呂敏玲，鐘 欣，李 靜，3，黃 琦，馬夢情，孫嘉玲，周小舟

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院肝病科，廣東 深圳 518033；3.澳門科技大學(xué)，中國澳門 999078）

當(dāng)前肝癌仍是全球性的健康挑戰(zhàn)，其發(fā)病率正在逐年上漲。其中，原發(fā)性肝癌是我國高發(fā)的，對人們的健康造成極大危害的惡性腫瘤之一。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）約占原發(fā)性肝癌總病例數(shù)的90%［1］，是第六大常見的腫瘤和第三大癌癥死亡原因［2］。盡管已有許多針對肝癌的治療手段，但由于HCC 具有異質(zhì)性，其療效及預(yù)后仍不盡人意。肝癌屬于中醫(yī)學(xué)中的“積聚”、“癥瘕”、“鼓脹”等病證?；谥嗅t(yī)理論的遣方用藥在治療肝癌方面效果顯著，在控制肝癌的進展、延緩其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、提高患者的生存率、改善其生活質(zhì)量等具有獨特優(yōu)勢［3，4］。因此，基于中醫(yī)藥學(xué)理論從傳統(tǒng)中藥尋找并開發(fā)針對HCC 的有效抗腫瘤藥物成分不失為切實可行的研究策略。

香加皮來源于蘿蘑科植物杠柳，為常用傳統(tǒng)中藥，本品性溫，味辛苦，歸肝、腎、心經(jīng)，杠柳甙元（Periplogenin，PPG）為其主要化學(xué)成分之一［5］。據(jù)文獻報道，PPG 具有顯著的抗腫瘤效果：其通過靶向STAT3、BIP-eIF2α- CHOP 和IRE1α-ASK1-JNK等信號通路抑制各種腫瘤的生長及促進其凋亡［6-8］，但目前關(guān)于PPG 針對HCC 的抗腫瘤作用研究較少，其如何影響肝癌細胞的惡性生物學(xué)行為，及其作用機制尚未完全明確。因此，本文以探討PPG 對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移的調(diào)控及作用機制為研究目標(biāo)，為肝癌的治療發(fā)掘新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3B 人肝癌細胞系（美國模式培養(yǎng)物集存庫）；杠柳甙元（Periplogenin，PPG）（批號：S9168，上海藍木化工有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶、1×PBS 緩沖液（美國Gibco 公司）；CCK-8 細胞活性檢測試劑、結(jié)晶紫染色液（批號：c0043、C0121，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；細胞核染料PI 染色液（即用型）（批號：KGA1018，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Cleaved Caspase-3/Caspase-3（1∶800 稀 釋）抗體（批號：19677-1-AP，美國Proteintech 公司）；Bcl-2（1∶800 稀釋）抗體、MMP-9（1∶1 000 稀釋）抗體、HRP 標(biāo)記的IgG 二抗（1∶2 000 稀釋）抗體（批號：ab182858、ab38898、ab6721，英 國Abcam 公 司）；GAPDH（1∶1 000 稀釋）抗體（批號：2118s，美國CST 公司）；DMSO（北京Solarbio 公司）；DAPI 染色液（即用型）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、蛋白上樣緩沖液（5×）（批號：BL105A、BL522A、BL502B，北京蘭杰柯科技有限公司）；RIPA 裂解液、預(yù)染蛋白Marker、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（批號：89900、26616、23227、34578，賽默飛世爾科技有限公司）；蛋白酶抑制劑（批號：4693132001，瑞士羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 高糖DMEM 完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素雙抗，用于培養(yǎng)Hep3B 細胞，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞貼壁，生長密度達80%～90%時，用1×PBS 緩沖液清洗2 次，胰蛋白酶進行細胞消化，1∶2 比例傳代，使用對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組 分為空白組、PPG 干預(yù)組?？瞻捉M的Hep3B 細胞未行處理，PPG 組的Hep3B 細胞根據(jù)藥物作用效果在半抑制濃度前后分別選取2.5、5、12.5 μmol/mL 濃度的PPG 干預(yù)48 h。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 將Hep3B 細胞接種于96 孔板，密度為2×104個/孔，過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培養(yǎng)基干預(yù)Hep3B 細胞48 h，并預(yù)空白調(diào)零孔，每組至少3 個復(fù)孔，48 h 后棄去培養(yǎng)基，各組細胞中加入含10 μL CCK-8 試劑的無血清DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)避光孵育1 h，使用酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定各組光密度值（OD 值），計算PPG 對Hep3B 細胞活力的抑制作用，計算公式：細胞增殖抑制率（%）=［1-（OD 值實驗孔-OD 值調(diào)零孔）/（OD 值對照孔-OD 值調(diào)零孔）］×100%。

