張?zhí)m俊，張巖，陳煉紅

(西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川，成都，610041)

牦牛是中國青藏高原特有的家畜，也是高原地區(qū)牧民重要的食物來源，獨(dú)特的高原生存環(huán)境造就了牦牛乳汁的特異性[1]。與普通牛乳相比，牦牛乳含有更豐富的營養(yǎng)素，具有較大利用價(jià)值和開發(fā)潛力[2]。

Edam干酪原產(chǎn)于荷蘭，具有獨(dú)特的紅色蠟封，又稱“紅波干酪”，其質(zhì)地光滑、氣味溫和，咀嚼時(shí)有濃郁的乳香味[3]。Edam干酪屬于浸洗硬質(zhì)干酪[4]，工藝上與其他干酪最大的區(qū)別在于需要浸泡和洗滌，通過浸泡排出乳清，并用熱水洗掉部分乳糖，從而減少乳酸的產(chǎn)生，使最終pH值在5.0～5.2[5]。Edam干酪的加工工藝在國外已經(jīng)成熟，目前國內(nèi)的研究中還沒有用牦牛乳制作Edam干酪的先例。

干酪成熟是一個微生物發(fā)酵的過程，涉及糖酵解、脂肪分解、蛋白質(zhì)水解等生化反應(yīng)[6]，這些反應(yīng)賦予干酪特定的組織狀態(tài)、質(zhì)地和風(fēng)味[7]。干酪結(jié)構(gòu)是由鈣磷酸鹽和副酪蛋白組織重疊交錯連接的副酪蛋白聚合體[8]，在成熟過程中，受酪蛋白-酪蛋白、酪蛋白-水和酪蛋白-脂肪相互作用等因素的影響[9]；隨著成熟時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生不同程度的水解，產(chǎn)生一系列的風(fēng)味物質(zhì)，其中生成的醛、酮和醇形成了干酪特有的成熟風(fēng)味[10]。成熟過程所產(chǎn)生的微生物菌群也可直接影響干酪風(fēng)味組成[11]，任雪明等[12]優(yōu)化干酪加工工藝，測定干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有酮類、醇類、芳香類和烯烴類；NINGTYAS等[13]鑒定出干酪中揮發(fā)性化合物29種。

本研究采用青藏高原牦牛乳為原料，以發(fā)酵劑添加量、預(yù)酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度作為實(shí)驗(yàn)因素，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化Edam牦牛硬質(zhì)干酪工藝，表征成熟過程微觀結(jié)構(gòu)的變化，并采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)分析Edam牦牛硬質(zhì)干酪的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為牦牛乳開發(fā)新產(chǎn)品和風(fēng)味分析提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳采自四川省紅原縣麥洼；干酪發(fā)酵劑，常州益菌加生物科技有限公司；小牛皺胃酶，丹麥Chr.Hansen公司；無水檸檬酸、CaCl2、NaCl、Na2SO4、25%戊二醛，均為食品純，廣州佳德樂生化科技有限公司。

LD1100-1R電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；8601手持pH計(jì)，衡欣科技股份有限公司；DZ-280/2SE小型真空封裝機(jī)，廣東省東莞市益健包裝機(jī)械有限公司；Sigma600場發(fā)射掃描電鏡，德國卡爾蔡司股份公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取探針，美國Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Edam牦牛干酪制備工藝

原料乳→過濾→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏滅菌→冷卻→添加發(fā)酵劑→調(diào)節(jié)酸度→添加CaCl2→添加凝乳酶→凝乳→切割、熱縮→排出乳清→浸洗→排出乳清→壓榨成型→鹽漬→干燥→封蠟→成熟

1.2.2 正交試驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)室原有單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵劑添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、預(yù)酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為實(shí)驗(yàn)因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定其最佳工藝方案。干酪制成后，以干酪得率和感官評分為指標(biāo)，對制作成型的干酪進(jìn)行評價(jià)。正交因素水平如表1所示。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.2.1 干酪得率的測定

根據(jù)BONFATTI等[14]的方法。分別稱取9組試驗(yàn)組所需原料乳記為m1，各組添加的CaCl2質(zhì)量記為m2，凝乳酶質(zhì)量記為m3，干酪壓縮成型后，稱其質(zhì)量記為m，干酪得率(X)根據(jù)公式(1)計(jì)算。

(1)

