王叢陽，郭文文，朱曉靜，王 焱

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，并呈逐年上升趨勢，其中甲狀腺乳頭狀癌占80%～90%，BRAF V600E突變是其最常見的基因變異，突變率占35%～83%[1]。目前，臨床檢測BRAF V600E突變主要采用免疫組化和qRT-PCR法。本文采用免疫組化和qRT-PCR法檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF V600E的突變，探討兩種技術(shù)在檢測甲狀腺乳頭狀癌中的差異及其應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年7月～2021年3月我院病理科存檔的甲狀腺手術(shù)標(biāo)本1 269例，術(shù)后病理確診甲狀腺乳頭狀癌690例，男性134例，女性556例，男女比為1 ∶4.15，患者年齡24～77歲，中位年齡49歲。術(shù)后病理診斷甲狀腺乳頭狀癌的石蠟組織同時行免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E 143例；術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(fine-needle aspiration cytology, FNAC)和術(shù)后石蠟?zāi)[瘤組織同時行qRT-PCR檢測BRAF V600E 265例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。將甲狀腺乳頭狀癌腫瘤細(xì)胞占比>50%石蠟標(biāo)本，行免疫組化EnVision兩步法檢測。應(yīng)用Ventana全自動免疫組化儀上機(jī)(Ventana公司，克隆號VE1)檢測BRAF V600E突變狀態(tài)。結(jié)果判讀：由兩名高年資病理醫(yī)師對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判斷，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，判定為BRAF V600E陽性；腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)未著色，判定為BRAF V600E陰性。

1.2.2qRT-PCR 本實(shí)驗(yàn)行免疫組化檢測的石蠟組織同時進(jìn)行qRT-PCR檢測，切片5～8 μm厚(6～8張)，每個石蠟組織被切取前，切片機(jī)、鑷子、一次性刀片均用乙醇擦拭消毒，防止交叉污染。切片置離心管中，二甲苯脫蠟2次，無水乙醇處理1次，室溫?fù)]發(fā)乙醇后，于56 ℃水浴裂解細(xì)胞2 h，按試劑盒說明書提取基因組DNA(廈門艾德公司)，提取DNA均行純度和濃度檢測。對樣本進(jìn)行上樣處理，上樣量為10 ng，每組樣本均設(shè)陰、陽性對照，于qRT-PCR系統(tǒng)上機(jī)檢測，上機(jī)流程嚴(yán)格依據(jù)操作指南進(jìn)行，擴(kuò)增程序依據(jù)BRAF V600E突變檢測試劑盒說明書設(shè)定(廈門艾德公司)。結(jié)果判讀：由兩名專業(yè)人員進(jìn)行判讀，每次測試所有樣品內(nèi)控HEX均有擴(kuò)增，呈S型陽性曲線；同時陰性對照FAM信號無擴(kuò)增，而陽性對照有擴(kuò)增呈S型陽性曲線，則認(rèn)為測試結(jié)果有效、繼續(xù)分析。若測試樣品FAM信號擴(kuò)增呈S型曲線且Ct值<30，則判定為BRAF V600E突變陽性；若樣品FAM信號無S型曲線或Ct值≥30，則判定為陰性。

1.2.3測序驗(yàn)證 將石蠟組織提取的基因組DNA送基因公司測序。引物序列：上游：5′-CTTCATAAT GCTTGCTCTG-3′，下游：5′-GTAACTCAGCAGCATCT CAG-3′。測序結(jié)果同時進(jìn)行軟件和人工對比分析，以測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評估免疫組化和qRT-PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用價值。

1.2.4qRT-PCR檢測術(shù)前FNAC和術(shù)后石蠟組織BRAF V600E突變 患者術(shù)前在甲狀腺外科門診手術(shù)室行FNAC，穿刺由資深甲狀腺外科醫(yī)師在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行。穿刺組織注入BD公司保存液中，離心去上清，混勻后取部分組織裂解，提取基因組DNA，與術(shù)后石蠟組織分別行qRT-PCR檢測BRAF V600E突變。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E的表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌組織經(jīng)HE染色，鏡下見腫瘤細(xì)胞呈乳頭狀分布，排列擁擠，細(xì)胞內(nèi)核溝明顯，部分細(xì)胞可見包涵體(圖1)。690例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本中有258例術(shù)后石蠟組織行免疫組化檢測BRAF V600E的表達(dá)，其中陽性211例(81.78%)(圖2)，陰性47例(18.22%)(圖3)。

