藍彩碧，李 杰，賴俊翔，3，許銘本，3

（1.廣西科學院，廣西 南寧 530007；2.廣西近海海洋環(huán)境科學重點實驗室（廣西海洋科學院），廣西 南寧530007；3.北部灣海洋產業(yè)研究院，廣西 防城港 538001）

2011年11 月，我國北部灣海域首次暴發(fā)大規(guī)模棕囊藻赤潮，之后幾年呈持續(xù)暴發(fā)的狀態(tài)，尤其是2014年至2015年棕囊藻赤潮在多地暴發(fā)，2015年幾乎覆蓋整個北部灣海域，對海洋環(huán)境、旅游業(yè)、水產養(yǎng)殖業(yè)及核電安全造成嚴重影響[1-3]。研究人員將潿洲島、欽州灣和防城港海域采集到的樣品進行分離純化，通過電鏡掃描及分子生物學等方式確認為球形棕囊藻[1，4-5]。

球形棕囊藻是海洋里為數(shù)不多存在表型可塑性的微藻，即同樣的基因型可以表現(xiàn)出不同的表型現(xiàn)象：群體形態(tài)和單細胞態(tài)。球形棕囊藻廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域，在調節(jié)碳和硫的生物地球化學循環(huán)及全球氣候方面有重要的地位[6-8]。在赤潮暴發(fā)期間，球形棕囊藻一般以囊體的形態(tài)存在。在水體中形成的囊體結構會堵塞魚類的鰓部，造成魚類缺氧死亡。赤潮衰退后，囊體破裂，在透明胞外聚合顆粒物作用下，形成高碳含量的泡沫留在海水表層和灘涂上，會影響沿岸海水養(yǎng)殖業(yè)及核電設施的取水安全[9-10]。

透明胞外聚合顆粒物是一種能被阿利新藍染色由酸性多糖組成的膠質狀顆粒物[11]，是胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS） 的子形式，大多數(shù)浮游植物細胞由于主動釋放或者裂解外溢形成的微纖維EPS 通過起泡或者凝結等方式形成TEP。TEP 的形成是溶解性有機碳轉變?yōu)轭w粒有機碳的主要步驟，被認為是海洋生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要組成部分[12-13]。浮游植物產生EPS 會受營養(yǎng)鹽、溫度、光照、重金屬濃度及氧含量等多種因素的影響，而且還具有種間的特異性[14]。目前對于微藻分泌EPS 與營養(yǎng)鹽的關系的研究大多集中于硅藻，關于營養(yǎng)鹽限制對棕囊藻分泌多糖的影響的研究雖然較少，但也有學者開展了研究。比如MARI X 等[15]的圍隔實驗表明，球形棕囊藻的TEP 釋放是會受到營養(yǎng)鹽的缺乏所驅動，尤其在磷限制的情況下，球形棕囊藻會比在氮限制的情況釋放更多的TEP。對于以囊體形態(tài)形成赤潮的球形棕囊藻而言，囊體結構可以說是TEP 的一大來源，尤其是囊體衰敗后，可以直接釋放出TEP。因此，球形棕囊藻赤潮消退時，除了巨大生物量消亡影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能，赤潮衰亡過程還釋放的大量TEP 等黏性多糖物質也會對水體碳循環(huán)過程產生重要影響。TEP 被認為是球形棕囊藻赤潮除生物體細胞外的另一種形式有機碳匯。

磷是海洋浮游植物生長必需的營養(yǎng)元素，是限制海洋初級生產力水平的關鍵因子。楊靜等[16]通過梳理1990—2014年北部灣近岸海域監(jiān)測數(shù)據(jù)，結果表明北部灣海域長期為磷限制狀態(tài)，特別是欽州灣內、廉州灣及大風江口的氮磷比分別高達202 ∶1、132 ∶1、142 ∶1、224 ∶1。若磷污染增高時可能會引發(fā)水體富營養(yǎng)化。在對球形棕囊藻的營養(yǎng)鹽需求研究中發(fā)現(xiàn)，球形棕囊藻對磷酸鹽具有較高的營養(yǎng)需求，磷是球形棕囊藻首要限制因子[17-18]。許多研究者圍繞磷營養(yǎng)鹽限制對球形棕囊藻生長的影響開展了研究。王艷等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺磷的情況下，球形棕囊藻的生長嚴重受阻，甚至無法形成正常的生長曲線。田晶晶[19]的研究表明，磷限制會抑制球形棕囊藻細胞形成囊體。此外，在缺磷條件下，球形棕囊藻的生長速率要顯著低于富磷條件下[20]。這些研究表明磷的限制會對球形棕囊藻的生長產生抑制作用，但均未考慮球形棕囊藻TEP 釋放的情況，無法全面地評價在磷營養(yǎng)限制的情況下，對球形棕囊藻生長、形態(tài)變化和TEP 釋放的影響，以及球形棕囊藻赤潮對水體環(huán)境的影響。