1.2.2.2 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參考GB 5420—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)干酪》感官要求制定檢驗(yàn)方法和Edam干酪感官評價(jià)表(表2)，感官評價(jià)小組由10名來自食品科學(xué)學(xué)院受過專業(yè)訓(xùn)練的學(xué)生組成，對9組正交試驗(yàn)組分別進(jìn)行評價(jià)。

表2 感官評分表Table 2 Sensory scoring table

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化

參考石永祺等[15]的方法。分別取3 g成熟第0、20、40、60、80天的干酪樣品，沿干酪纖維方向切成光滑薄片，用2.5%戊二醛溶液浸泡固定，脫水脫脂。在-80 ℃冰箱中放置2 h后進(jìn)行冷凍干燥。將干燥后的樣品貼在實(shí)驗(yàn)臺上，通過離子濺射進(jìn)行鍍金。置于20.0 kV電壓下，在600倍電鏡下掃描。

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

色譜條件：載氣He，流速1 mL/min，樣品通過DB-Wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細(xì)管柱。色譜升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后5 ℃/min升到200 ℃，最后以10 ℃/min升到220 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離(electron ionization，EI)源，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式Scan，質(zhì)量掃描范圍m/z40～650。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0對實(shí)驗(yàn)因素A、B、C進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，判定實(shí)驗(yàn)變量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著性，用Excel 2010對Edam牦牛硬質(zhì)干酪實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 Edam牦牛干酪工藝優(yōu)化結(jié)果分析

Edam牦牛硬質(zhì)干酪工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

根據(jù)表3正交分析結(jié)果可得，影響Edam干酪感官評分的因素主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵劑添加量>酸化pH>鹽漬濃度>浸洗溫度，感官評分最高的是5號干酪，為92.6分。影響Edam牦牛干酪得率的因素主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵劑添加量>浸洗溫度>酸化pH>鹽漬濃度，即發(fā)酵劑用量對Edam干酪產(chǎn)量的影響最大，而鹽漬濃度影響最小，干酪得率最高的是5號干酪，為19.41%。

由表4、表5的方差分析可知，發(fā)酵劑添加量、酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度均具極顯著差異性(P<0.01)。對比正交試驗(yàn)、極差分析和方差分析結(jié)果，正交試驗(yàn)的最佳工藝組合為A2B2C3D1，根據(jù)感官評價(jià)極差、方差分析的最佳工藝組合為A2B3C2D1。根據(jù)干酪得率極差、方差分析得到最佳工藝組合為A2B3C3D2。

表4 正交試驗(yàn)感官評分方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of sensory score of orthogonal test

驗(yàn)證試驗(yàn)：將極差、方差分析得到的最優(yōu)組合即A2B3C2D1和A2B3C3D2，按照1.2.1的工藝制作干酪，計(jì)算干酪得率和感官評價(jià)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為：A2B3C2D1的干酪得率19.22%，感官評分86.3分；A2B3C3D2的干酪得率為19.18%，感官評分91.22分，均低于正交試驗(yàn)組的5號，故5號干酪A2B2C3D1為最佳制作工藝方案，最佳工藝為發(fā)酵劑添加量0.006%、pH 5.6、浸洗溫度45 ℃、鹽漬濃度12%。

表5 正交試驗(yàn)干酪得率方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of cheese yield rate in orthogonal test

2.2 Edam牦牛干酪成熟過程中微觀結(jié)構(gòu)觀察

如圖1所示，第0天時(shí)，干酪的組織結(jié)構(gòu)較緊湊，酪蛋白膠束較粗，膠束之間孔徑光滑且空間較小；

a-0 d;b-20 d;c-40 d;d-60 d;e-80 d圖1 Edam牦牛干酪發(fā)酵0～80 d的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of Edam yak cheese fermentation from 0-80 d

第20天時(shí)干酪的孔徑較第0天已經(jīng)變大；第40天初見網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)降解，第60天時(shí)孔徑數(shù)量增多，酪蛋白膠束明顯變細(xì)；第80天時(shí)酪蛋白結(jié)構(gòu)分散，孔徑由小變大，干酪表面變得粗糙，蛋白質(zhì)分解較明顯。

