張 翀，李 麗，祁衛(wèi)華，趙玉杰，張紅霞

頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄主要指頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈等損傷后發(fā)生致命性噴射性出血，若不及時(shí)醫(yī)治則導(dǎo)致死亡，傷口不大僅表現(xiàn)為側(cè)壁損傷，短時(shí)間內(nèi)發(fā)生頸部大血管壓迫氣管，導(dǎo)致呼吸困難，并形成假性動(dòng)脈瘤；若靜脈同時(shí)發(fā)生損傷，則可能有瘺口相通形成動(dòng)靜脈瘺[1-3]。病人一旦發(fā)生頸動(dòng)脈損傷后多數(shù)采用球囊損傷術(shù)治療，但術(shù)后少數(shù)病人出現(xiàn)再狹窄癥狀[4]。有研究顯示，注射葛根素可減輕臨床癥狀，通過(guò)抑制Wnt表達(dá)，進(jìn)而改善狹窄[5]。關(guān)于葛根素干預(yù)頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄的動(dòng)物研究較少。本研究基于Wnt通路分析葛根素對(duì)頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只大鼠由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2021-0003]，鼠齡3～5(3.80±0.95)個(gè)月，體質(zhì)量225～263(231.80±18.05)g，將大鼠置于室溫23～25 ℃，濕度40%～70%，自然光照、通風(fēng)的無(wú)病原菌干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用水和食物均消毒。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：倒置相差顯微鏡(日本Olympas公司)；二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯示劑(邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒及相關(guān)試劑(北京索萊寶科技有限公司)；葛根素(江蘇天晟藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20044253)；小鼠抗大鼠Wnt抗體(上海中喬新舟生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模 在75只大鼠中隨機(jī)選取15只作為正常組，不進(jìn)行任何處理；其余大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各15只。參照徐榮偉等[6]方法建立頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄大鼠模型。除正常組外，其余各組大鼠在喂養(yǎng)14 d后采用水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，分離頸外動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，在近端做一切口，逆行插入球囊導(dǎo)管，注入生理鹽水0.2 mL，反復(fù)拉3次，一旦發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷立即撤出導(dǎo)管，在動(dòng)脈遠(yuǎn)端予以結(jié)扎。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠表現(xiàn)為頸動(dòng)脈損傷后再狹窄癥狀。

1.2.2 給藥 在野葛中提取葛根素，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠均給予葛根素耳緣靜脈注射5周，劑量分別為3 mg、60 mg、100 mg，模型組給予等體積生理鹽水耳緣靜脈注射。

1.2.3 病理組織學(xué) 大鼠禁食不禁水12 h，麻醉處死，迅速摘取頸動(dòng)脈后立即固定在染色液中，將制備的大鼠頸動(dòng)脈組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備厚度為4 μm的組織切片，取主動(dòng)脈組織石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹(shù)膠封片后，顯微鏡下觀察、拍照分析，并測(cè)量大鼠新生內(nèi)膜面積、管腔面積。

1.2.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、硫化氫(hepatic gas，H2S)、1型膠原(Collagen 1，Collagen1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotein-2，MMP-2)、Wnt1、Wnt3a水平測(cè)定 抽取各組大鼠空腹靜脈血2 mL，離心半徑5 cm，以3 000 r/min離心3 min，分離上層血清，在-42 ℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA檢測(cè)VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a水平，以1∶2稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔中加入以稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品每孔100 μL，35 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；使用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入1∶100倍稀釋后的抗體工作液每孔100 μL，置于35 ℃條件下中濕育45 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液每孔100 μL，置于35 ℃條件下45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液用于終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a(顏色反應(yīng)深淺與VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a成正比)。

1.2.5 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟：將頸動(dòng)脈組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，使用二喹啉甲酸法(BCA)測(cè)定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜每次5 min，共3次；二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜每次5 min，共3次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠病理組織學(xué)改變 正常組大鼠血管結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)脫落的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)膜光滑；模型組大鼠彈力纖維缺損，出現(xiàn)大量斷裂，管腔面積不規(guī)則；藥物干預(yù)后，低劑量組、中劑量組大鼠血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，但排序相對(duì)規(guī)則；高劑量組大鼠管腔面積規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠病理組織學(xué)改變(HE，×400)

2.2 各組大鼠新生內(nèi)膜面積、管腔面積比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組新生內(nèi)膜面積大于正常組，管腔面積小于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組新生內(nèi)膜面積小于模型組，管腔面積大于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組新生內(nèi)膜面積小于低劑量組，管腔面積大于低劑量組(P<0.05)；高劑量組新生內(nèi)膜面積小于中劑量組，管腔面積大于中劑量組(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠新生內(nèi)膜面積、管腔面積比較(±s) 單位：mm2

2.3 各組大鼠VEGF、TNF-α、H2S比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組VEGF、TNF-α水平均高于正常組，H2S均低于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組VEGF、TNF-α水平低于模型組，H2S高于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組VEGF、TNF-α水平低于低劑量組，H2S高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組VEGF、TNF-α水平低于中劑量組，H2S高于中劑量組(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠VEGF、TNF-α、H2S比較(±s)

