袁 月 蒲雯婕 何毅剛 王 玲

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，甘肅省蘭州市 730000； 2 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 蘭州市婦幼保健院； 4 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院

高原是一個(gè)特殊的低壓低氧環(huán)境，其大氣物理、地球化學(xué)生態(tài)結(jié)構(gòu)與平原相差十分顯著[1]。當(dāng)人體急進(jìn)高原，短時(shí)間內(nèi)機(jī)體會(huì)因缺氧做出應(yīng)激反應(yīng)，而缺氧對(duì)體內(nèi)物質(zhì)代謝具有顯著的影響進(jìn)而發(fā)生各種臨床癥候群，稱為急性高原病(Acute mountain sickness，AMS)。全世界高海拔地區(qū)常住人口約占世界總?cè)丝诘?2%，缺氧是高原居民不得不面臨的自然因素[2]。由于我國(guó)對(duì)高原地區(qū)基建和國(guó)家軍事需求的增加等因素，使得從平原進(jìn)駐高原的人群正在不斷增加，因此近些年來(lái)，關(guān)于如何減輕高原缺氧對(duì)機(jī)體的損傷成為關(guān)注的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)已有研究證實(shí)[3]，高原會(huì)使女性性激素水平出現(xiàn)明顯變化，但具體機(jī)制尚不完全明確，因此構(gòu)建高原低壓低氧卵巢組織損傷的模型，是進(jìn)行高原相關(guān)女性生殖系統(tǒng)疾病研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究旨在探索6 500m海拔時(shí)，不同留置時(shí)長(zhǎng)對(duì)小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響，為選擇合適時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行高原低壓低氧雌性小鼠卵巢功能損傷模型的建立，以及為在平原地區(qū)進(jìn)行模擬高原女性生殖系統(tǒng)疾病預(yù)防治療的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 60只SPF級(jí)19～23g雌性C57BL/6J小鼠[購(gòu)自斯貝福(北京)公司]，合格證號(hào)：SCXK(京)2019-0010 ，隨機(jī)分為高原5d、10d、15d和20d組及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(當(dāng)?shù)睾０?，每組12只。高原各組小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)的低壓高原艙中，溫度控制在21～24℃，濕度約50%，升降速度為5～10m/s達(dá)到模擬海拔6 500m高度，每2d開艙打掃衛(wèi)生、更換食水約30min，其余時(shí)間均連續(xù)模擬高原環(huán)境，晝夜12h，自由進(jìn)食進(jìn)水。對(duì)照組于SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)同高原組進(jìn)食方式飼養(yǎng)。本研究所有動(dòng)物方案均符合倫理標(biāo)準(zhǔn)(科研倫理審批編號(hào)：2021KYLL124)。

1.2 主要試劑與儀器 模擬高原低壓高原動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限責(zé)任公司)；TG16-WS 臺(tái)式高速離心(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；多聚甲醛固定液(北京索萊寶公司)；電鏡固定液(北京索萊寶公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；透視電鏡顯微鏡(Hitachi)臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生理同步化：成功分組的小鼠，先飼養(yǎng)于同一平原環(huán)境下進(jìn)行生理同步化。給予左炔諾孕酮炔雌醚片灌胃，藥物濃度為人體的2倍，根據(jù)小鼠動(dòng)情周期每5d灌胃1次，本次實(shí)驗(yàn)共灌胃2次。每日上午8—10點(diǎn)行陰道涂片觀察小鼠動(dòng)情周期的變化。

1.3.2 標(biāo)本采集:分別于0d及入低壓氧艙5d、10d、15d和20d后出艙稱重，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠雙側(cè)卵巢稱重;右側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制備連續(xù)切片；左側(cè)卵巢置于電鏡固定液4℃保存，待做透視電鏡制片。

1.3.3 計(jì)算小鼠卵巢指數(shù):取小鼠左右兩側(cè)卵巢，稱濕重，計(jì)算卵巢指數(shù)(卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢重量/體重×100%)。

1.3.4 HE染色觀察小鼠卵巢形態(tài):摘除小鼠右側(cè)卵巢組織，清洗干凈放置在 4%多聚甲醛中固定48h，取出卵巢組織行石蠟包埋，切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，分化，氨水反藍(lán)后伊紅染色，脫蠟脫水，最后中性樹膠封片觀察。

1.3.5 透視電鏡觀察卵巢超微結(jié)構(gòu):取小鼠右側(cè)卵巢組織，置于電鏡固定液4℃保存，磷酸緩沖液PB漂洗3次固定。取出卵巢組織繼續(xù)磷酸緩沖液PB進(jìn)行后固定、乙醇梯度脫水、丙酮滲透包埋、切片、鈾鉛雙染色，最后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布運(yùn)用單因素方差分析，非正態(tài)分布進(jìn)行K 個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用one-way ANOVA進(jìn)行對(duì)比分析，P< 0.05(95%置信區(qū)間)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生理同步化 用左炔諾孕酮炔雌醚片灌胃前的小鼠陰道涂片結(jié)果顯示：處于動(dòng)情期27只、動(dòng)情前期10只、動(dòng)情后期7只、動(dòng)情間期16只。1次灌胃后每日涂片，第4天涂片結(jié)果顯示：處于動(dòng)情期42只、動(dòng)情前期6只、動(dòng)情后期3只、動(dòng)情間期9只；2次灌胃后繼續(xù)每天涂片，在第4天涂片結(jié)果顯示小鼠均處于動(dòng)情期，完成生理同步。