第0天時(shí)，干酪中的酪蛋白脂肪含量較高，且結(jié)合緊湊，所以干酪表面孔洞?。坏?0天時(shí)，干酪中的凝乳酶和微生物產(chǎn)生的酶較少，對蛋白質(zhì)的降解有限；第40天時(shí)，干酪中的酪蛋白在殘留的各類酶和菌作用下被水解，導(dǎo)致干酪的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸分解，結(jié)構(gòu)變得疏松，孔徑變大，和楊宇[17]的研究結(jié)果一致；第60天時(shí)，微生物代謝消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，干酪中的大部分蛋白質(zhì)被分解成小肽和氨基酸，第80天時(shí)孔徑明顯變大，蛋白質(zhì)分解較明顯，脂類物質(zhì)大量降解，干酪乳化性能變差，表面變粗糙。

2.3 Edam牦牛干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果分析

SPME-GC-MS技術(shù)對Edam牦牛硬質(zhì)干酪不同成熟期(0、20、40、60、80 d)的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測，離子色譜圖如圖2所示。NIST-MS-Search 2.0共搜索到75個化合物，主要為羧酸類、醇類、酮類、酯類和醛類化合物。各物質(zhì)的含量及其相對峰面積見表6。

a-成熟0 d;b-成熟20 d;c-成熟40 d;d-成熟60 d;e-成熟80 d圖2 不同成熟時(shí)間的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram with different ripening time

表6 干酪成熟過程中揮發(fā)性成分的變化Table 6 Changes in volatile components during cheese ripening

續(xù)表6

續(xù)表6

從圖2和表6可以看出，0 d的干酪中檢測到44種風(fēng)味物質(zhì)，包括15種醇、15種酯、6種酮、5種醛、3種烷烴等化合物。在成熟20 d的干酪中，共檢測到35種風(fēng)味物質(zhì)，包括1種羧酸、13種醇、6種酯、6種酮、5種醛和4種烷烴。在成熟40 d的干酪中檢測到35種風(fēng)味化合物，包括3種羧酸、14種醇、2種酯、7種酮、4種醛、5種烷烴等化合物。成熟60 d后，干酪中檢出30種風(fēng)味物質(zhì)，包括5種羧酸、9種醇、2種酯、7種酮、3種醛和4種烷烴。80 d干酪中檢出27種風(fēng)味物質(zhì)，包括5種酸、9種醇、1種酯、6種酮、3種醛、3種烷烴等化合物。

Edam牦牛干酪成熟期間各類化合物總含量及種類的變化如表7所示。利用SPME-GC-MS分析Edam牦牛干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，不同成熟時(shí)間干酪樣品中的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量存在一定的差異性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨成熟時(shí)間增加，揮發(fā)性化合物的種類由44種降到27種，第60天，酸類化合物含量最高，醇類化合物含量最低；第80天，酯類、酮類、醛類化合物種類及含量均下降到最低，這是由于干酪成熟過程中，蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖發(fā)生不同程度的分解同時(shí)產(chǎn)生不同的化合物，使得干酪的風(fēng)味醇香濃厚。

表7 Edam牦牛干酪成熟期間各類化合物 總含量及種類的變化Table 7 Changes of total content and types of compounds during the ripening of Edam yak cheese

2.3.1 羧酸類化合物

干酪成熟過程中，檢出的羧酸類化合物有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸。隨著成熟時(shí)間的延長，酸類化合物的種類數(shù)量均增長；含量在第60天時(shí)達(dá)到最高值38.46%，到第80天降至26.21%，各階段含量差異性顯著(P<0.05)。這是因?yàn)楦衫页墒爝^程中殘留的乳酸菌自溶產(chǎn)生的胞內(nèi)脂肪酶和乳酸菌釋放的胞外脂肪酶共同作用生成游離脂肪酸，酪蛋白水解成多肽和氨基酸、乳糖發(fā)酵生成乳酸[18]。甲酸具有刺激性醋味，不利于干酪的風(fēng)味形成[19]；乙酸和丙酸具有典型的醋酸味道；己酸具有輕微的干酪腐臭味；丁酸表現(xiàn)出干酪味和奶油味，但發(fā)酵過程中雜菌增多時(shí)丁酸產(chǎn)量升高會使干酪產(chǎn)生酸敗氣味。

2.3.2 醇類化合物

醇具有沸點(diǎn)低、極性低、閾值較高、對風(fēng)味貢獻(xiàn)小等特點(diǎn)。隨著成熟時(shí)間的延長，醇類含量從68.83%降到第60天的16.90%，到第80天又升至49.6%。成熟前以丁醇為主，到第80天以苯乙醇為主。干酪中醇類物質(zhì)有4種來源：乳糖代謝，甲基酮還原，氨基酸代謝以及亞油酸、亞麻酸降解。2-戊醇可表現(xiàn)出新鮮的干酪風(fēng)味、堅(jiān)果風(fēng)味；己醇有椰子和漿果的味道；苯甲醇有微弱的芳香氣味[20]；成熟后含量最高的苯乙醇具有玫瑰香味，對于干酪的特殊香氣起到了一定作用，對干酪的風(fēng)味是有利的。

