陳 璇，楊 欣，于曉雯，卞 勇，朱 磊，沈 洪

(1. 蘇州科技城醫(yī)院，江蘇 蘇州 215153;2. 鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212003;3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210000;4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛、腹脹或腹部不適為主要癥狀，與排便相關(guān)或伴隨排便習(xí)慣如頻率和(或)糞便性狀改變的一種功能性疾病[1]。根據(jù)糞便性狀改變將IBS分為腹瀉型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)及不確定型(IBS-U)，其中以IBS-D最為多見[2]。目前，IBS的發(fā)生機(jī)制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，如精神心理障礙、內(nèi)臟高敏感、腸道菌群失調(diào)、腦腸互動異常等[3]。所以西醫(yī)的對癥治療解決不了IBS復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，而中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多通路的作用過程更適合IBS的治療[4]。中醫(yī)藥在IBS-D治療方面積累了豐富的經(jīng)驗。一項關(guān)于IBS-D中醫(yī)證候規(guī)律的研究顯示，肝郁脾虛證為其最常見證型，占33.66%[5]。另一項文獻(xiàn)檢索研究顯示，關(guān)于IBS-D肝郁脾虛證的治療以痛瀉要方為基礎(chǔ)方加減的占84%[6]。由此可見，痛瀉要方是治療IBS-D肝郁脾虛證的主要方劑。多篇薈萃分析顯示，痛瀉要方治療IBS-D臨床療效較好，且安全性高[7-8]。但是目前痛瀉要方作用機(jī)制仍不夠系統(tǒng)和全面，特別是在代謝組學(xué)研究方面，未見有糞便代謝組學(xué)方面的研究報道。故本研究擬通過代謝組學(xué)方法探討痛瀉要方干預(yù)后大鼠糞便中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，以闡釋其藥理作用，為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗材料與方法

1.1動物 健康雄性SPF級SD大鼠40只，體重180～200 g，購于杭州醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗動物使用許可證號：SCXK(浙)2019-0002。本實(shí)驗動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心，實(shí)驗室環(huán)境保持溫度和相對濕度分別在20～25 ℃及40%～60%，適應(yīng)環(huán)境并自由飲食3 d。本實(shí)驗獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(202104A029)。

1.2藥材與試劑 痛瀉要方顆粒劑(炒白術(shù)30 g、炒白芍20 g、炒陳皮15 g、炒防風(fēng)10 g)由江陰天江藥業(yè)有限公司提供；匹維溴銨片(法國Abbott Products公司，進(jìn)口藥品注冊證號H20120127)；番瀉葉(蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號：200221010)。根據(jù)公式[標(biāo)準(zhǔn)大鼠每克用藥量=成人用藥量×大鼠與人體體表比(0.018)/標(biāo)準(zhǔn)大鼠體重(200 g)]配置藥液，番瀉葉、匹維溴銨片及痛瀉要方配方顆粒成人用藥量分別按50 g、150 mg、75 g計算。將番瀉葉加水浸泡30 min，煎煮8 min，取上清液，濃縮至最終濃度相當(dāng)于含生藥0.45 g/mL藥液。匹維溴銨片及痛瀉要方配方顆粒研粉，溶于蒸餾水中，分別配制成1.35 mg/mL、0.675 g/mL濃度懸混液。以上藥液4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。HPLC級別Methanol、Acetonitrile、Formic Acid和LC-MS級別Water由Fisher Chemical及CNW廠家提供，HPLC級別2-Propanol由Merck廠家提供，≥98%的2-Chloro-L-Phenylalanine由Adamas-beta提供。

1.3儀器與設(shè)備 Vanquish Horizon system UHPLC液相色譜系統(tǒng)(Thermo Scientific)，Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)，NewClassic MF MS105DU電子天平(METTLER TOLEDO)，Centrifuge 5424R、5430R冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，SBL-10TD控溫超聲波清洗機(jī)-10L(寧波新芝生物科技股份有限公司)，Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司)，LNG-T88臺式快速離心濃縮干燥器(太倉市華美生化儀器廠)，JXDC-20氮?dú)獯祾邇x(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4實(shí)驗方法 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為4組，每組10只。除空白組外，其余組大鼠參考文獻(xiàn)[9-10]方法，采用慢性束縛應(yīng)激加番瀉葉灌服法建立IBS-D肝郁脾虛證模型：造模大鼠實(shí)驗前10 h禁食不禁水，予以番瀉葉水煎劑1 mL/100 g灌胃，每日1次，灌胃后用寬透明膠帶束縛大鼠肩部及前肢和胸腹部，使大鼠無法用前肢抓搔頭面，每天定時約1 h，連續(xù)造模14 d。之后空白組及模型組大鼠給予1 mL/100 g蒸餾水灌胃，痛瀉要方組及匹維溴銨組給予1 mL/100 g相應(yīng)混懸液灌胃，均每日1次，連續(xù)灌胃14 d。每7 d稱大鼠體重1次，以調(diào)整藥量。

