張文富，吳姍姍，戴 銘，呂建林，黃晶晶，李曉龍，王振常2，

（1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，廣西 南寧530299；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；4.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530299；5.廣西中醫(yī)基礎研究重點實驗室，廣西 南寧 530299；6.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021）

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精性肝病等各種慢性肝病進展的必經(jīng)過程，同時也是進展為肝硬化，甚至是肝癌的關鍵環(huán)節(jié)。早期抗纖維化干預治療，可有效改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，并在一定程度上降低肝硬化與肝細胞癌的發(fā)病概率，延長患者壽命。研究證實，氧化應激反應機制在各類慢性肝臟疾病的起始和進展過程中均起著關鍵作用［1，2］。氧化應激反應系統(tǒng)的激活可導致眾多炎癥因子的釋放［3］，而炎癥因子的大量釋放不僅會導致炎癥的一系列連鎖反應，還能造成氧化應激系統(tǒng)的激活，繼而加重肝纖維化與肝硬化程度［4］，相反，抑制氧化應激與減輕炎癥反應可以在一定程度上減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化［5，6］。因此，降低氧化應激與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關［7］。國內(nèi)外研究顯示，一些中藥單體或中藥復方能有效改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化患者肝組織病理學進程［8-13］。經(jīng)國家級第一批名老中醫(yī)林沛湘教授對肝病多年研究總結(jié)的“壯肝逐瘀煎”與全國首批名老中醫(yī)關幼波教授多年來用于治療肝纖維化、肝硬化有效驗方化裁而成的壯方柔肝化纖顆粒，由生黃芪、生牡蠣、老虎姜、枸杞子、薏苡仁、蕓紅、地瓜苗、上甲、虎杖、雞黃皮、大棗等十一味藥組成，有攻毒補虛之功效，使壯醫(yī)理論之“氣道”、“谷道”、“水道”三道通暢。前期研究已證實柔肝化纖顆?？筛纳聘卫w維化、肝硬化、肝癌患者的臨床癥狀［14-16］，有助于乙肝肝硬化患者利尿消腫與減少腹水的生成［17］，但其作用機制尚未明確。本研究采用CCl4聯(lián)合花生油復合溶液聯(lián)合誘導肝纖維化大鼠，剖析柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠的干預效應，以本團隊前期臨床研究的氧化應激水平為切入點，深入探討柔肝化纖顆?？垢卫w維化的作用效應，為柔肝化纖顆粒治療肝纖維化提供切實可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取體重100～120 g 的SPF 級健康雄性Wistar 大鼠48 只，均購買于廣西醫(yī)科大學實驗動物研究所。飼養(yǎng)室溫度設定值為19.2 ℃，相對濕度設定值為49.8%，壓力設定值為0.9 Pa，送風風速目標值為7.1 m/s，排風風速目標值為3.6 m/s，換氣次數(shù)目標值為70 次/h，風量比例目標值為50%，光照時間與黑暗時間對等，常規(guī)環(huán)境適應性喂養(yǎng)7 d，期間由大鼠自主飲水與進食。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2020-0003；實驗動物使用許可證號：SCXK 桂2020-0004。