2.3.3 酯類化合物

脂肪酸和醇的酯化在干酪成熟過程中起著重要作用。由于在乙酸、丁酸和己酸存在下的協(xié)同作用，酯的閾值比前體低10倍。丁酸甲酯具有蘋果風(fēng)味，乙基酸有水果和冰淇淋的香氣，乙酸丁酯、乙酸正丙酯有一種特殊的水果香味，丁酸丙酯有香蕉和菠蘿香氣，己酸乙酯有菠蘿味、蠟味和香蕉味[21]。

2.3.4 酮類化合物

酮是干酪中最常見的風(fēng)味成分之一，具有獨(dú)特的風(fēng)味和較低的感知閾值。其中，最重要的揮發(fā)性成分是甲基酮。酮與原料乳的脂肪含量有關(guān)，它由多不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸降解或通過微生物的酯解作用形成[22]。由表7可知，酮類化合物種類變化相對穩(wěn)定，含量呈先上升后下降的趨勢。丙酮具有特殊的辛辣氣味；2-丁酮、2-戊酮的氣味與丙酮類似，略帶辛辣味；2-庚酮、2-壬酮賦予干酪水果味、花香味及霉腐味；己二酮具有乳脂香氣。

2.3.5 醛類化合物

醛類是干酪水溶性成分中的主要揮發(fā)性化合物，也是各種氧化香精的來源。由于醛類組分化學(xué)性質(zhì)相對比較活潑，很快還原成醇和相應(yīng)的酸，因而醛類物質(zhì)在干酪中的存留時(shí)間很短[23]。由表7可知，醛類物質(zhì)種類相對穩(wěn)定，含量處于動態(tài)變化中，隨著脂肪氧化而逐漸增多，又因被還原成醇或酸而減少。干酪中醛類物質(zhì)的來源主要有2種[24]：一是脂肪酸代謝，主要生成直鏈醛類；二是氨基酸轉(zhuǎn)氨作用或Strecker降解，主要生成支鏈醛類。苯甲醛具有杏仁和堅(jiān)果的風(fēng)味，由色氨酸或苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來，對干酪形成良好的風(fēng)味起著重要作用；3-甲基丁醛使干酪具有強(qiáng)烈的氣味；戊二醛和己醛具有草味和牛舍味，當(dāng)含量超過一定閾值時(shí)，會產(chǎn)生難聞的氣味。

2.3.6 烷烴及其他

烷烴化合物在干酪中隨處可見。由于碳?xì)浠衔锏母唛撝?，風(fēng)味活性較低，對干酪的呈味作用有限，其含量變化不明顯，對干酪的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)也較小。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以發(fā)酵劑添加量、預(yù)酸化pH、浸洗溫度、鹽漬濃度作為因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳加工工藝：發(fā)酵劑添加量0.006%、pH 5.6、浸洗溫度45 ℃、鹽漬濃度12%。在此工藝下制得的Edam牦牛硬質(zhì)干酪成熟0～80 d，掃描電鏡結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酪蛋白膠束變細(xì)，孔徑變大，孔洞數(shù)量逐漸變少，發(fā)酵至80 d時(shí)，干酪表面變得粗糙，蛋白質(zhì)脂肪分解較明顯。利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對Edam牦牛硬質(zhì)干酪成熟各階段進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定，結(jié)果表明，隨著成熟時(shí)間的延長，風(fēng)味化合物的總量呈下降趨勢，酯類和醇類下降明顯，酸類化合物的數(shù)量先增后減，第80天的主要風(fēng)味物質(zhì)有羧酸類和醇類；其中，生成的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)有丁酸、乙酸、戊酸、己酸、1-丁醇、苯乙醇及2-戊酮，構(gòu)成了干酪的主體風(fēng)味。本研究可為Edam牦牛硬質(zhì)干酪加工和產(chǎn)品開發(fā)提供一定的參考，但干酪的風(fēng)味是由揮發(fā)性成分共同作用的結(jié)果其內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

致謝：感謝西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心張玉老師為本研究提供GC-MS檢測。