1.2.4 平板克隆形成實驗觀察細胞增殖狀況 各組Hep3B 細胞經(jīng)PPG 處理后以1 000 個/孔均勻鋪蓋到6 孔板中，定期更換培養(yǎng)液，待2 周后每個克?。?0 個細胞即為陽性克隆，棄去原培養(yǎng)液，PBS 緩沖液洗滌1 次，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，雙蒸水洗凈染色液，晾干，拍照，統(tǒng)計每孔克隆形成數(shù)。

1.2.5 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 將Hep3B細胞接種于6 孔板，密度為5×105個/孔，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培養(yǎng)基干預(yù)Hep3B 細胞，干預(yù)48 h后使用倒置顯微鏡進行拍照。

1.2.6 DAPI/PI 染色實驗觀察細胞凋亡狀態(tài) 處于對數(shù)生長期的Hep3B 細胞以0.8×105個/孔的細胞密度接種于24 孔板，過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別加入濃度為（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培養(yǎng)基干預(yù)Hep3B 細胞48 h 后棄去原培養(yǎng)液，PBS 緩慢輕柔沖洗3 次，加入PI 染色液，每孔500 μL，室溫避光作用5～10 min，棄去PI 染色液，PBS 緩慢輕柔洗滌3 次，每次3 min，使用預(yù)冷甲醇溶液固定通透10 min，棄去甲醇，PBS 緩慢輕柔洗滌3 次，每次3 min，加入DAPI 染色液，每孔500 μL，室溫避光作用5～10 min，棄去DAPI 染色液，PBS 緩慢輕柔洗滌3 次，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，360 nm 激發(fā)波長觀察細胞。

1.2.7 劃痕實驗觀察細胞遷移能力 處于對數(shù)生長期的Hep3B 細胞以5×105個/孔的細胞密度接種于6孔板，過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后，使用無菌移液槍頭沿垂直線快速刮板底部的細胞層，刮板后PBS 緩慢輕柔洗滌2 次，分別加入濃度為（0、2.5、5、12.5 μmol/mL）PPG 培養(yǎng)基干預(yù)Hep3B 細胞，在干預(yù)后0 h 及48 h 在顯微鏡下觀察細胞遷移程度并拍照，并根據(jù)劃痕愈合情況計算細胞遷移率。遷移率=［（0 h 遷移距離-48 h遷移距離）／0 h遷移距離］×100%。

1.2.8 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved Caspase-3/Caspase3、Bcl-2）、遷移相關(guān)蛋白（MMP-9）Hep3B 細胞按照上述1.2.3 方法分組處理48 h后，棄原培養(yǎng)液，PBS 洗2 次后加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰面上裂解，細胞刮刮取細胞，離心后取上清，BCA 法測蛋白濃度，制備15% 的SDSPAGE 凝膠，各組取等量蛋白樣品并加入上樣緩沖液上樣，進行凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別使用相應(yīng)比例的一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的IgG 二抗室溫孵育1 h，用ECL 發(fā)光液顯影，以GAPDH 作為內(nèi)參，Image Lab軟件分析各組目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

上述實驗均重復(fù)3 次，使用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，使用單因素方差分析法（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計處理，以（±s）表示；非正態(tài)分布時，使用非參數(shù)檢驗法進行統(tǒng)計處理，以中位數(shù)（P25，P75）表示；當(dāng)P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPG 對Hep3B 細胞增殖抑制率

分別用不同濃度的PPG 干預(yù)Hep3B 細胞后，CCK-8 結(jié)果表明（表1），PPG 能夠有效抑制Hep3B細胞的增殖，并呈濃度及時間依賴性，隨著PPG 濃度增加及時間的推移，對Hep3B 細胞的抑制率依次升高（P＜0.05）。

表1 各組Hep3B 細胞增殖抑制率的比較（±s）Tab 1 Comparison of proliferation inhibition rates of Hep3B in each group（±s）

