能發(fā)展為DNA雙鏈斷裂，且DNA雙鏈斷裂較為嚴重，修復(fù)較慢也較困難，可能引發(fā)細胞功能障礙甚至細胞死亡[9]。

PARP-1是細胞中最豐富的PARP酶，其產(chǎn)生長而分支的多聚二磷酸腺苷核糖(PAR)，共價連接到參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡信號傳導(dǎo)的靶蛋白上。PARP-1與其他DNA損傷修復(fù)蛋白(PARP-2,PARP-3)不同，其N-末端(NTR)較長(≥500個殘基)，且與DNA親和力較高，因此PRAP-1在DNA損傷修復(fù)機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其反應(yīng)快速而有效，被稱為DNA損傷的傳感器。哺乳動物的PARP-1是一種由6個不同結(jié)構(gòu)域組成的酶，不同結(jié)構(gòu)域分別發(fā)揮著DNA結(jié)合、催化和調(diào)節(jié)功能[9]。PARP-1鋅指結(jié)構(gòu)域具有識別DNA損傷功能，這對PARP-1的激活至關(guān)重要。PARP-1的2個同源鋅指結(jié)構(gòu)域F1和F2識別損傷的DNA，F(xiàn)1是PARP-1激活的核心參與者，F(xiàn)2在PARP-1激活中的確切作用尚不清楚。研究表明，F(xiàn)1和F2與DNA的相互作用相似，但F1和F2對DNA的親和力并不相同，F(xiàn)1的DNA親和力明顯低于F2，但F1對PARP-1的DNA損傷依賴性激活至關(guān)重要，而F2對PARP-1的激活可有可無，F(xiàn)2對DNA的高結(jié)合親和力表明F2對PARP-1定位和DNA斷裂的維持有重要作用。鋅指結(jié)構(gòu)域F3不直接與DNA結(jié)合，但其對PARP-1激活也很重要，其包含介導(dǎo)結(jié)構(gòu)域間接觸的關(guān)鍵殘基，并且在DNA損傷依賴性激活時對PARP-1組裝至關(guān)重要[9]。PARP-1激活導(dǎo)致PARP-1結(jié)構(gòu)塌陷，其中鋅指結(jié)構(gòu)域F1和F3、WGR結(jié)構(gòu)域和催化(CAT)結(jié)構(gòu)域共同與受損DNA結(jié)合。CAT結(jié)構(gòu)域包括2個子結(jié)構(gòu)域：螺旋(HD)結(jié)構(gòu)域和ART結(jié)構(gòu)域。WGR結(jié)構(gòu)域是一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于CAT結(jié)構(gòu)域附近，與5′-磷酸化位點結(jié)合，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)HD結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，參與DNA損傷依賴性激活[10]。

PAR以輔酶I(NAD+)為底物，由PARPs合成，在細胞應(yīng)激反應(yīng)中最常見。在DNA損傷時，PARP-1以NAD +作為底物，催化單腺苷核糖或PAR與各種受體蛋白結(jié)合，這是響應(yīng)DNA損傷的最早事件[11]。隨后DNA修復(fù)蛋白和核酸酶被招募到損傷部位，進行DNA損傷修復(fù)。PRAP-1對DNA單鏈斷裂及DNA雙鏈斷裂均可進行修復(fù)，其參與DNA損傷修復(fù)的方式有多種，主要包括同源重組、非同源末端結(jié)合、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)(BER)和核苷酸切除修復(fù)[12]。其中最常見的是PARP-1通過BER參與DNA單鏈斷裂修復(fù)，當(dāng)DNA在各種因素作用下(如烷化劑)發(fā)生單鏈斷裂，PARP-1能迅速識別這些斷裂，識別并結(jié)合在DNA單鏈缺口上，介導(dǎo)支架蛋白XRCC1聚集，在斷裂部位與其他核心因子(如DNA連接酶Ⅲ和DNA聚合酶β等)組裝，以進行DNA損傷修復(fù)[13]。PARP-1如何參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)目前仍不清楚。現(xiàn)報道關(guān)于PARP-1參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的機制有2種：第一種是PARP-1通過參與同源重組修復(fù)直接調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂修復(fù)，第二種是PARP-1通過BER等參與DNA單鏈斷裂修復(fù)，間接影響DNA雙鏈斷裂修復(fù)[12]。