1.5標(biāo)本收集與處理 末次灌胃后處死大鼠，收集直腸中糞便，EP管分裝，-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗時從每份樣本中取50 mg糞便樣品至1.5 mL離心管中，并加入400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1)，含0.02 mg/mL的內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸)，渦旋混勻30 s后，低溫超聲提取30 min(5 ℃，40 kHz)；靜置于-20 ℃，30 min，再離心15 min(13 000×g，4 ℃)，移取上清液，氮?dú)獯蹈桑患尤?00 μL復(fù)溶液(乙腈∶水=1∶1)復(fù)溶；渦旋混勻30 s，低溫超聲萃取5 min(5 ℃，40 kHz)；離心10 min(13 000×g，4 ℃)，移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中上機(jī)分析；另外，每個樣本分別移取20 μL上清液混合后作為質(zhì)控樣本。

1.6LC-MS檢測 使用賽默飛公司的超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive HF-X系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS分析。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm;Waters,Milford,USA)；流動相A為95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1%甲酸)，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40 ℃。

1.7數(shù)據(jù)處理分析方法 先采用PLS-DA(Partial Least Squares Discrimination Analysis)分析方法進(jìn)行組間代謝物差異性比較，然后經(jīng)T檢驗結(jié)合多元分析OPLS-DA方法篩選差異代謝物，通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路注釋，再通過MetPA方法分析差異代謝物對通路的影響，最后采用Spearman相關(guān)性分析腸道差異菌群與糞便差異代謝物之間的聯(lián)系。

2 結(jié) 果

2.1組間代謝物差異性 通過PLS-DA得分圖上樣品分布點(diǎn)的遠(yuǎn)近判斷樣品中所含有的變量或分子的組成和濃度的接近程度，顯示模型組各樣本距離與空白組之間分開較遠(yuǎn)，說明IBS-D肝郁脾虛證大鼠糞便代謝物發(fā)生了變化；痛瀉要方組及匹維溴銨組與模型組各樣本間比較亦有一定距離，說明痛瀉要方及匹維溴銨對IBS-D肝郁脾虛證大鼠糞便中代謝物產(chǎn)生了影響。見圖1。

圖1 空白組與腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證各組大鼠糞便中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物PLS-DA得分圖

2.2差異代謝物分析 組間差異代謝物篩選(同時滿足VIP>1，P<0.05)顯示，模型組與空白組中差異代謝物共47種，其中26種上調(diào)，21種下調(diào)，見圖2；痛瀉要方組與模型組中差異代謝物共31種，其中10種上調(diào)，21種下調(diào)，見圖3；匹維溴銨組與模型組差異代謝物共25種，其中21種上調(diào)，4種下調(diào)，見圖4。對比發(fā)現(xiàn)，有8種物質(zhì)既在模型組與空白組中存在差異，也在痛瀉要方組中存在差異，其中Gamma-Tocotrienol、Porrigenin、Deoxycholic、Amasterol、25-Acetylvulgaroside、Tonantzitlolone在模型組中異常高表達(dá)，痛瀉要方組下調(diào)；Carboxyifosfamide和Ustiloxin在模型組中低表達(dá)，痛瀉要方組上調(diào)。此外，Urobilinogen(尿膽素原)、Pregnan-20-one(孕多糖-20-1)和Hydroxyhomodestruxin(羥基同去絲裂霉素)同時在模型組和匹維溴銨組中存在差異，其中Pregnan-20-one和Hydroxyhomodestruxin在模型組中高表達(dá)，匹維溴銨組下調(diào)；Urobilinogen在模型組中低表達(dá)，匹維溴銨組上調(diào)。