本文通過研究球形棕囊藻在磷營養(yǎng)限制條件下細胞的生長、細胞形態(tài)、TEP 生產量等的變化，探討球形棕囊藻細胞對磷營養(yǎng)限制的響應及磷營養(yǎng)限制與藻細胞TEP 分泌之間的關系，為闡明球形棕囊藻赤潮生消機制和其對海洋生態(tài)系統(tǒng)結構的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

球形棕囊藻藻株于2016年采自欽州灣近岸赤潮發(fā)生海域，純種培養(yǎng)，保存于廣西海洋科學院微藻種質資源庫，編號BBW-PG02。藻液預培養(yǎng)：采用f/10 培養(yǎng)基，設置溫度為20 ℃，鹽度為30‰，光照強度為80 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h ∶12 h。實驗開始前，取指數(shù)生長期的球形棕囊藻藻液，在自然重力作用下經孔徑為10 μm 的篩絹過濾2 次去除囊體，收集游離的球形棕囊藻單細胞用于接種。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設置

設置1 個對照組和2 個實驗處理組，分別是磷限制組1、磷限制組2。采用f/10 培養(yǎng)基，設置硝酸鹽濃度為116.18 μmol/L，以Redfield 值為基礎，調整磷酸鹽濃度使氮磷比分別為16 ∶1、32 ∶1、64 ∶1，其他營養(yǎng)組分不變，每個實驗組設3 個平行（表1）。將球形棕囊藻單細胞接種至9 個玻璃錐形瓶中，設置初始細胞密度為1000 cells/mL，使培養(yǎng)液終體積為2000 mL。其他的實驗培養(yǎng)條件與預培養(yǎng)條件一致。實驗周期為33 天，每隔2 天取1次樣品。

表1 磷營養(yǎng)鹽限制實驗組的氮磷比率

1.2.2 囊體密度、囊體直徑、囊體細胞數(shù)、單細胞數(shù)的測定

將藻液搖勻后，取總體積為80～100 mL 的藻液樣品于樣品瓶中，從中取1 mL 藻液于1.5 mL 的離心管中，加魯哥氏劑固定使終濃度為5%，用浮游植物計數(shù)框在Nikon ECLIPSE Ti 熒光倒置顯微鏡下進行計數(shù)，記錄單細胞密度。當出現(xiàn)囊體時，取2 mL 藻液于24 孔板，在Nikon ECLIPSE Ti 熒光倒置顯微鏡下，隨機選取視野中的囊體，多于30 個只計數(shù)30 個囊體，數(shù)量少于30 全部計數(shù)，利用萬深藻類計數(shù)系統(tǒng)進行囊體數(shù)量、單位面積囊體表面細胞數(shù)的計數(shù)，以及囊體直徑的測量。

1.2.3 葉綠素a 與營養(yǎng)鹽的測定

取20～30 mL 的藻液，用GF/F 濾膜（經450 ℃，3 h 燒灼） 過濾，分別收集濾膜和濾液于-20 ℃冷凍保存，用于測定葉綠素a、硝酸鹽和磷酸鹽。用紫外分光光度法測定葉綠素a 樣品在664 nm、647 nm、630 nm、750 nm 波長下的吸光值，并通過公式計算出葉綠素a 的濃度[21]。濾液解凍后用Skalar San++營養(yǎng)鹽連續(xù)流動分析儀測定硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽濃度。