PARP-1對DNA損傷修復(fù)有重要意義，DNA損傷較輕微時，PARP-1激活可促進DNA修復(fù)，維持了細胞的完整性，使細胞得以存活。抑制PARP-1的活性可使DNA損傷無法及時得到修復(fù)，出現(xiàn)損傷加重甚至DNA雙鏈斷裂等嚴重情況，最終造成染色體不穩(wěn)導(dǎo)致細胞凋亡或壞死[14]。目前，PARP-1抑制劑已被用于臨床，可以作為化療藥物、免疫治療和放射治療的增強劑[14]。PARP-1抑制劑的靶向治療目前在臨床上也被廣泛運用于治療惡性腫瘤，如乳腺癌和卵巢癌。在小細胞肺癌(SCLC)中，在臨床前模型中，PARP-1抑制劑和基于鉑的化療相結(jié)合顯示出優(yōu)于單獨化療的療效[15]。PARP-1抑制劑的出現(xiàn)改變了醫(yī)生對各種惡性腫瘤患者的臨床管理方式，給腫瘤患者帶來了新的治療方案選擇，對改善患者預(yù)后及延長生存期有一定幫助，但PARP-1抑制劑這些藥物的長期毒性還需要進一步深入研究。

3 PARP-1與NF-κB

免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的生理過程，對維持生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要意義。沒有免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，機體就無法在充滿病原體的世界中生存。炎性反應(yīng)由一系列復(fù)雜的炎癥介質(zhì)參與，各種炎癥因子緊密協(xié)調(diào)才能維持機體適當(dāng)和及時的反應(yīng)，不會出現(xiàn)可能對宿主造成損害的過度反應(yīng)。如果長期存在不適當(dāng)或過度免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，機體將因這些生理反應(yīng)造成損害，甚至死亡。因此，促炎和抗炎機制必須維持平衡，人體才能在引發(fā)免疫和炎性反應(yīng)的環(huán)境刺激下生存。人體內(nèi)有許多機制來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。NF-κB長期以來一直被視為炎性反應(yīng)過程中的中心介質(zhì)。NF-κB對免疫和炎性反應(yīng)中涉及的多種基因表達的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用，包括細胞因子、細胞黏附分子、補體因子和多種免疫受體[16-17]。

目前，研究最多形式的NF-κB是由2個亞基p50(NF-κB1)和p65(RelA)組成的異二聚體。細胞未受到刺激時，NF-κB與細胞質(zhì)中的κB蛋白抑制劑(IκB)結(jié)合處于未激活狀態(tài)，當(dāng)細胞受到細胞因子[如IL-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂多糖等]、紫外線、氧化劑等刺激，絲氨酸/蘇氨酸激酶誘導(dǎo)IκB磷酸化，隨后發(fā)生降解，IκB降解后會釋放NF-κB二聚體并暴露p50和p65的核定位序列，導(dǎo)致NF-κB移位進入細胞核，與染色質(zhì)中特定κB共有序列結(jié)合，并激活特定的基因亞群，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB的激活可誘導(dǎo)趨化因子(MCP-1)、細胞因子(TNF-α、IL-6)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)炎性反應(yīng)和纖維化的發(fā)生[17-18]。