圖2 空白組與腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證模型組大鼠糞便中差異代謝物火山圖

圖3 痛瀉要方組與模型組腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證大鼠糞便中差異代謝物火山圖

圖4 匹維溴銨組與模型組腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證大鼠糞便中差異代謝物火山圖

2.3差異代謝物KEGG通路富集分析 模型組與空白組差異代謝物富集通路共47條，其中屬于Metabolism 31條、Environmental Information Processing 3條、Genetic Information Processing 1條、Human Diseases 5條、Organismal Systems 7條，富集率差異有統(tǒng)計學(xué)意義的共19條，其中Central carbon metabolism in cancer(癌癥中的中樞碳代謝)和Glycine, serine and threonine metabolism(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)有極顯著差異(P均<0.001)，見圖5；痛瀉要方組與模型組差異代謝物富集通路共13條，屬于Metabolism 11條、Organismal Systems 2條，其中Purine metabolism(嘌呤代謝)、Cholesterol metabolism(膽固醇代謝)、Caffeine metabolism(咖啡因代謝)、Arginine biosynthesis(精氨酸生物合成)和Vitamin B6metabolism(維生素B6代謝)富集率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見圖6；匹維溴銨組與模型組差異代謝物富集通路共10條，屬于Metabolism 8條、Organismal Systems 2條，其中Cholesterol metabolism(膽固醇代謝)、Primary bile acid biosynthesis(初級膽汁酸生物合成)富集率有極顯著差異(P均<0.001)，Caffeine metabolism(咖啡因代謝)、Taurine and hypotaurine metabolism(牛磺酸和低?；撬岽x)、Secondary bile acid biosynthesis(次生膽汁酸生物合成)和alpha-Linolenic acid metabolism(α-亞麻酸代謝)富集率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見圖7。

圖5 空白組與腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證模型組大鼠糞便中差異代謝物KEGG通路富集分析圖

圖7 匹維溴銨組與模型組腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證大鼠糞便中差異代謝物KEGG通路富集分析圖

2.4差異代謝物對通路的影響分析 MetPA分析并繪制KEGG通路拓?fù)錃馀輬D顯示，對模型組和空白組影響相對較大的是Glycine,serine and threonine metabolism(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)，其次是Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨基酰基-tRNA生物合成)、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism(乙醛酸和二羧酸代謝)、Methane metabolism(甲烷代謝)及Citrate cycle(檸檬酸循環(huán))；對痛瀉要方組與模型組影響相對較大的是Purine metabolism(嘌呤代謝)，其次是Caffeine metabolism(咖啡因代謝)、Vitamin B6metabolism(維生素B6代謝)、Arginine biosynthesis(精氨酸生物合成)和Primary bile acid biosynthesis(初級膽汁酸生物合成)；對匹維溴銨組與模型組影響相對較大的是Primary bile acid biosynthesis(初級膽汁酸生物合成)，其次是Caffeine metabolism(咖啡因代謝)、Taurine and hypotaurine metabolism(?；撬岷痛闻；撬岽x)、Arachidonic acid metabolism(花生四烯酸代謝)和Purine metabolism(嘌呤代謝)。見圖8。

圖中每個氣泡表示1個KEGG通路，橫軸表示代謝物在通路中的相對重要性的大小，氣泡越大表示重要性越大；縱軸表示代謝物參與通路的富集顯著性，顏色代表通路富集的P值圖8 空白組與腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛證各組大鼠糞便中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物KEGG 拓?fù)鋵W(xué)分析氣泡圖

3 討 論

本研究篩選出模型組與空白組中差異代謝物共47種，痛瀉要方組與模型組中差異代謝物共31種，匹維溴銨組與模型組差異代謝物共25種。其中Deoxycholic acid、Gamma-Tocotrienol、Carboxyifosfamide、25-Acetylvulgaroside等8種代謝物在模型組與空白組中存在差異，且經(jīng)痛瀉要方干預(yù)后明顯改善。Deoxycholic acid是次級膽汁酸中的一種，可以促進(jìn)脂肪分解，然而有研究表明過高濃度的Deoxycholic acid可以增加結(jié)腸黏膜的通透性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，Deoxycholic acid在上述8種差異代謝物中豐度最高，與空白組相比，模型組上調(diào)1.18倍；經(jīng)痛瀉要方干預(yù)后下降0.43倍，且接近空白組，說明痛瀉要方對Deoxycholic acid具有較好的調(diào)節(jié)作用。王勁松等[12]研究顯示，Deoxycholic acid灌胃可以誘導(dǎo)大鼠短暫輕微的結(jié)腸炎癥和持續(xù)穩(wěn)定的內(nèi)臟痛覺過敏，并且增加了脊髓背根神經(jīng)節(jié)上c-fos mRNA的表達(dá)，因此認(rèn)為Deoxycholic acid可能在某些IBS的痛覺過敏中發(fā)生作用。Gamma-Tocotrienol為維生素E家族成員，是一種天然的抗氧化劑，其可通過加速間充質(zhì)免疫細(xì)胞的恢復(fù)、阻止腸通黏膜透性增加發(fā)揮保護(hù)放射治療小鼠腸道的作用[13]。