①②③

2.2 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E的突變690例甲狀腺乳頭狀癌術(shù)后石蠟組織中265例行qRT-PCR檢測BRAF V600E突變，其中突變204例(76.98%)，未突變61例(23.02%)(圖4)。

圖4 qRT-PCR檢測BRAF V600E突變擴(kuò)增

2.3 甲狀腺乳頭狀癌石蠟組織中BRAF V600E的免疫表型和分子突變在690例甲狀腺乳頭狀癌組織中，143例術(shù)后石蠟組織同時行免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E突變，免疫組化檢測BRAF V600E陽性率為67.13%(96/143)，qRT-PCR檢測BRAF V600E突變陽性率為62.24%(89/143)，經(jīng)配對χ2檢驗(yàn)，對比分析兩種檢測方法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=107.63，P<0.000 01，表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌石蠟標(biāo)本同時行免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E的突變

2.4 免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E的對比分析143例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本進(jìn)行測序驗(yàn)證，檢測BRAF V600E突變。測序結(jié)果顯示BRAF V600E突變88例，與免疫組化和qRT-PCR結(jié)果一致；測序BRAF V600E未突變55例(圖5)，其中未突變的9例標(biāo)本中，免疫組化檢測BRAF V600E陽性8例，qRT-PCR檢測BRAF V600E突變1例(表2)。以測序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，免疫組化檢測甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、假陰性率、假陽性率、準(zhǔn)確率分別為100%、85.45%、91.67%、100%、0、14.55%、94.41%；qRT-PCR檢測BRAF V600E突變的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、假陰性率、假陽性率、準(zhǔn)確率分別為100%、98.19%、98.88%、100%、0、1.8%、99.30%(表3)。免疫組化和qRT-PCR檢測甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E的靈敏度和陰性預(yù)測值均為100%，假陰性率均為0，但qRT-PCR檢測BRAF V600E特異度、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確率明顯優(yōu)于免疫組化，對比分析，免疫組化檢測有較高的假陽性率。

表2 免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E的對比分析

表3 免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E的應(yīng)用價值對比分析(以測序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn))

圖5 BRAF V600E測序：A.BRAF V600E未突變；B.BRAF V600E突變

2.5 術(shù)前FNAC和術(shù)后石蠟組織BRAF V600E突變對比分析265例甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前FNAC和術(shù)后石蠟組織分別行qRT-PCR檢測BRAF V600E突變，術(shù)前FNAC檢測BRAF V600E突變陽性率為69.81%(185/265)，術(shù)后石蠟?zāi)[瘤組織檢測BRAF V600E突變陽性率為76.98%(204/265)，與術(shù)后石蠟組織比較，術(shù)前FNAC檢測BRAF V600E有較高假陰性，假陰性率為10.29%(21/204)。經(jīng)配對χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示術(shù)后病理石蠟組織BRAF V600E突變陽性檢出率明顯高于術(shù)前FNAC標(biāo)本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=166.43，P<0.000 01，表4)。

表4 甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前FNAC和術(shù)后石蠟組織qRT-PCR檢測BRAF V600E的突變

3 討論

甲狀腺腫瘤標(biāo)本BRAF V600E突變檢測，對甲狀腺腫瘤的診斷、治療、手術(shù)方式選擇及預(yù)后評估有重要意義[2]。BRAF V600E突變在甲狀腺乳頭狀癌組織中具有高度特異性，而在正常甲狀腺組織、乳頭狀增生及濾泡性腫瘤中常無突變[3]。BRAF V600E突變的甲狀腺乳頭狀癌患者可能發(fā)生局部浸潤和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)通常需要進(jìn)行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃[4]。對于無法手術(shù)或轉(zhuǎn)移的BRAF V600E突變的甲狀腺未分化癌患者，聯(lián)合使用靶向藥物曲美替尼和達(dá)拉非尼可以得到有效緩解[5]。因?yàn)锽RAF V600E突變導(dǎo)致攝碘基因的表達(dá)缺失，從而影響攝碘基因的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以對于BRAF V600E突變的患者，不建議進(jìn)行I131治療[6]。BRAF V600E突變是預(yù)后不佳的分子指標(biāo)[7-8]，有30%的甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變患者存在復(fù)發(fā)風(fēng)險。