表1 各組Hep3B 細胞增殖抑制率的比較（±s）Tab 1 Comparison of proliferation inhibition rates of Hep3B in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別劑量（μmol/mL）細胞增殖抑制率（%）空白組2.5 μM 組5 μM 組7.5 μM 組10 μM 組12.5 μM 組F48 h 0 20.74±6.94 37.70±2.76*51.09±3.77*73.95±1.83*76.81±2.62*203.828 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 24 h 0 18.20±4.70*24.30±3.74*27.31±3.32*24.00±4.20*26.50±4.91*21.717

2.2 PPG 對Hep3B 克隆形成能力的影響

不同濃度的PPG 干預(yù)Hep3B 細胞后，Hep3B 的克隆群落隨著干預(yù)濃度的增加而減少（均P＜0.05）見圖1 及表2。

圖1 各組Hep3B 細胞的克隆形成能力比較Fig 1 Comparison of clone forming abilities of Hep3B in each group

表2 各組Hep3B 細胞克隆形成數(shù)比較（±s）Tab 2 Comparison of clone formation numbers of Hep3B in each group（±s）

表2 各組Hep3B 細胞克隆形成數(shù)比較（±s）Tab 2 Comparison of clone formation numbers of Hep3B in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜ 0.05。

組別克隆形成數(shù)劑量（μmol/mL）空白組2.5 μM 組5 μM 組12.5 μM 組F39.33±8.50 22.33±10.12*12.33±3.51*7.33±1.53*12.634 0 2.5 5.0 12.5

2.3 PPG 對Hep3B 細胞的形態(tài)及凋亡的影響

不同濃度的PPG 干預(yù)Hep3B 細胞后，可觀察到細胞體積縮小，細胞核固縮或破裂等細胞凋亡現(xiàn)象，并隨著干預(yù)濃度增加，活細胞密度減少，凋亡細胞逐漸增多，見圖2、3。

圖2 各組Hep3B 細胞的形態(tài)及密度比較（×200 倍）Fig 2 Comparison of the morphology and density of Hep3B in each group（×200）

圖3 各組Hep3B 細胞的PI 染色比較（×100 倍）Fig 3 Comparison of PI staining of Hep3B in each group（×100）

2.4 PPG 對Hep3B 細胞遷移能力的影響

如圖4、表3 所示，與空白對照組相比較，Hep3B細胞的劃痕愈合率隨著干預(yù)濃度的增加而降低（P＜0.05），說明PPG 能夠抑制Hep3B 細胞的遷移。

表3 各組Hep3B 細胞遷移率比較［中位數(shù)（P25，P75）］Tab 3 Comparison of cell mobility of Hep3B in each group［Median（P25，P75）］

圖4 各組Hep3B 細胞的遷移能力比較（×100 倍）Fig 4 Comparison of migration abilities of Hep3B in each group（×100）

2.5 PPG 對Hep3B 細胞中凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3）表達水平的影響

與空白組相比，PPG 處理Hep3B 細胞后Bcl-2蛋白水平降低，Cleaved Caspase-3/Caspase-3 水平升高，并呈濃度依賴性（P＜0.05）。見圖5 及表4。

圖5 各組Hep3B 細胞中Caspase3、C-Caspase3、Bcl-2 蛋白表達的比較Fig 5 Comparison of Caspase3，C-Caspase3 and Bcl-2 protein expressions in Hep3B in each group

表4 各組Hep3B 細胞Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平變化比較（±s）Tab 4 Comparison of the expression levels of Cleaved Caspase-3/Caspase-3 and Bcl-2 proteins in Hep3B in each group（±s）

表4 各組Hep3B 細胞Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平變化比較（±s）Tab 4 Comparison of the expression levels of Cleaved Caspase-3/Caspase-3 and Bcl-2 proteins in Hep3B in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜ 0.05。

組別Bcl-2劑量（μmol/mL）Cleaved Caspase-3/Caspase-3空白組2.5 μM 組5 μM 組12.5 μM 組F0 2.5 5.0 12.5 0.44±0.24 0.64±0.39 0.95±0.45 1.91±0.70*0.85±0.03 0.45±0.15*0.39±0.15*0.41±0.10*10.065 5.607

2.6 PPG 對Hep3B 細胞中MMP9 蛋白表達水平的影響

與空白組相比，PPG 處理Hep3B 細胞后MMP-9 蛋白水平降低，并呈濃度依賴性（P＜0.05）。見圖6 及表5。

表5 各組Hep3B 細胞MMP-9 蛋白表達水平變化比較（±s）Tab 5 Comparison of MMP-9 protein expression levels in Hep3B in each group（±s）