1.1.2 試劑耗材 環(huán)保型浸蠟脫蠟透明液（南昌雨露實驗器材有限公司，200801），脫水劑Ⅰ（75%乙醇）（南昌雨露實驗器材有限公司，200801），脫水劑Ⅱ（85% 乙醇）（南昌雨露實驗器材有限公司，190604），脫水劑Ⅲ（95%乙醇）（南昌雨露實驗器材有限公司，191101），脫水劑Ⅳ（無水乙醇）（南昌雨露實驗器材有限公司，200901），蘇木精染液（南昌雨露實驗器材有限公司，191202），無毒環(huán)保蘇木素-伊紅（HE）染色液（南昌雨露實驗器材有限公司，200901），中性環(huán)保速干膠（南昌雨露實驗器材有限公司，180502），無毒環(huán)保馬松（Masson）三色染色液（Solarbio，G1340），PBS 緩 沖 液 干 粉（Solarbio，P1010），EDTA 抗 原 修 復 液（50X）（Solarbio，C1034），30%過氧化氫（成都金山化學試劑有限公司，20190608），山 羊 血 清（Beyotime，C0265），α-SMA Polyclonal Antibody（Elabscience，E-AB-34268），E-Cadherin Polyclonal Antibody（Proteintech，20874-1-AP），Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（abcam，ab6721），DAB 顯色液（中杉金橋，ZLI-9018），CCl4（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，20210218），ALT、AST 檢測試劑盒（上海科華生物工程股份有限公司，20210822，20210912），α-SMA免疫組化試劑盒（中杉金橋，ZM-0003），E-Cadherin免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，2105190738b），超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（吉林百奧生物科技有限公司，9054-89-1），丙二醛（MDA）測試盒（吉林百奧生物科技有限公司，XF03124B）。

1.1.3 藥物 壯方柔肝化纖顆粒，由壯方柔肝化纖顆粒，由生黃芪45 g、生牡蠣30 g、老虎姜20 g、枸杞子20 g、薏苡仁45 g、蕓紅12 g、地瓜苗30 g、上甲30 g、虎杖20 g、雞黃皮15 g、大棗15 g 組成。所選取的藥物為免煎顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院藥學部中心藥房提供，入庫的所有中藥依據(jù)2020 年版《中華人民共和國藥典》第一部內(nèi)容鑒定，選取道地藥材，符合中國藥典標準。

1.1.4 器材 賽默飛世爾脫水機（英國賽默飛，Excelsior AS），萊卡組織切片機（上海萊卡，2235），萊卡組織攤片機（上海萊卡，HI1210），萊卡組織烤片機（上海萊卡，HI1210），一恒電熱干燥箱（上海一恒，DHG-9091A），恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢，DHP-90052），通風柜（廣州匯綠，630），霉菌培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司，MJ-150-Ⅱ）；普通PCR 儀（Bio-RAD，T100）；實時熒光定量PCR 儀（RT-PCR）（杭 州 安 譽AGS8830-16）；電 泳 儀（Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra System），光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX-53）；化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（日本奧林巴斯，U-RFL-T）。

1.2 方法

1.2.1 分組 根據(jù)采取隨機數(shù)字表法，將48 只Wistar 大鼠隨機分為空白組、病理模型組與柔肝化纖顆粒組，每組均為16 只。

1.2.2 造模與給藥 病理模型組與柔肝化纖顆粒組Wistar 大鼠采取皮下注射40%的CCl4聯(lián)合花生油復合因素誘導下，對其進行誘導肝纖維化實驗操作。動物造模方法參照馬學惠［18］與呂艷杭［19］法規(guī)范操作，第一次皮下注射5 mL/kg，之后間隔3 天以每3 mL/kg 的標準進行皮下注射，每周注射2 次，連續(xù)8 周。并且每天予高脂、低蛋白輔食（予玉米面為日?；A食物，在第1、第2 周添加予0.5%膽固醇與20%豬油）喂養(yǎng)，為了充分而有效避免大鼠肝纖維化模型的自然恢復從而對實驗結(jié)果準確性造成的不良影響，造模成功后仍按3 mL/kg 的標準每周皮下注射一次40% CCl4油劑；空白組除了正常喂養(yǎng)以外，在相同時間皮下注射等劑量花生油，8 周后按照8 mg/kg 的標準給予生理鹽水灌胃。造模成功后，中藥使用劑量參照Wojcikowski Ken［20］動物用藥劑量的換算方法實施，病理模型組給予8 mg/kg 生理鹽水灌胃，柔肝化纖顆粒組給予該中藥方的顆粒溶液同樣按8 mg/kg 的劑量進行灌胃，每周灌胃3 次，連續(xù)8 周。