1.2.4 TEP 濃度的測定

每瓶取15 mL 新鮮藻液，用孔徑為0.4 μm 的聚碳酸酯濾膜（Waterman） 過濾，注意負壓不能超過0.02 MPa，加入0.5 mL 含量為0.02%愛爾新藍染色劑（pH 值為2.5，醋酸含量為0.06%），快速地對濾膜進行染色。然后用1 mL 超純水分2 次進行洗滌。將濾膜轉移到10 mL 玻璃比色管中，加入6 mL 80%的硫酸溶液，浸泡2 h，期間每隔半小時輕輕搖勻，使TEP 充分酸化。隨后用紫外可見光分光光度計在787 nm 波長下測定樣品的吸光值。同時用黃原膠做標準曲線計算出TEP 含量[22]。

1.3 統(tǒng)計分析方法

應用SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（one way-ANOVA） 對球形棕囊藻的囊體直徑、囊體密度、囊體表面細胞密度、細胞密度和葉綠素a 含量進行組間差異性分析。采用ttest 對球形棕囊藻衰亡期的TEP 產量進行差異分析。設置顯著性水平為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)液中氮磷營養(yǎng)鹽濃度變化情況

培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽濃度變化如圖1 所示。自實驗開始后，控制組和磷限制組1 培養(yǎng)液中硝酸鹽被快速消耗?？刂平M和磷限制組培養(yǎng)液中硝酸鹽濃度均在第21 天后趨向穩(wěn)定。控制組培養(yǎng)液中的硝酸鹽濃度于第21 天后基本消耗殆盡，顯著低于磷限制組1 和磷限制組2?？刂平M、磷限制組1 和磷限制組2 培養(yǎng)液中磷酸鹽消耗濃度范圍分別為5.63±0.14 μmol/L、2.87±0.15 μmol/L 和1.40±0.00 μmol/L。如圖1（b）所示，整個培養(yǎng)過程，磷限制組1 和磷限制組2 的磷酸鹽濃度都顯著低于控制組。

圖1 硝酸鹽濃度和磷酸鹽濃度變化情況

2.2 磷限制條件下球形棕囊藻的生長情況

2.2.1 葉綠素a 含量和細胞密度的變化

在磷限制條件下，球形棕囊藻細胞豐度和葉綠素a 含量變化結果如圖2 所示。各處理組球形棕囊藻細胞葉綠素a 含量均在第15 天達到最大值，其中磷限制組1 和控制組藻細胞葉綠素a 含量相近，分別為104.42±6.67 μg/L、109.56±15.98 μg/L，如圖2（a）所示；而磷限制組2 葉綠素a 含量為66.46±2.81 μg/L，顯著低于控制組（p＜0.05）。第15 天以后，兩個磷限制組1 和磷限制2 的葉綠素a 含量開始迅速下降，第30 天以后低于檢測限，顯著低于控制組的葉綠素a 含量（p ＜0.05）。培養(yǎng)液中球形棕囊藻總細胞豐度變化見圖2（b），控制組的最高細胞密度達到（821.30±150.74）×103cells·mL-1，磷限制1 組和限制2 組的最高密度分別是（630.56 ±93.36）×103cells·mL-1、（356.98±24.20）×103cells·mL-1。與葉綠素a 含量變化趨勢相似，到培養(yǎng)的第30 天和第33 天時，在顯微鏡下基本未觀察到棕囊藻細胞，顯著低于控制組的細胞密度（p＜0.05）。此外，從圖2 還可以看出，在對數(shù)期，磷限制組1的生長速率高于控制組和磷限制組2，而磷限制組2 則低于控制組。

圖2 球形棕囊藻葉綠素a 含量和細胞豐度變化

2.2.2 磷限制條件下球形棕囊藻囊體數(shù)量及形態(tài)特征

各處理組培養(yǎng)液中囊體密度、囊體直徑和囊體表面細胞密度變化情況如圖3 所示。實驗結果顯示，對照組與實驗組培養(yǎng)液中球形棕囊藻都能形成囊體。整個實驗期磷限制組1 和磷限制組2 培養(yǎng)液中囊體密度均低于控制組，但磷限制組1 和磷限制組2 之間并無顯著差異（p>0.05）?？刂平M、磷限制組1 和磷限制組2 培養(yǎng)液中囊體平均直徑范圍分別是99.70±3.98 ～422.80±58.31 μm、163.50±24.26 ～398.16±10.32 μm 和120.76±21.98 ～353.21±30.73 μm。差異分析結果顯示，各組間囊體直徑差異不顯著（p>0.05）。如圖3（c）所示，培養(yǎng)液中囊體表面細胞密度從第15 天后逐漸下降。第30 和33天，磷限制組1 和磷限制組2 囊體表面細胞密度基本趨近于0，顯著低于控制組（p＜0.05），與培養(yǎng)液中葉綠素a 含量和棕囊藻細胞密度變化情況一致。

