聞?wù)狰P，黃綺堂，胡泉泉，李 雨，朱 俊，王 弦,3，李延莉,4

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常見的成人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)，占NHL的30%～40%，臨床表現(xiàn)為高度侵襲性，在分子生物學(xué)、臨床特征及預(yù)后等方面存在高度異質(zhì)性，雖然其標準治療方案R-CHOP的應(yīng)用大幅度提高患者的存活率，但仍有近1/3的患者發(fā)生耐藥或復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡[1]。因此，尋找新的指標預(yù)測患者預(yù)后及評估治療反應(yīng)是亟待解決的問題。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族是一類具有細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄雙重功能的因子，參與調(diào)控正常細胞的多種活動，如細胞分化、增殖、血管生成等[2]。STAT3是STAT家族重要的一員，可被多種因素激活成為磷酸化STAT3(p-STAT3)，進而參與各種正?；虍惓＜毎顒印＝?，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)STAT3和p-STAT3在多種腫瘤中過表達且與臨床預(yù)后密切相關(guān)[3-6]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的主要組成成分之一，參與多種腫瘤的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移等過程[7]。Li等[8]證實腫瘤相關(guān)巨噬細胞與DLBCL預(yù)后相關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細胞標志物CD68和CD163表達越高，患者總生存期(overall survival, OS)和無進展生存期(progression-free survival, PFS)越低。目前，用p-STAT3預(yù)測DLBCL患者預(yù)后及p-STAT3與腫瘤相關(guān)巨噬細胞相關(guān)性的報道較少。本文采用免疫組化法檢測228例DLBCL中p-STAT3的表達，分析其與預(yù)后、腫瘤相關(guān)巨噬細胞的關(guān)系，以期為DLBCL患者的治療提供新參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2004～2015年安徽醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院確診的228例DLBCL，其中女性107例，男性121例；<60歲者134例，≥60歲者94例；ECOG-PS評分≤1分者140例，>1分者88例；淋巴結(jié)外累積部位≤1處者181例，>1處者47例；Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期者129例，Ⅲ+Ⅳ期者99例；LDH正常165例，升高63例；IPI評分≤2分者159例，≥3分者69例。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision法檢測DLBCL組織中p-STAT3的表達。組織標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚4 μm。一抗為兔抗人p-STAT3單克隆抗體(Tyr705)(稀釋比1 ∶200)，購自DAKO公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用pH 6.0的檸檬酸鹽溶液高壓修復(fù)抗原，室溫冷卻后PBS沖洗，滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗4 ℃過夜，恢復(fù)至室溫滴加二抗，37 ℃孵育10 min，DAB顯色，經(jīng)蘇木精染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。陰性對照切片的一抗使用PBS替代。

1.3 結(jié)果判斷p-STAT3染色定位于腫瘤細胞胞質(zhì)和胞核，主要表達于細胞核。根據(jù)陽性細胞數(shù)和著色強度進行評分：(1)按陽性細胞百分比進行評分：陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～30%為1分，31%～80%為2分，>80%為3分[9]；(2)按細胞著色程度進行評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分相乘：≤2分為低表達，≥3分為高表達[10]。CD68主要表達于巨噬細胞胞質(zhì)，CD163表達主要定位于巨噬細胞胞膜。首先在低倍(100倍)鏡下初步觀察整張切片，再隨機選擇5個代表性的高倍視野(400倍)，計數(shù)CD68和CD163陽性細胞數(shù)。所有切片計數(shù)在1個月后重復(fù)，取2次計數(shù)的平均值作為該樣本表達的最終結(jié)果。以ROC曲線分析確定最佳截斷值分為CD68、CD163強陽性組和弱陽性組[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；采用χ2分析p-STAT3表達與臨床病理特征的關(guān)系；Spearman分析兩指標間的相關(guān)性；Kaplan-Meier繪制患者生存曲線；Cox風(fēng)險比例回歸模型進行預(yù)后的單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL中p-STAT3的表達p-STAT3表達主要定位于DLBCL胞質(zhì)和胞核，呈棕褐色(圖1)。在228例DLBCL患者中，p-STAT3陰性136例(59.6%)、陽性92例(40.4%)。

2.2 DLBCL中p-STAT3表達與臨床特病理征、腫瘤相關(guān)巨噬細胞的關(guān)系本組CD68弱陽性143例，強陽性85例；CD163弱陽性126例，強陽性102例。免疫分型：GCB型65例，non-GCB型61例；BCL-2陽性33例，陰性15例；BCL-6陽性25例，陰性23例。結(jié)果顯示：p-STAT3的表達在ECOG-PS評分、結(jié)外累積部位、Ann Arbor分期、LDH水平、IPI評分、治療反應(yīng)、CD68、CD163、BCL-2表達和免疫分型方面差異有顯著性(P<0.05，表1)。

表1 彌漫大B細胞淋巴瘤中p-STAT3表達與臨床病理特征及腫瘤相關(guān)巨噬細胞的關(guān)系

AB

2.3 DLBCL中p-STAT3表達與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析：IPI評分0～3分的低風(fēng)險和中風(fēng)險DLBCL患者中，p-STAT3陽性患者的OS和PFS與陰性患者相比顯著降低，而在IPI評分4～5分的高風(fēng)險患者中p-STAT3陽性患者的OS顯著降低，PFS未出現(xiàn)顯著差異(圖2)。本組采用標準化療方案(CHOP或R-CHOP)治療后，疾病進展71例，緩解157例。Cox單因素分析顯示：患者年齡、ECOG-PS評分、結(jié)外累積部位、Ann Arbor分期、LDH水平、IPI評分、治療反應(yīng)、CD68、CD163和p-STAT3均是DLBCL預(yù)后的影響因素。Cox多因素回歸分析顯示：LDH水平、治療反應(yīng)、CD163表達和p-STAT3表達是DLBCL預(yù)后的獨立影響因素(表2、3)。