1.2.3 標本采集 按照造模與給藥方法對Wistar大鼠進行藥物干預第8 周末當晚，各組大鼠均禁食但不禁水12 h，予1%戊巴比妥注射液（5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，10 min 后對大鼠進行夾尾試驗，不動彈方可判斷為麻醉起效。在大鼠軀干前面腹部正中間按“T”字形狀小心剪開，完整顯露出腹主動脈后進行采血，采血完畢后將血液靜置于室溫1 h，靜置后，于3000 r/min，按照離心半徑參數(shù)為10 cm的設置，離心15 min。采用移液槍吸取血清，取大鼠肝組織標本開展下一步操作。

1.2.4 肝功能轉(zhuǎn)氨酶水平檢測 嚴格參照ALT 與AST 檢測試劑盒說明書中的操作步驟進行，檢測三組大鼠血清 ALT、AST 指標。

1.2.5 肝組織病理切片制備 充分選取大鼠肝組織中右葉最厚處，切取標本約0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm 肝組織1 塊，將選取的肝組織放入4 %的多聚甲醛溶液中固定12 h，采用自動脫水機連續(xù)4 次進行逐級酒精脫水，將組織浸入于二甲苯溶液中透明組織，再使用石蠟將組織充分包埋，采用切片機將石蠟包埋組織切成4 μm 厚的切片，放置在干凈的載玻片上，然后將其置于60 ℃的恒溫箱中孵育，5 h 后將其取出，放于4 ℃冰箱中保存進行后續(xù)實驗。

1.2.6 HE 染色 使用二甲苯脫蠟10 min，結(jié)束后將其充分沖洗后使用蘇木精有效染色，時間約4～6 min，根據(jù)實際染色情況適當增加或縮短染色時間，使用流動水沖洗干凈蘇木精溶液，使用分化液將組織分化后再用流水沖洗組織，滴加少量乙酸至鋪滿載玻片上的組織為宜，組織分化結(jié)束后顏色逐漸變淺為藍色，再將其放入0.1%氨水水溶液中返藍，直至變成藍色后流水沖洗，觀察著色情況，細胞核呈藍黑色后，0.5%伊紅染色再沖洗，觀察著色情況，細胞漿著色呈粉色后，放入75%、85%、95%、100%酒精中脫水，晾干后置于二甲苯中，晾干后滴上中性樹膠封片。

1.2.7 Masson 染色 二甲苯脫蠟，沖洗后蘇木素染色，沖洗后再用5%乙酸分化，沖洗并滴加乙酸，組織分化結(jié)束后顏色逐漸變淺成藍色，再使用Masson藍化液對組織進行返藍，采用光學顯微鏡觀察組織染色結(jié)果，被著色的細胞核部位呈現(xiàn)出藍黑色，再將以上組織置于Masson 麗春紅酸性品紅液中進行充分染色，接著使用乙酸水溶液進行沖洗，然后使用磷鉬酸水溶液再次將其分化，按照蒸餾水與弱酸溶液比例為2∶1 的方法進行配置弱酸工作液有效沖洗，采用苯胺藍染色液進行二次染色，工作液沖洗后脫水晾干并放在二甲苯中透明3 次，最后將其自然晾干再用中性樹膠封片。

1.2.8 免疫組化 將組織先進行脫水處理，包埋，待蠟塊完全凝固后存放備用。組織切片，厚度為3 μm，撈片，65 ℃烤片過夜。切片常規(guī)脫蠟至水，依次放入脫蠟液Ⅰ、脫蠟液Ⅱ、脫蠟液Ⅲ、無水乙醇、95%乙醇、85%、75%乙醇、自來水中清洗。洗片，EDTA 抗原有效修復，3%H2O2室溫充分孵育15 min，洗片以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%正常山羊血清涂覆樣本，置于濕盒中37 ℃封閉1h。進行一抗孵育時，采用封閉液稀釋好的α-SMA 抗體（1∶200）或E-Cadherin 抗體（1∶1 000）滴在載玻片上鋪滿組織，4 ℃孵育過夜。進行二抗孵育時，37 ℃孵育30 min 再洗片。加入DAB 顯色液，在顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染細胞核，沖洗返藍，依次脫水再風干，中性樹膠封片，光學顯微鏡下鏡檢。