2.4 各組大鼠Collagen1、MMP-2比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組Collagen1、MMP-2水平均高于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組Collagen1、MMP-2水平低于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組Collagen1、MMP-2水平低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組Collagen1、MMP-2水平低于中劑量組(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠Collagen1、MMP-2比較(±s) 單位：%

2.5 各組大鼠Wnt通路蛋白表達(dá)比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組Wnt1、Wnt3a蛋白表達(dá)水平均高于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組Wnt1、Wnt3a蛋白表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組Wnt1、Wnt3a蛋白表達(dá)水平低于低劑量組(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組大鼠Wnt通路蛋白表達(dá)比較(±s)

圖2 各組大鼠Wnt通路蛋白表達(dá)條帶圖(A為正常組；B為模型組；C為低劑量組；D為中劑量組；E為高劑量組)

3 討 論

頸動(dòng)脈分為內(nèi)層、中層和外層，以?xún)?nèi)膜過(guò)度用力牽拉下撕裂的情況常見(jiàn)。一旦發(fā)生頸動(dòng)脈損傷后，常采用頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)進(jìn)行治療，但球囊損傷術(shù)可能造成頸動(dòng)脈再狹窄的情況[7]。本研究探討Wnt通路在葛根素對(duì)鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄的干預(yù)作用，為臨床治療提供依據(jù)。

葛根素是從植物野葛中提取的一種藥物，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善腦血管功能、活血化瘀的作用，顯著改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)，并達(dá)到降低血黏度的目的[8]。胡彥武等[9]研究顯示，葛根素可降低心肌耗氧量。葛根素可降低鈣調(diào)蛋白活性，增加細(xì)胞變性，抑制血小板聚集[10]。張騰飛等[11]研究顯示，葛根素干預(yù)治療支架內(nèi)再狹窄，能減小病人再狹窄面積，抑制血管降解，從而抑制再狹窄形成。呂婧等[12]研究顯示，葛根素可用于防治神經(jīng)病理性疼痛，但關(guān)于其治療的相關(guān)分子機(jī)制報(bào)道較少。目前關(guān)于葛根素在頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄中的應(yīng)用研究較少。本研究結(jié)果顯示，葛根素可減少頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄的發(fā)生情況，其原因可能與葛根素類(lèi)成分可抑制血小板聚集，且生物利用度高，發(fā)揮改善頸動(dòng)脈的作用有關(guān)。

頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄的主要機(jī)制為血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移所致的內(nèi)膜過(guò)度增生，局部血栓形成，細(xì)胞外基質(zhì)形成及晚期血管負(fù)性重塑球囊損傷血管內(nèi)皮后導(dǎo)致再狹窄發(fā)生[3，13-14]。余惠珍等[15]研究顯示，MMP-2是水解變性膠原及基膜的主要有效成分，通過(guò)損傷的平滑肌細(xì)胞大量分泌，頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄MMP-2表達(dá)水平異常。本研究結(jié)果顯示，MMP-2在頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄模型大鼠中呈低表達(dá)，證實(shí)了MMP-2可作為有效的檢測(cè)指標(biāo)。有研究證實(shí)，Collagen1在各組織中發(fā)揮著重要的支持作用[16]。有研究指出，Collagen1參與細(xì)胞增生修復(fù)、組織損傷、生長(zhǎng)分化、炎癥反應(yīng)等過(guò)程[17]。本研究結(jié)果顯示，葛根素能改善血管損傷，降低MMP-2、Collagen1水平，提示葛根素能抑制大鼠球囊損傷部位的再狹窄。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，使用葛根素治療后大鼠MMP-2、Collagen1、VEGF、TNF-α水平降低，H2S水平升高，此類(lèi)藥物具有改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)、降低血黏度的作用。說(shuō)明MMP-2、Collagen1、VEGF、TNF-α、H2S可反映再狹窄情況。

有研究顯示，葛根素對(duì)再狹窄的形成可發(fā)揮一定的抑制作用，抑制大鼠球囊損傷部位再狹窄[18]。Guo等[19]研究顯示，Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。Liu等[20]研究顯示，信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)發(fā)育及損傷后增殖，大鼠頸動(dòng)脈受損后Wnt通路的某些信號(hào)分子異常表達(dá)，可能參與調(diào)控中膜平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及內(nèi)膜新生過(guò)程。上述研究說(shuō)明，Wnt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)VSMC發(fā)育及損傷后增殖過(guò)程，頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄大鼠Wnt1、Wnt3a水平降低，通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路可調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖及心臟重構(gòu)過(guò)程中內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制血管損傷處內(nèi)皮生長(zhǎng)。

綜上所述，葛根素基于Wnt信號(hào)通路能減小頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄大鼠頸動(dòng)脈管腔面積，通過(guò)調(diào)控Wnt1、Wnt3a蛋白減輕大鼠血管損傷，為臨床治療頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)再狹窄提供參考。