2.2 小鼠體重及卵巢指數(shù)的變化 高原各組小鼠入出艙前后體重對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中高原5d、10d、20d組有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1)；高原15d組有顯著高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。對(duì)于卵巢指數(shù)高原組與對(duì)照組相比：對(duì)照組與高原5d、10d、15d、20d組組間有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1)，其中高原5d組與高原15d、20d組有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1)；高原10d組與高原20d組間有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高原15d組與高原20d組間差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1～2。

圖1 高原組小鼠體重對(duì)比

圖2 各組小鼠卵巢指數(shù)

2.3 小鼠卵巢形態(tài)的變化

2.3.1 HE染色觀察小鼠卵巢形態(tài)：見表1、圖3。取材時(shí)見對(duì)照組卵巢外觀呈均勻粉紅色，而高原各組卵巢外觀可見部分紫紺，以高原15、20d組最為明顯，且高原各組較對(duì)照組的卵巢體積減小。與對(duì)照組相比：高原5d、10d、15d、20d組的HE染色顯示光鏡下卵巢髓質(zhì)內(nèi)血管增生擴(kuò)張充血、水腫，部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液及紅細(xì)胞碎片，卵泡及黃體內(nèi)也見壞死的細(xì)胞碎片；高原各組卵巢髓質(zhì)內(nèi)原始卵泡和成熟卵泡數(shù)量有不同程度的減少，但閉鎖卵泡數(shù)量增加。

表1 各組HE染色結(jié)果

對(duì)照組 高原5d組 高原10d組 高原15d組 高原20d組

2.3.2 透視電鏡下觀察卵巢超微結(jié)構(gòu)：見表2、圖4。觀察卵巢超微結(jié)構(gòu)可見對(duì)照組的卵母細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)尚可，細(xì)胞膜未見明顯破損，且細(xì)胞器均勻分布，皮質(zhì)顆粒(CG)數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)致密，分布細(xì)胞膜周圍；線粒體(M)膜完整，嵴存在；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)膜完整；高爾基體(Go)未見明顯增生肥大，自噬溶酶體(ASS)個(gè)別存在。與對(duì)照組相比：高原5d、10d、15d、20d組的電鏡結(jié)果示卵母細(xì)胞、CG、M、RER、Go均隨著在高海拔留置時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷程度呈遞進(jìn)式增加；ASS數(shù)量也是呈遞進(jìn)式增加。

表2 各組電鏡結(jié)果

對(duì)照組 高原5d組 高原10d組 高原15d組 高原20d組

3 討論

高原地區(qū)是指地勢(shì)較為遼闊，且能使人體產(chǎn)生顯著生物學(xué)效應(yīng)、海拔3 000m以上的地區(qū)，約占地球表面積的1/5[4]。據(jù)報(bào)道近1/4平原人在進(jìn)入高原后會(huì)發(fā)生AMS，癥狀主要包括頭痛、惡心、疲倦及睡眠障礙等，其中約1%可發(fā)展為高原性腦水腫[5]。因有著低壓低氧、強(qiáng)紫外線、低氣溫等特點(diǎn)，高原是作為一個(gè)獨(dú)立的生態(tài)系統(tǒng)存在。這獨(dú)特環(huán)境影響機(jī)體正常的生理機(jī)能，其中低氧是最主要的影響因素。已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[6]，低氧與小鼠卵泡發(fā)育減少有關(guān)。為解決因高原低氧環(huán)境所導(dǎo)致的疾病問(wèn)題，建立動(dòng)物模型是主要研究手段。對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇是建立模型的重要前提之一。本實(shí)驗(yàn)選擇體內(nèi)雜質(zhì)少常用于在生殖、遺傳領(lǐng)域的C57BL/6小鼠，鼠齡為8周齡，已達(dá)到性成熟期，生殖系統(tǒng)發(fā)育完善，可以完成自主交配，相當(dāng)于人年齡階段18～20歲。根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究[7]，雄鼠的高原生殖系統(tǒng)損傷模型的建立選擇海拔高度為6 000m。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)做海拔6 000m及7 000m，結(jié)果6 000m海拔需要28d高原組與對(duì)照組才能達(dá)到較為明顯的差異；而低壓氧艙高度升7 000m時(shí)，小鼠無(wú)法耐受缺氧環(huán)境，約70%鼠在第2天死亡。故本研究采用低壓氧艙模擬海拔6 500m高原低壓低氧環(huán)境，動(dòng)態(tài)研究低壓低氧對(duì)C57BL/6小鼠卵巢組織的影響，對(duì)于高原環(huán)境對(duì)人機(jī)體的影響開展高原生殖損傷研究。