1.2.9 ELISA 嚴格參照SOD ELISA 試劑盒與MDA ELISA 試劑盒說明書步驟進行，檢測各組大鼠的SOD 與MDA 指標。

1.2.10 RT-PCR 測定肝組織α-SMA mRNA、E-Cadherin mRNA 表 達 稱 取100 mg 大 鼠 肝 臟 標本，根據(jù)Trizol 法提取總RNA，總反應體系為20 μL，將其置入42 ℃水浴1 h，充分逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。選用所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL 作為提取的反應模板，反應體系為25 μL。擴增條件設置參數(shù)為：94 ℃預變性5 min，接著94 ℃變性40 s，然后60 ℃退火40 s，接著72 ℃延伸1 min，連續(xù)35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。β-action 內(nèi)參擴增設置參數(shù)為：94 ℃預變性5 min，接著94 ℃變性40 s，然后60 ℃退火40 s，接著72 ℃延伸1 min，連續(xù)32 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。將5 μL PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳，攝像、存儲并分析。引物設計見表1。

表1 引物設計Tab 1 Primer design

1.2.11 蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot）使用電子天平稱取40 mg 大鼠肝組織，于10 mL 的裂解液中加入蛋白酶抑制劑，冰盒上裂解，研磨勻漿，低速離心，取上清液，即得肝組織總蛋白。使用大鼠BCA蛋白ELISA 試劑盒，測定總蛋白濃度后，對蛋白進一步電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等相關操作，使用β-微管蛋白作為內(nèi)參，按增強化學發(fā)光法對其進一步曝光顯影成像，分析目的蛋白條帶和內(nèi)參的灰度值比值，采用GeneTools 圖像分析管理系統(tǒng)對其進行半定量分析并儲存。

1.3 統(tǒng)計學處理

本實驗研究運用SPSS 27.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)比較分析，鑒于本實驗結(jié)果所比較的計量資料為獨立樣本，且所得實驗數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計學正態(tài)分布，所以兩組數(shù)據(jù)間相比的計量資料予采用t 檢驗，組間的比較予采用獨立樣本t檢驗。在符合獨立樣本、正態(tài)性分布且方差齊的情況下，多組間相比較采用單因素方差分析（F檢驗）。方差不齊時，采用均值相等性的鍵壯性檢驗。采用雙側(cè)檢驗以再次驗證本研究數(shù)據(jù)的準確性，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)圖形處理采用Graphpad Prism 9.0 軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 柔肝化纖顆粒治療CCl4復合因素誘導肝纖維化大鼠肝損傷情況

經(jīng)柔肝化纖顆粒干預后，病理模型組與空白組大鼠相比較，病理模型組大鼠肝功能ALT、AST 兩個指標值均顯著升高（P均＜0.001）；但柔肝化纖顆粒組與病理模型組大鼠相比，ALT、AST 兩個指標值均明顯降低（P均＜0.001）。見表2。

表2 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶指標比較（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶指標比較（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與病理模型組比較，▲P＜0.01。

指標ALT（U/L）AST（U/L）空白組（n=16）55.16±3.53 179.25±28.51病理模型組（n=16）225.29±69.09*317.30±82.88*柔肝化纖顆粒組（n=16）159.12±52.80▲219.64±56.75▲FP＜0.001＜0.001 46.62 22.18df20.14 25.42