圖2 IPI不同評分中p-STAT3表達與OS、PFS的關(guān)系：IPI評分0～1分中p-STAT3陽性組與陰性組的OS(A)和PFS(B)；IPI評分2～3分中p-STAT3陽性組與陰性組的OS(C)和PFS(D)；IPI評分4～5分中p-STAT3陽性組與陰性組的OS(E)和PFS(F)

表2 彌漫大B細胞淋巴瘤患者總生存期的Cox單因素和多因素分析

表3 彌漫大B細胞淋巴瘤患者無進展生存期的Cox單因素和多因素分析

2.4 DLBCL中腫瘤相關(guān)巨噬細胞標志物CD68與CD163表達的相關(guān)性在DLBCL中，CD68、CD163共同強陽性率為53.7%(121/228)，共同弱陽性率為35.1%(80/228)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：DLBCL中CD68與CD163表達呈正相關(guān)(r=0.766，P<0.001，表4)。

表4 彌漫大B細胞淋巴瘤中CD68和CD163表達的相關(guān)性分析

2.5 DLBCL中p-STAT3表達與CD68/CD163表達的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，DLBCL中p-STAT3表達與CD68呈正相關(guān)(r=0.660,P<0.001)；與CD163呈正相關(guān)(r=0.590，P<0.001，表5)。

表5 彌漫大B細胞淋巴瘤中p-STAT3與CD68/CD163表達的相關(guān)性分析

3 討論

STAT3包含STAT3ɑ、STAT3β、STAT3γ、STAT3δ四種亞基[11]，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子STAT家族中的重要一員，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄雙重功能，可被多種細胞因子、生長因子和基因激活，參與各種生理及病理過程。近年，越來越多的研究證明STAT3和p-STAT3在多種腫瘤中過表達且對預(yù)后起一定預(yù)測作用。Zhao等[12]通過分析202例食管鱗狀細胞癌組織中STAT3表達發(fā)現(xiàn)，STAT3是食管鱗狀細胞癌患者的獨立預(yù)后因素，陽性患者的OS和PFS明顯降低。Tang等[13]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中STAT3陽性與肝癌患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)；王凡夫等[14]也發(fā)現(xiàn)與癌旁肝組織和肝硬化組織相比，原發(fā)性肝癌組織中STAT3高表達，且與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)STAT3在胃癌中高表達，并且是胃癌患者的獨立不良預(yù)后因素[15]；p-STAT3也被證實是雌激素受體陰性乳腺癌患者的獨立不良預(yù)后因素[16]。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的主要組成成分，分為抑制腫瘤進展的M1型和促進腫瘤進展的M2型[17]。近年，多個研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤中STAT3表達與腫瘤相關(guān)巨噬細胞之間存在相互聯(lián)系。如乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞通過p38-MAPK通路誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌IL-6，進而激活腫瘤細胞的STAT3通路促進腫瘤干細胞增殖及腫瘤進展[18]。用腫瘤相關(guān)巨噬細胞的培養(yǎng)上清作用非小細胞肺癌細胞后，腫瘤細胞的STAT3被激活，誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖、發(fā)生免疫逃逸和耐藥，而IL-6受體拮抗劑則抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞上清對腫瘤細胞產(chǎn)生影響[19]；Zhang等[20]證實肺癌微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌的IFNγ可激活肺癌細胞的JAK/STAT3信號通路，使腫瘤細胞表達PD-L1，進而促進肺癌進展。

本組228例DLBCL患者中p-STAT3陽性92例(40.4%)，p-STAT3陰性136例(59.6%)。p-STAT3陽性與ECOG-PS評分、結(jié)外累積部位、Ann Arbor分期、LDH、IPI評分、治療反應(yīng)、CD68和CD163和BCL2表達均有關(guān)。在不同IPI評分的患者中，STAT3陽性患者的OS明顯降低，而在IPI評分4～5分患者中STAT3是否表達與PFS無顯著差異。Cox單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，p-STAT3是DLBCL患者不良預(yù)后的獨立影響因素；Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，p-STAT3的表達與腫瘤相關(guān)巨噬細胞呈正相關(guān)，以上結(jié)果均表明p-STAT3在腫瘤微環(huán)境中起重要作用。Tamma等[21]發(fā)現(xiàn)DLBCL組織中p-STAT3高表達且與CD163/CD4表達呈正相關(guān)。Ling等[22]發(fā)現(xiàn)DLBCL細胞分泌的外泌體促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞的STAT3活化，并激活下游通路促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞向M2型極化，最終促使腫瘤進展。Hashwah等[23]發(fā)現(xiàn)DLBCL細胞表達IL-6受體，被腫瘤微環(huán)境中的IL-6激活I(lǐng)L-6R/gp130/p-STAT3通路，進而促進DLBCL的進展。Stirm等[24]證實一種DLBCL細胞亞群分泌IL-10作用于自身表達的IL-10受體，進而激活腫瘤細胞自身STAT3促進腫瘤增殖。

綜上所述，p-STAT3陽性是DLBCL患者的獨立預(yù)后不良因素，與腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞呈正相關(guān)，可以有效預(yù)測患者預(yù)后，其在腫瘤微環(huán)境中的作用則需要深入分析。