通過差異代謝物KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)模型組與空白組富集的通路有47條，說明IBS-D的形成機(jī)制較為復(fù)雜，且主要與Metabolism(代謝)有關(guān)。痛瀉要方組與模型組富集的通路主要有13條，匹維溴銨組與模型組富集的通路主要有10條。其中痛瀉要方組與模型組、匹維溴銨組與模型組共有的通路6條，分別是Cholesterol metabolism、Primary bile acid biosynthesis、Caffeine metabolism、Secondary bile acid biosynthesis、Purine metabolism及Bile secretion(膽汁分泌)，說明痛瀉要方與匹維溴銨治療IBS-D機(jī)制不完全相同，痛瀉要方組涉及通路更多，作用更全面。如痛瀉要方在Arginine biosynthesis和Tryptophan metabolism方面有優(yōu)勢，而匹維溴銨組不涉及。Arginine biosynthesis對應(yīng)的代謝物質(zhì)是Citrulline，Tryptophan metabolism對應(yīng)的物質(zhì)是N’-Formylkynurenine。模型組中Citrulline、N’-Formylkynurenine含量較空白組明顯升高，經(jīng)痛瀉要方干預(yù)后兩者含量均下調(diào)，特別是N’-Formylkynurenine含量變化更明顯，說明痛瀉要方對IBS-D大鼠糞便中N’-Formylkynurenine代謝紊亂具有較好的調(diào)節(jié)作用。因此，痛瀉要方治療IBS-D的作用機(jī)制之一可能是調(diào)節(jié)N’-Formylkynurenine含量，進(jìn)而影響色氨酸代謝通路。色氨酸是一種人體必需的氨基酸，N’-Formylkynurenine是其代謝物之一，其另一個重要的代謝產(chǎn)物就是5-羥色胺(5-HT)，5-HT與IBS-D內(nèi)臟高敏感相關(guān)。如裘世軻等[14]報道IBS-D肝郁脾虛證大鼠血清中5-HT含量明顯高于正常大鼠，于豐彥等[15]研究發(fā)現(xiàn)IBS-D患者直腸初始感覺閾值、排便閾值、疼痛閾值和肛門直腸收縮壓與5-HT相關(guān)，說明色氨酸代謝通路與IBS-D內(nèi)臟高敏感相關(guān)。故推斷痛瀉要方可以通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝通路降低內(nèi)臟高敏感。

本研究MetPA分析顯示，模型組與空白組L-絲氨酸、L-色氨酸、肌酸對甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路影響最大，痛瀉要方組與模型組次黃嘌呤、黃嘌呤對嘌呤代謝通路影響最大，匹維溴銨組與模型組膽甾-5-烯-3β,26-二醇及?；悄懰釋Τ跫壞懼嵘锖铣赏酚绊懽畲?。嘌呤代謝通路與IBS的關(guān)系研究目前相對較少，2020年美國梅奧診所的一項研究[16]首次將次黃嘌呤與IBS發(fā)病機(jī)制聯(lián)系起來，研究發(fā)現(xiàn)IBS-D中糞便次黃嘌呤的含量顯著降低，這與微生物對次黃嘌呤的降解有關(guān)，認(rèn)為嘌呤代謝的宿主-微生物途徑可能在IBS的病理生理中起重要作用，低水平的嘌呤核苷酸可能導(dǎo)致較低的上皮能量狀態(tài)和黏膜修復(fù)能力，這可能是IBS的病理生理基礎(chǔ)之一，因此他們認(rèn)為次黃嘌呤是有吸引力的藥物靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)IBS-D大鼠糞便中次中黃嘌呤、黃嘌呤水平升高，經(jīng)痛瀉要方干預(yù)后水平明顯下調(diào)，這與上述研究結(jié)果不一致，說明嘌呤代謝途徑在IBS-D發(fā)病機(jī)制中的作用尚需更多的研究證實(shí)。

綜上所述，痛瀉要方對IBS-D肝郁脾虛型大鼠的作用可能是通過調(diào)節(jié)脫氧膽酸、γ-生育三烯醇、羧異環(huán)磷酰胺、25-乙?；咸烟擒?、次黃嘌呤、黃嘌呤等代謝物質(zhì)水平，影響精氨酸生物合成、色氨酸代謝、次級膽汁酸生物合成、泛醌和其他萜類醌生物合成、膽汁分泌、嘌呤代謝等相關(guān)代謝途徑實(shí)現(xiàn)的，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗加以驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。