圖3 磷限制條件下囊體表征變化

2.3 磷限制條件下球形棕囊藻TEP 的含量

如圖4 所示，培養(yǎng)實驗開始后，培養(yǎng)液中TEP濃度隨球形棕囊藻生長緩慢增長，在葉綠素a 含量下降時指數(shù)增長?？刂平M、磷限制組1 和磷限制組2 的TEP 濃度變化范圍分別是45.72±8.60～493.16±22.82 μg·Xeq·L-1、68.94±22.45～453.18±20.15 μg·Xeq·L-1和66.48±11.82～284.06±20.13μg·Xeq·L-1。在第18 天，磷限制組2 培養(yǎng)液中TEP 濃度與控制組和磷限制組1 培養(yǎng)液中TEP 濃度呈顯著差異。如圖4（b）所示，在衰亡期，磷限制組2 的TEP 濃度要顯著低于控制組和磷限制組1（p＜0.05），然而控制組和磷限制組1 之間沒有顯著差異（p＜0.05）。

圖4 磷限制條件下TEP 含量變化及各個時期TEP 含量

3 討 論

3.1 磷限制對球形棕囊藻北部灣株生長的影響

本文通過測定葉綠素a 含量、細胞豐度、囊體密度、囊體表面細胞密度、囊體直徑分析磷限制對球形棕囊藻的生長影響。由培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽變化的趨勢可以看出，化學計量營養(yǎng)鹽限制標準磷限制組1 和磷限制組2 的氮磷營養(yǎng)鹽比值要大于16，同時按浮游植物生長閾值標準（CDIN= 1 μmol/L 和CP=0.1 μmol/L）[23]，在本實驗第27 天后，磷限制組培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度d 低至0.24 μmol/L（圖1），雖略高于浮游植物生長閾值，但球形棕囊藻細胞已處于磷絕對限制環(huán)境。在衰亡期磷限制組1 和磷限制組2 細胞豐度、葉綠素含量及囊體密度顯著低于控制組（p ＜0.05，圖2、圖3） 此外，磷限制組的囊體表面細胞密度要顯著低于控制組（p＜0.05）。這些結果表明磷營養(yǎng)鹽的缺乏，抑制了球形棕囊藻的細胞生長和繁殖。磷元素對海洋浮游植物生長繁殖具有不可替代的生物學作用，是遺傳信息、蛋白質、生物膜的重要組成成分，參與了浮游植物細胞的生長繁殖及能量傳遞等重要的過程[24]。胡章喜等[20]的研究也表明磷限制影響球形棕囊藻細胞的增殖，其特定的生長率少于0.3 d-1。類似的結果也出現(xiàn)在銅綠微囊藻的研究中，HARKE M J 等[25]通過在無磷條件下培養(yǎng)銅綠微囊藻發(fā)現(xiàn)，實驗組的細胞生長速率僅為0.13 d-1，遠低于控制的生長速率0.37 d-1。值得注意的是，從囊體的直徑方面看來，控制組與兩個磷限制實驗組并沒有顯著的差異（p > 0.05）。王艷等[26]的研究也有類似的現(xiàn)象，即磷限制組的囊體直徑與其他實驗組并沒有顯著的差異。這可能是由于磷限制條件下球形棕囊藻細胞物質和能量更多用于多糖物質的分泌而減少細胞的分裂和繁殖。此外，從對數(shù)期的生長速率看，磷限制組1≥控制組＞磷限制組2，且磷限制組1 先于控制組和磷限制組2 進入穩(wěn)定期。這可能是球形棕囊藻的應激反應，使生物量的快速積累，具體過程有待進一步的研究。