許多報道表明，PARP-1在NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中有重要作用。PARP-1可調(diào)節(jié)NF-κB等炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)和增強NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，進一步促進TNF-α、IL-1β和IL-6等多種炎癥因子的表達，NF-κB途徑是PARP-1調(diào)節(jié)炎癥的中心途徑[19-20]。PARP-1基因敲除動物或PARP-1抑制劑已被證明可減少炎性反應(yīng)[21]。有報道表明在急性髓系白血病患者治療中，PARP-1抑制劑奧拉帕尼可以減弱NF-κB途徑的活性，并降低蒽環(huán)類抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)[22]。近年來，PARP-1也被報道是特異性NF-κB依賴性基因激活所必需的，在體內(nèi)可作為NF-κB的共激活劑，PARP-1通過不同的結(jié)構(gòu)域與NF-κB的2個亞基(p65和p50)相互作用，并在體內(nèi)與p50和p65一起形成穩(wěn)定的免疫可沉淀核復(fù)合物，從而在炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用[23]。還有一些研究表明，持續(xù)的DNA損傷可導(dǎo)致PARP-1過度激活，導(dǎo)致細胞NAD+的耗竭，而NAD+再合成會導(dǎo)致細胞三磷酸腺苷儲備耗盡，使能量代謝受損，細胞和線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細胞壞死。其中DNA損傷導(dǎo)致的PARP-1過度激活可以產(chǎn)生炎癥反饋環(huán)，PARP-1通過調(diào)節(jié)NF-κB的表達促進NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，NF-κB通路的激活提高誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的水平，從而增加體內(nèi)一氧化氮(NO)的生成，導(dǎo)致嚴重的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激增加時產(chǎn)生的自由基過氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致細胞膜破壞，最終可能導(dǎo)致細胞死亡[24]。

4 NF-κB、TGF-β1與IPF

TGF-β是一種多功能細胞因子，參與多種生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)各種細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移，如巨噬細胞、活化的T細胞和B細胞、未成熟的造血細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。TGF-β由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3異構(gòu)體組成，盡管3種TGF-β亞型結(jié)構(gòu)相似，但它們介導(dǎo)不同的生物學(xué)反應(yīng)。因其細胞組織特異性表達，它們分別與特定的分子和受體的特異性結(jié)合發(fā)揮作用。除了生理效應(yīng)外，TGF-β已被證明在免疫調(diào)節(jié)疾病的發(fā)病機制中起重要作用。TGF-β1是一種抗炎因子，對正常發(fā)育、組織修復(fù)和維持器官功能至關(guān)重要，在組織損傷時TGF-β1會發(fā)生上調(diào)[25]。TGF-β1的上調(diào)發(fā)生在許多炎癥性肺疾病中，例如慢性阻塞性肺疾病、哮喘和IPF。多種促炎細胞因子可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(如IL-1β、TNF-α等)，TGF-β1作為NF-κB的下游因子，活化的 NF-κB可增加 TGF-β1的表達。TGF-β1啟動子上存在AP-1和NF-κB結(jié)合位點，在IL-1β的刺激下，p65 NF-κB和c-jun AP-1被招募到TGF-β1啟動子的特定結(jié)合位點(κB3位點)，隨后組蛋白H4和H3在TGF-β1啟動子的不同區(qū)域高度乙?；?，最后導(dǎo)致TGF-β1活化參與炎性反應(yīng)和纖維化的發(fā)生、發(fā)展[26]。

研究表明，TGF-β1在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中起到十分重要的作用。在多種因素導(dǎo)致的肺纖維化中(包括博來霉素、環(huán)磷酰胺和射線)均發(fā)現(xiàn)TGF-β1含量增高，并且目前認為TGF-β1是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。其在肺纖維化中的主要作用：趨化并促進成纖維細胞；刺激成纖維細胞合成大量合成膠原蛋白；趨化炎性細胞及單核巨噬細胞，合成釋放細胞因子；誘導(dǎo)肺泡上皮細胞過度增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而導(dǎo)致ECM調(diào)控失衡ECM沉積。TGF-β信號傳導(dǎo)可分為Smad依賴性途徑和非Smad依賴性途徑。TGF-β1的促纖維化作用主要是通過Smads途徑來完成的[27]。