本實(shí)驗(yàn)中甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E免疫組化陽性檢出率為81.78%，qRT-PCR陽性檢出率為76.98%，與文獻(xiàn)報道相符(35%～83%)[9]。通?；虬l(fā)生突變在蛋白水平免疫組化檢測中會有表達(dá)，然而在有些病例中基因雖然發(fā)生突變，但免疫組化并未檢測到突變蛋白，這可能與基因的改變并未影響蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯有關(guān)，導(dǎo)致免疫組化結(jié)果假陰性。但本實(shí)驗(yàn)通過測序作為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E靈敏度均為100%、假陰性率均為0，兩者相比差異無顯著性。因此，免疫組化作為常規(guī)的檢測手段，其操作簡便、成本較低，可以作為甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變的初篩。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，免疫組化檢測的假陽性率(14.55%)明顯高于qRT-PCR(1.8%)，有較多的病例經(jīng)測序證實(shí)免疫組化檢測呈假陽性。這可能與抗體的特異性、閱片者的主觀經(jīng)驗(yàn)及腫瘤組織的異質(zhì)性、非BRAF V600E蛋白的表達(dá)以及操作過程等因素相關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)顯示qRT-PCR技術(shù)用于甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E檢測，其特異度(98.19%)、陽性預(yù)測值(98.88%)、準(zhǔn)確率(99.30%)均優(yōu)于免疫組化，尤其假陽性率明顯低于免疫組化，這可能與該檢測設(shè)計單管封閉操作、嚴(yán)格設(shè)置陰陽性對照以及試劑盒自身攜帶的內(nèi)對照、排除人為的主觀因素等有關(guān)。國內(nèi)外指南均推薦對甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本進(jìn)行基因水平BRAF V600E突變檢測。因此，在甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E檢測中，qRT-PCR技術(shù)優(yōu)于免疫組化，值得推廣使用。

另外，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前FNAC和術(shù)后石蠟?zāi)[瘤組織標(biāo)本分別進(jìn)行BRAF V600E檢測，結(jié)果顯示：術(shù)前FNAC甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E突變陽性檢出率為69.81%(185/265)，術(shù)后石蠟?zāi)[瘤組織BRAF V600E突變陽性檢出率為76.98%(204/265)。術(shù)后石蠟組織qRT-PCR檢測BRAF V600E準(zhǔn)確率達(dá)99.30%，該實(shí)驗(yàn)術(shù)前和術(shù)后兩種類型標(biāo)本同時應(yīng)用qRT-PCR檢測，說明與術(shù)后石蠟?zāi)[瘤組織相比，術(shù)前FNAC標(biāo)本檢測BRAF V600E存在較高假陰性率，達(dá)10.29%(21/204)，有較多的BRAF V600E突變病例未能檢出。術(shù)前FNAC標(biāo)本假陰性的原因可能與以下因素有關(guān)：FNAC效果與穿刺者的經(jīng)驗(yàn)、手法、熟練度及穿刺腫物的大小、位置等相關(guān)；另也與FNAC組織獲取較少，且血液等非腫瘤組織引起雜質(zhì)等因素有關(guān)，導(dǎo)致穿刺標(biāo)本不含腫瘤組織或腫瘤組織含量較低[10-11]，低于qRT-PCR技術(shù)的檢測下限，造成結(jié)果假陰性。術(shù)前FNAC標(biāo)本BRAF V600E檢測，對甲狀腺腫物良惡性的判斷、輔助診斷及手術(shù)范圍的選擇有重要意義。因此，術(shù)前FNAC標(biāo)本BRAF V600E檢測仍然不失為理想的檢測手段。鑒于FNAC自身的局限性，導(dǎo)致其假陰性率較高，建議術(shù)后病理組織診斷為甲狀腺乳頭狀癌，而術(shù)前FNAC檢測BRAF V600E陰性的標(biāo)本，應(yīng)再次進(jìn)行石蠟組織BRAF V600E復(fù)檢，以排除FNAC檢測假陰性，更有利于后續(xù)治療及預(yù)后評估。

綜上所述，在甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E檢測中，qRT-PCR技術(shù)優(yōu)于免疫組化。術(shù)后石蠟組織BRAF V600E突變檢出率明顯高于術(shù)前FNAC標(biāo)本，甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前FNAC檢測BRAF V600E陰性的病例，建議術(shù)后石蠟組織復(fù)檢BRAF V600E突變狀態(tài)。