2.2 HE 染色結(jié)果

光鏡下顯示（圖1）：空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)排列完整有序，肝細胞大小與形態(tài)表現(xiàn)正常，肝細胞索均勻圍繞中央靜脈呈放射狀有一定規(guī)律地排列，未見出現(xiàn)肝細胞脂肪變性及肝臟纖維組織增生，可見極少量炎細胞輕度浸潤。病理模型組大鼠肝組織內(nèi)的小葉結(jié)構(gòu)已殘缺，出現(xiàn)眾多肝臟纖維組織異常增生，增生所形成的膠原纖維匯合成密集的纖維間隔，從而變成假小葉結(jié)構(gòu)，假小葉結(jié)構(gòu)內(nèi)部出現(xiàn)大量形態(tài)各異、大小不均的脂肪變性的肝細胞，炎癥細胞彌漫性浸潤顯著。與病理模型組相比，經(jīng)過干預后的柔肝化纖顆粒組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞的面積顯著減少，正常肝小葉結(jié)構(gòu)增多，有不同程度增生的膠原纖維組織出現(xiàn)在中央靜脈至匯管區(qū)，纖維間隔相對疏松，有少量炎癥細胞浸潤，浸潤程度較病理模型組減輕。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色結(jié)果（×400）Fig 1 HE staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.3 Masson 染色結(jié)果

光鏡下顯示（圖2）：空白組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，細胞排列正常有序，僅在中央靜脈區(qū)域的血管壁附近可見少許藍色膠原纖維稀疏排列。病理模型組大鼠肝組織清晰顯示出眾多異常增生的藍色膠原纖維，不規(guī)律包圍環(huán)繞、分隔肝小葉組織，形成大小不等的假小葉結(jié)構(gòu)。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織亦可見藍色膠原纖維出現(xiàn)在匯管區(qū)域內(nèi)，纖維細薄，從中央靜脈向四周延伸蔓延，膠原纖維增生較病理模型組有很大程度的減輕。

圖2 各組大鼠肝組織Masson 染色結(jié)果（×400）Fig 2 Masson staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.4 免疫組化結(jié)果

α-SMA 蛋白表達以細胞質(zhì)為主，著色為棕黃色。光鏡下顯示，大鼠肝組織中α-SMA 僅可見少量表達，僅存在于匯管區(qū)小動脈與小靜脈血管壁上，其余組織區(qū)域未發(fā)現(xiàn)明顯表達。病理模型組大鼠肝組織中α-SMA 呈強陽性高表達狀態(tài)，在匯管區(qū)與膠原纖維增生處清晰可見其大量密集分布，并且在假小葉及增生的纖維間隔內(nèi)可見大量α-SMA 表達。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織α-SMA 少量表達于匯管區(qū)血管壁、纖維間隔中，肝竇處亦有少許分布，表達的強度及范圍較病理模型組顯著減少（圖3）。E-Cadherin 陽性染色顯示區(qū)域主要定位于細胞膜上，一般著色為棕黃色。光鏡下，大鼠肝組織E-Cadherin 呈高表達，病理模型組大鼠肝組織E-Cadherin 呈低表達或缺失，柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織E-Cadherin 表達較模型組有不同程度的升高（圖4）。

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA 免疫組化結(jié)果（×400）Fig 3 Liver tissue of rats in each group α- SMA immunohistochemical results（×400）

圖4 各組大鼠肝組織E-Cadherin 免疫組化結(jié)果（×400）Fig 4 Immunohistochemical results of E-cadherin in liver tissue of rats in each group（×400）

2.5 ELISA 結(jié)果

SOD 與MDA 是氧化應激的重要指標。經(jīng)柔肝化纖顆粒干預后，柔肝化纖顆粒組SOD 水平較病理模型組明顯升高（P＜0.001）。柔肝化纖顆粒組MDA 水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001）。見表3，圖5。

圖5 各組大鼠肝組織SOD 與MDA 水平比較Fig 5 Comparison of SOD and MDA levels in liver tissue of rats in each group