表5 各組Hep3B 細胞MMP-9 蛋白表達水平變化比較（±s）Tab 5 Comparison of MMP-9 protein expression levels in Hep3B in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜ 0.05。

MMP-9 0.57±0.05 0.41±0.17 0.33±0.08 0.20±0.05*7.120組別空白組2.5 μM 組5 μM 組12.5 μM 組F劑量（μmol/mL）0 2.5 5.0 12.5

圖6 各組Hep3B 細胞中MMP-9 蛋白表達的比較Fig 6 Comparison of MMP-9 protein expression in Hep3B in each group

3 討論

肝細胞癌（HCC）為最常見的實體惡性腫瘤之一，其腫瘤發(fā)生是一個涉及多種危險因素的復(fù)雜過程。近年來，HCC 的非藥物療法和藥物療法取得較快的發(fā)展。然而，盡管HCC 有多種治療方法，患者的總體生存率仍遠未令人滿意，對更有效的治療方法的需求仍未得到滿足。因此，開發(fā)一種針對HCC的有效藥物成分，以阻遏HCC 發(fā)生發(fā)展意義重大。中醫(yī)認為，肝癌的發(fā)生主要由于肝、脾、腎諸臟腑功能失調(diào)，氣血升降失調(diào)，水液氣化失司，久而生風(fēng)、濕、痰、熱、瘀等邪氣，遷延日久，邪氣久客體內(nèi)，氣、血、水等相互結(jié)聚體內(nèi)，聚于腹腔，常合并腹水［9］。香加皮能夠利水消腫、溫通祛風(fēng)滲濕。越來越多的證據(jù)表明，香加皮的提取物及其活性成分能夠發(fā)揮顯著的抗腫瘤活性［10］。杠柳甙元（PPG）是香加皮中的主要活性化學(xué)成分，但PPG 對肝癌的作用機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，PPG 能夠有效抑制肝癌Hep3B 細胞的增殖和遷移，促進Hep3B 的凋亡，并且具有劑量依賴性。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PPG處理的Hep3B 細胞Caspase-3 蛋白表達降低，Cleaved Caspase-3 蛋白表達上調(diào)，同時抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達水平降低，誘導(dǎo)Hep3B 細胞的凋亡。在腫瘤細胞的殺傷中細胞凋亡是至關(guān)重要的一環(huán)。Caspase 家族能夠促進細胞的程序性死亡，是一組高度保守的細胞內(nèi)蛋白水解酶，在細胞凋亡中扮演關(guān)鍵的生物角色［11-13］。在細胞凋亡的過程中，Caspase-3 被激活并開始分解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞死亡，因此成為重要的抗癌治療的主要目標(biāo)［14］。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，其介導(dǎo)的對內(nèi)在凋亡途徑的抵抗是惡性腫瘤的一個標(biāo)志，針對抗凋亡Bcl-2 蛋白是癌癥治療中一個具有吸引力的策略［15，16］。本研究結(jié)果表明，PPG 可能通過調(diào)控Caspase 通路蛋白及Bcl-2蛋白抑制肝癌細胞增殖，在肝癌細胞凋亡誘導(dǎo)方面發(fā)揮著抗腫瘤的作用。

大多數(shù)惡性腫瘤具有高度的遷移和侵襲的能力，并與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中，PPG 還具有降低Hep3B 細胞MMP-9 蛋白表達水平的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在細胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）的重塑、轉(zhuǎn)移、血管生成、細胞凋亡和癌癥進展中發(fā)揮重要作用，其在各種類型癌癥中的表達水平常升高，因此，MMP-9 及其抑制劑可能是抗癌藥物的重要目標(biāo)［17，18］。本研究提示PPG可能通過MMP-9 通路調(diào)控肝癌細胞Hep3B 的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，PPG 可有效抑制肝癌Hep3B 細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，其作用機制可能與激活Caspase 信號通路、抑制MMP-9 活性相關(guān)，為一種治療肝癌的潛在藥物。

作者貢獻度說明：

呂敏玲：進行研究構(gòu)思、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、文稿起草；鐘欣、李靜：參與實驗方案設(shè)計、文稿修改、實驗技術(shù)指導(dǎo)；黃琦：參與細胞培養(yǎng)；馬夢情：參與細胞增殖抑制檢測、Western blot 實驗；孫嘉玲：提供研究經(jīng)費支出、技術(shù)支持；周小舟：負責(zé)研究構(gòu)思、研究經(jīng)費支出、文稿修正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。