下丘腦—腺垂體—性腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal axis，HPA)可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的周期性變化。為避免生理周期的不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，使用雌孕激素藥物，抑制丘腦下部—垂體—卵巢軸來(lái)抑制卵巢排卵，對(duì)小鼠進(jìn)行生理同步化[8]。體重變化可以反映高原低氧環(huán)境對(duì)于小鼠攝食功能的影響[9]。對(duì)于機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育，每個(gè)階段都必須有足夠的食物熱量提供，體重的減輕嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起機(jī)體功能器官的體積改變。本次實(shí)驗(yàn)中，高原各組體重較對(duì)照組均下降，且相對(duì)應(yīng)的高原組卵巢指數(shù)較對(duì)照組也下降。即在6 500m海拔，留置時(shí)間越長(zhǎng)，使得小鼠體重減輕及卵巢組織部分萎縮。卵巢指數(shù)是指雙卵巢重量與體重之比，正常時(shí)卵巢與體重的比值比較恒定。受損組織的重量可以發(fā)生改變，故指數(shù)也隨之而改變。卵巢指數(shù)增加，表示組織充血、水腫等；指數(shù)減小，表示組織萎縮或其他退行性改變。據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)，雖高原各組較對(duì)照組均有改變，但高原15d組與20d組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值，說(shuō)明高原留置達(dá)15d時(shí)卵巢萎縮與20d組無(wú)差異。因此，建立6 500m高原低氧的小鼠卵巢損傷模型時(shí)長(zhǎng)，最少需要15d。

卵巢組織病理檢查是診斷卵巢儲(chǔ)備功能的金標(biāo)準(zhǔn)。本次研究發(fā)現(xiàn)高原5d組小鼠卵巢體積略萎縮，雖各級(jí)生長(zhǎng)卵泡均有分布，但卵母細(xì)胞有輕度損傷；M輕度腫脹，嵴減少；RER輕度擴(kuò)張，少量脫顆粒；Go輕度肥大；ASS少量存在；髓質(zhì)血管擴(kuò)張，且見大量壞死紅細(xì)胞。高原10d組的卵母細(xì)胞與M改變同高原5d組，但ASS數(shù)量增多；且卵巢髓質(zhì)血管增生擴(kuò)張明顯，次級(jí)卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞分布不均勻并有部分凋亡，閉鎖卵泡增加。對(duì)于高原15d組可見卵巢組織結(jié)構(gòu)已有破壞，卵母細(xì)胞重度損傷，細(xì)胞器部分崩解，M腫脹明顯、基質(zhì)局部稀疏、嵴減少，RER部分膜破損，ASS存在；髓質(zhì)內(nèi)血管增生明顯、卵泡數(shù)量減少。而高原20d組同高原15d組的病理結(jié)果相似，無(wú)明顯差異性。上述結(jié)果表明，模擬6 500m高原環(huán)境建立小鼠卵巢損傷模型在留置時(shí)長(zhǎng)15d時(shí)，對(duì)小鼠卵巢組織形態(tài)影響最為明顯。

哺乳動(dòng)物性成熟后每個(gè)月經(jīng)周期只有1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟并排卵，其余卵泡發(fā)育到一定程度通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制而退化，稱為卵泡閉鎖[10]。卵泡閉鎖增多意味卵巢儲(chǔ)備功能的下降，是導(dǎo)致某些無(wú)排卵性疾病的主要原因，例如多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)。已有文獻(xiàn)記載[11]，顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因。卵巢是一個(gè)代謝活躍的器官，能產(chǎn)生大量的活性氧。由于卵泡體積大，卵泡卵母細(xì)胞更容易缺氧[12]。線粒體是主要供能的細(xì)胞器，可以為卵泡發(fā)育提供所需能量，促使卵巢排出健康的卵子，發(fā)揮其生殖功能。當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)破壞，能量供應(yīng)不足是誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡，最終造成卵子質(zhì)量低下、卵泡閉鎖增多的重要原因[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著留置高原的時(shí)間延長(zhǎng)，在高原15d組與高原20d組的卵巢生殖細(xì)胞內(nèi)，線粒體腫脹明顯、體積變大，且基質(zhì)局部稀疏，嵴減少。因此線粒體結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致這兩組卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡增加的主要原因。

綜上所述，對(duì)于高原低壓低氧C57BL/6雌性小鼠卵巢功能損傷模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的探索，體重變化、卵巢指數(shù)、卵巢組織病理學(xué)形態(tài)在高原5d組，已經(jīng)發(fā)生變化，而高原15d和20d組時(shí)更為明顯，提示在模擬海拔6 500m高原環(huán)境下，留置時(shí)長(zhǎng)在15d已經(jīng)對(duì)小鼠卵巢功能產(chǎn)生較為嚴(yán)重的損害影響。本次研究制造模型的方法:模擬6 500m海拔，分別留置時(shí)長(zhǎng)為5d、10d、15d、20d，15℃/5℃的晝夜溫差，可以更加接近高原低氧暴露環(huán)境，對(duì)于反映出低壓低氧暴露對(duì)雌性小鼠卵巢功能的損傷可能更為有利，并檢測(cè)得此模型具有一定的良好重現(xiàn)性。