表3 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01。

指標FP空白組（n=16）病理模型組（n=16）柔肝化纖顆粒 組（n=16）dfSOD（IU/mL）MDA（nmol/L）542.75±69.46 297.72±60.45 162.20±21.73*1 095.13±185.76*398.45±66.05▲671.54±180.84▲＜0.001＜0.001 183.40 107.82 23.50 23.66

2.6 RT-PCR 與Western Blot 結(jié) 果

柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織中α-SMA 的表達水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001）。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織中E-Cadherin 的表達水平較病理模型組明顯升高（P＜0.001）。

圖6 α-SMA、E-Cadherin 的表達Fig 6 Expression of α-SMA and E-Cadherin

3 討論

肝纖維化的誘因是形式多樣的，發(fā)病機制錯綜復雜［21］，形成過程也多樣化。中醫(yī)辨證認為［22，23］，肝纖維化的中醫(yī)病機為“虛、瘀、毒”。研究證實［24-30］，有些中藥單品及中成藥有保肝護肝的作用，在一定程度上可產(chǎn)生抗肝纖維化的療效。壯方柔肝化纖顆粒的主要功效是“攻毒補虛”，對辯證治療肝纖維化的病因病機是相符的，前期研究已證實［14-17］，此方對肝纖維化、肝硬化、腹水等慢性肝病及其并發(fā)癥有顯著的療效，但其作用機制尚未明確。

很多病因可以直接或間接導致肝纖維化，氧化應激反應就是其中一種常見的病因。研究顯示［31-33］，氧化應激系統(tǒng)的激活可致使眾多炎癥因子的釋放，其是肝纖維化形成的常見病理生理變化之一，而大量炎癥因子的不斷釋放既可誘發(fā)炎癥反應，又能引起氧化應激系統(tǒng)的激活，繼而使肝纖維化程度加重，并逐步向肝硬化進展。氧化應激系統(tǒng)是引起肝臟損傷與導致肝纖維化、肝硬化的重要因素之一。同樣，形式多樣的發(fā)病誘因亦可激活氧化應激系統(tǒng)，因此，減輕氧化應激系統(tǒng)的過分活躍是抑制肝纖維化程度的有效控制措施。國內(nèi)外多方面研究證實［34-38］，肝星狀細胞（HSC）的增殖及活化是肝纖維化、肝硬化進程的關鍵環(huán)節(jié)，肝纖維化的不斷分化可加重成肝硬化，甚至惡變成肝癌，所以減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程是防治肝硬化與肝癌必 不 可 少 的 環(huán) 節(jié)［39，40］。而SOD 作 為 機 體 代 謝 中 氧化物自由基最關鍵的歧化酶之一，不僅對活化的HSC 產(chǎn)生巨大影響，還能導致多系統(tǒng)激活從而減少肝細胞凋亡［41，42］：主要體現(xiàn)在SOD 活躍程度減退后導致脂質(zhì)過氧化物在多種金屬離子產(chǎn)物與酶活性的作用下分化降解，使MDA 分泌過盛，MDA 對細胞產(chǎn)生毒性，從而跟蛋白質(zhì)分子進行交聯(lián)，進一步誘發(fā)肝細胞凋亡［43，44］。為此本研究通過探索壯方柔肝化纖顆粒干預CCl4肝纖維化大鼠模型，剖析柔肝化纖顆粒在抗肝纖維化病理進展中所發(fā)揮的效應及其作用機制。本研究結(jié)果顯示，CCl4復合因素誘導的肝纖維化模型組Wistar 大鼠血清的 ALT、AST 等指標水平明顯升高，通過柔肝化纖顆粒干預后轉(zhuǎn)氨酶能有效下降，表明柔肝化纖顆?？赏ㄟ^保護大鼠肝功能而起到防治肝損傷的作用。HE 染色、Masson 染色與免疫組化結(jié)果提示柔肝化纖顆?？捎行p輕CCl4復合因素誘導的模型大鼠的肝細胞損害情況，減輕其肝組織炎癥程度，逆轉(zhuǎn)其肝纖維化進程。ELISA 結(jié)果顯示柔肝化纖顆粒組SOD水平較病理模型組與空白組明顯升高（P＜0.001），柔肝化纖顆粒MDA 水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001），證實了柔肝化纖顆粒的有效性，其作用機制與保護肝功能、降低氧化應激水平密切相關。