3.2 磷限制對球形棕囊藻產生TEP 的影響

球形棕囊藻細胞分泌多糖，而后多糖分子之間通過鹽橋相互連接在一起構建成囊體[27]。球形棕囊藻囊體黏液的主要成分是多糖[28]，且含有酸性基團，可以被阿利新藍染色，因此可以被定性為透明胞外顆粒聚合物[27]。囊體結構衰敗后帶來的碎片可以作為水體中TEP 的直接來源[14]。本文中的TEP 含量變化表明，在衰亡期控制組的TEP 含量與磷限制組1 并無顯著差異（p>0.05），但要顯著高于磷限制組2（p＜0.05）。這說明在一定范圍內的磷限制（氮磷比32 ∶1） 并不會對球形棕囊藻產生TEP 造成阻礙，當磷限制進一步加強時（氮磷比64 ∶1），球形棕囊藻TEP 的產量顯著下降。

研究發(fā)現(xiàn)，磷元素的限制并不會導致藻細胞的EPS 分泌量下降[29-30]，還有研究認為這歸因于藻細胞在不良環(huán)境中產生的應激反應[31]。但磷限制組2的TEP 生產量顯著低于控制組，與REN X Z 等[32]的研究結果一致。該研究中，磷限制（氮磷比25.16 ∶1、52.14 ∶1、128.5 ∶1） 實驗處理組球形棕囊藻EPS 產量低于控制組（氮磷比17.41 ∶1） EPS產量。一方面，可能是磷限制環(huán)境導致細胞胞內環(huán)境的pH 值升高，從而引起卡爾文循環(huán)（Calvin Cycle） 下降；另一方面，實驗結果表明，即使磷限制條件下囊體密度和囊體表面細胞密度下降，但囊體的直徑變化不大（圖3）。我們推測球形棕囊藻的囊體含有大量的碳水化合物，一定程度的磷限制（氮磷比32 ∶1） 降低了細胞生長繁殖，但并不影響碳水化合物分泌；而更高程度的磷限制（氮磷比64 ∶1） 則會阻礙細胞的生長和分泌碳水化合物，從而影響TEP 的釋放。

4 結論

磷限制營養(yǎng)鹽環(huán)境抑制了球形棕囊藻細胞的生長繁殖，主要表現(xiàn)為：生長周期縮短，磷限制組在第30 天時幾乎看不到藻細胞；磷限制組的葉綠素含量、細胞量、囊體密度及囊體表面細胞均小于控制組且衰亡期具有顯著差異。

低磷限制營養(yǎng)鹽環(huán)境即氮磷比為32 ∶1 時，球形棕囊藻的生長和TEP 產量表現(xiàn)出差異性。①低磷限制組在對數(shù)期促進球形總囊藻的生長并先于控制組進入穩(wěn)定期；②低磷限制條件促進TEP 釋放，雖然細胞量占控制組77%，囊體密度占56%，但是TEP 的釋放量仍達到控制組的92%。

高磷限制營養(yǎng)條件下即氮磷比為64 ∶1 時，由于球形棕囊藻的生長受到抑制，間接導致TEP 產量降低，但仍然有43%的生物量和57%的TEP。盡管磷濃度降低，磷限制增強，但是球形棕囊藻形成的生物量和TEP 產量不容忽視。

球形棕囊藻赤潮是廣西沿岸海域，乃至整個北部灣海域的典型的頻發(fā)性有害赤潮。而廣西近岸海域作為常年性的磷限制條件水體，研究磷限制情況下球形棕囊藻的生長及TEP 生產情況對于分析判斷赤潮形勢和評價生態(tài)影響有重要意義。球形棕囊藻在一定程度的磷限制水平情況下，盡管會在細胞生長和囊體豐度上出現(xiàn)下降，但囊體的大小和TEP 的產量并不會受到顯著的影響。當球形棕囊藻在高水平的磷限制情況才會出現(xiàn)TEP 的生產量減少。因此，在廣西北部灣近岸海域水體中，一定程度的磷限制水平可能并不會削弱球形棕囊藻赤潮帶來的危害，即使在磷缺乏的情況下也應對球形棕囊藻赤潮的爆發(fā)風險保持關注。