TGF-β通過與受體復(fù)合物結(jié)合啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，受體復(fù)合物包含2種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，稱為轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅰ型(TGFβRⅠ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ型(TGFβRⅡ)。TGFβRⅡ是一種組成性活性激酶，而TGFβRⅠ激酶需要被TGFβRⅡ激酶激活。在大多數(shù)細胞類型中，TGF-β直接與TGF-βRⅡ結(jié)合。TGFβRⅡ結(jié)合的TGF-β隨后被TGFβRⅠ識別，后者被招募到復(fù)合物中，并被TGFβRⅡ磷酸化。目前已知的有三類Smads，包括受體調(diào)節(jié)型Smads(R-Smads)、共同介導(dǎo)型Smads(CoSmads)和抑制型Smads(I-Smads)。Smad1、Smad3、Smad5和Smad8屬于R-Smads，它們可以通過磷酸化TGFβRⅠ直接被激活，與Smad4形成異源低聚復(fù)合物。Smad6和Smad7屬于I-Smads，它們可通過與TGF-βRⅠ相互作用來調(diào)節(jié)R-Smads的活性，主要阻止R-Smads磷酸化并通過泛素蛋白酶降解途徑將其降解[27]。TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分兩步：即TGF-β1與其受體結(jié)合及受體的活化和Smads蛋白的激活。在細胞外，大多數(shù)TGF-β1處于潛在的形式，或者以潛伏相關(guān)肽(LAP)的形式保持失活狀態(tài)。活化后TGF-β1從LAP上釋放，以同源二聚體形式與TGF-βRⅡ結(jié)合，同時與Ⅰ型受體結(jié)合導(dǎo)致受體異質(zhì)二聚體的激活，啟動下游信號通路?；罨腡GF-βRⅠ使Smad2和Smad3分子磷酸化，Smad2、Smad3與Smad4分子結(jié)合，形成Smad復(fù)合物轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與各種轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。最終導(dǎo)致目標基因的激活，參與細胞分化、增殖、遷移、EMT等，而Smad7對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均起抑制作用，因此有人認為Smad7的上調(diào)可能是潛在TGF-β1保護細胞免受炎癥侵襲和纖維化的重要機制[27-28]。Smad還可與包括NF-κB在內(nèi)的其他細胞因子相互作用，以調(diào)節(jié)炎癥和纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

目前認為持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)是肺纖維化發(fā)展的驅(qū)動力，因為其啟動了纖維化階段。NF-κB在炎癥中起著非常重要的作用，參與炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，通過調(diào)節(jié)其靶炎癥細胞因子、黏附分子和促炎酶促進肺組織的纖維化。活化的NF-κB還可以通過提高其下游TGF-β1的水平，進一步促進肺纖維化的發(fā)生。因此，NF-κB信號通路通過炎性反應(yīng)參與了IPF的病理生理過程。

總之，TGF-β/Smad信號和NF-κB途徑是介導(dǎo)IPF發(fā)生、發(fā)展的重要途徑。

5 小 結(jié)

越來越多的證據(jù)顯示，DNA損傷及修復(fù)可能導(dǎo)致IPF的發(fā)生、發(fā)展，當(dāng)發(fā)生DNA損傷時，PARP-1立即識別并與缺口處結(jié)合，募集多種細胞因子進行修復(fù)，同時也會發(fā)生炎性反應(yīng)，NF-κB作為PARP-1的共激活因子也參與其中，并且NF-κB可通過激活下游分子TGF-β1進一步促進纖維化的發(fā)生。目前，IPF還沒有有效的治療方法，在理論上，作用于上述細胞因子及其信號通路的藥物聯(lián)合應(yīng)用可能為IPF提供了新的治療途徑和機會。因此，建立與臨床病程相匹配的肺纖維化動物模型是進一步尋找潛在治療藥物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。