HSC 激活后能加速肝纖維化主要以α-SMA 的表 達 升 高 作 為 重 要 判 定 指 標 之 一［45，46］。α-SMA 是HSC 活化增殖的關鍵病理學標志和特異性蛋白，α-SMA 的過度表達能加速HSC 過度分泌ECM，從而促使肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，還能間接反映出HSC 在機體內(nèi)活化增殖的進度與纖維化進展的嚴重程度［47］。α-SMA 表達水平升高后可直接加速肝纖維化與肝損傷的進程，還能作為評估肝硬化進展程度的重要指標。本研究表明，經(jīng)CCl4復合因素誘導的肝纖維化大鼠的α-SMA 表達水平顯著升高，經(jīng)過柔肝化纖顆粒干預后，α-SMA 的表達水平與病理模型組相比顯示出明顯下降的分布（P＜0.001），說明柔肝化纖顆?？梢种艸SC 的活化增殖，對肝纖維化有一定的抑制效果。E-cadherin 是肝病的血清生物標志物［48］，是一種鈣依賴的、能夠維持上皮組織穩(wěn)定的鈣粘蛋白，在組織分化中形成穩(wěn)定的黏附帶［49］，若其不能充分表達，則上皮細胞間的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，上皮細胞進一步發(fā)生EMT 而影響細胞的正常代謝，從而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞。EMT 的中心環(huán)節(jié)是E-cadherin 的過度抑制，EMT 發(fā)生時上皮細胞原有功能也隨之發(fā)生變化，產(chǎn)生運動與遷移的改變，向間質(zhì)細胞進一步轉(zhuǎn)化。發(fā)生EMT 時，組織細胞上皮標志成分E-cadherin 表達明顯受到抑制，間質(zhì)細胞標志成分神經(jīng)型鈣黏附蛋白（neurotype cadherin，N-cadherin）與α-SMA 表達升高，E-cadherin 的表達水平能反映出肝纖維化的程度，其表達水平越低，說明肝纖維化水平越重［50］。TGF-β1/Smad 信號傳導通路是HSC 活化與增殖的關鍵通路［51-53］，TGF-β1 是肝纖維化進程中誘發(fā)EMT 的環(huán)節(jié)上其關鍵作用的細胞因子。通過影響TGF-β1/Smad 信號通路的傳導，在細胞核內(nèi)誘導調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SRC-1、Twist 的過分表達，繼而促使HSC 向EMT進展［54］。本研究表明，與空白組比較，肝纖維化模型組α-SMA mRNA 表達水平顯著增高，E-cadherin mRNA 表達明顯下降。與病理模型組相比，柔肝化纖顆粒組α-SMA mRNA 表達水平顯著降低，E-cadherin mRNA 表達水平明顯增高，提示柔肝化纖顆?？赡芡ㄟ^減輕EMT 的發(fā)生從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

綜上所述，柔肝化纖顆粒能有效抑制肝纖維組織增生，降低CCl4聯(lián)合花生油復合溶液聯(lián)合誘導肝纖維化大鼠血清的ALT、AST 水平，其抗肝纖維化機制可能是通過保護肝功能、降低氧化應激水平、下調(diào)α-SMA 蛋白的表達、上調(diào)E-cadherin 蛋白的表達、抑制細胞EMT 從而對CCl4復合因素誘導肝纖維大鼠化發(fā)揮治療作用。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。