楊路路，田智丹，王 糧，王勁松，趙有財(cái)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是一種常見的高分化甲狀腺癌，占甲狀腺癌的80%～90%[1]，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前，超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺吸取細(xì)胞學(xué)檢查(fine needle aspiration cytology, FNAC)是術(shù)前評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)最可靠的診斷手段。PTC的病理診斷主要依靠其組織學(xué)及細(xì)胞核的特征，如乳頭狀結(jié)構(gòu)、核溝、核內(nèi)包涵體及毛玻璃核等，但一些非腫瘤性病變也可出現(xiàn)PTC細(xì)胞學(xué)改變，導(dǎo)致診斷困難，尤其是在FNAC標(biāo)本中。近年，免疫組化標(biāo)志物如Galectin-3、HBME-1、CK19等有助于PTC的診斷[2-4]，但其靈敏度或特異度較差。研究發(fā)現(xiàn)TROP-2過表達(dá)對(duì)手術(shù)切除標(biāo)本PTC的診斷具有較高的敏感性和特異性[5-6]，目前細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中TROP-2的表達(dá)及其臨床意義報(bào)道較少。本文著重探討TROP-2在甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)中的表達(dá)，分析其在細(xì)胞學(xué)PTC中表達(dá)的臨床意義及診斷價(jià)值，為其治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月1日～2019年8月31日我院行甲狀腺結(jié)節(jié)FNAC標(biāo)本105例，其中PTC 86例，良性甲狀腺結(jié)節(jié)(benign thyroid nodules, BTN)19例(術(shù)后診斷為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤樣增生、甲狀腺腺瘤、橋本甲狀腺炎/慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎等)。PTC組中男性22例，女性64例，年齡22～67歲，平均(41.6±11.6)歲；BTN組中男性7例，女性12例，年齡24～67歲，平均(46.5±13.2)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均在超聲引導(dǎo)下行甲狀腺細(xì)針穿刺涂片及制備細(xì)胞蠟塊；(2)排除腫瘤細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本；(3)均接受相應(yīng)手術(shù)切除+部分患者行區(qū)域淋巴結(jié)清掃，均經(jīng)術(shù)后病理確診；(4)術(shù)前均無相關(guān)內(nèi)分泌治療及放、化療；(5)無其它惡性腫瘤病史；(6)有完整的臨床病理資料。

1.2 方法(1)細(xì)針穿刺吸取細(xì)胞涂片及蠟塊制備：取適量細(xì)針穿刺吸取的細(xì)胞樣本，均勻涂抹于載玻片上，經(jīng)95%乙醇固定，15 min后行HE染色。將細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片后的剩余標(biāo)本注入細(xì)胞保存液中，靜置后離心，在沉淀物中加入10%中性福爾馬林固定，再次離心后吸取上清液，加入95%乙醇靜置1～2 h，待細(xì)胞樣本凝集成塊后，將其收集于濾紙中，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋。(2)免疫組化：采用EnVision法染色，一抗TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19，均購自北京中杉金橋公司，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照：以試劑盒中提供的強(qiáng)陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定TROP-2陽性定位于細(xì)胞膜，陽性判讀以陽性腫瘤細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比，將>5%腫瘤細(xì)胞完整膜表達(dá)作為TROP-2陽性的最佳閾值[7]。Galectin-3定位于細(xì)胞膜，部分細(xì)胞核亦著色。HBME-1與CK19陽性均定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，其陽性閾值參照TROP-2。切片均由兩名資深病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，當(dāng)判讀結(jié)果不一致時(shí)，在多頭顯微鏡下同時(shí)觀察分析，并達(dá)到意見統(tǒng)一。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)PTC組和BTN組中TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表達(dá)進(jìn)行比較；計(jì)算TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確度，并進(jìn)行ROC曲線繪制，比較ROC曲線下面積(area under curve, AUC)以評(píng)價(jià)各指標(biāo)的診斷效能。TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理特點(diǎn)PTC細(xì)胞學(xué)主要表現(xiàn)為細(xì)胞排列擁擠，細(xì)胞核增大，核似毛玻璃樣，可見核溝、核內(nèi)包涵體，具有纖維血管軸心的乳頭狀結(jié)構(gòu)(圖1、2)。BTN主要呈濾泡上皮細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞形態(tài)溫和，核小而圓，其中2例見乳頭狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.2 PTC和BTN中TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的表達(dá)TROP-2在PTC組中陽性率為95.3%(82/86)(圖4)，在BTN組中陽性率為5.3%(1/19)；PTC中TROP-2的陽性率明顯高于BTN(P<0.05)，而在BTN組中僅1例橋本甲狀腺炎TROP-2陽性。Galectin-3、HBME-1、CK19在PTC中的陽性率分別為82.6%(71/86)、81.4%(70/86)、90.7%(78/86)，在BTN組中的陽性率分別為5.3%(1/19)、15.8%(3/19)、21.1%(4/19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。本組1例細(xì)胞學(xué)檢查見乳頭狀結(jié)構(gòu)，術(shù)后證實(shí)為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生的病例，CK19呈陽性(圖5)，但TROP-2陰性(圖6)。

①②③④⑤⑥

表1 甲狀腺乳頭狀癌、良性甲狀腺結(jié)節(jié)中TROP-2、Galectin-3、HBME-1及CK19的表達(dá)[n(%)]

2.3 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的診斷效能比較本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TROP-2對(duì)于診斷PTC的靈敏度(95.3%)、特異度(94.7%)、陽性預(yù)測值(98.8%)、陰性預(yù)測值(81.8%)及準(zhǔn)確度(95.2%)均為最高。靈敏度：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1；特異度：TROP-2=Galectin-3>HBME-1>CK19；陽性預(yù)測值：TROP-2>Galectin-3>HBME-1>CK19；陰性預(yù)測值：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1；準(zhǔn)確度：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1。四項(xiàng)指標(biāo)診斷PTC的AUC分別為0.950、0.886、0.828、0.848，以TROP-2診斷效能最高(表2，圖7)。

表2 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷效能比較

圖7 TROP-2、Galectin-3、HBME-1及CK19診斷PTC、BTN的ROC曲線圖

2.4 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系本組中PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為51.2%(44/86)，結(jié)果顯示TROP-2及CK19表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)；而Galectin-3、HBME-1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無相關(guān)性(P>0.05，表3)。

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)臨床相對(duì)常見，多數(shù)為良性病變，其惡性結(jié)節(jié)中最常見的是PTC。隨著FNAC的應(yīng)用，PTC的檢出率明顯提高[8-9]。PTC具有相對(duì)惰性生物學(xué)行為，預(yù)后較好，但易發(fā)生早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加患者局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。因此，術(shù)前對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確評(píng)估及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)判，對(duì)于確定手術(shù)方式以及是否行預(yù)防性頸部淋巴結(jié)清掃具有重要意義。

Galectin-3、HBME-1和CK19在PTC中具有較強(qiáng)的表達(dá)，對(duì)于鑒別PTC和BTN有輔助作用，但靈敏度或特異度有局限性。TROP-2是一種由TACSTD2基因編碼表達(dá)的細(xì)胞跨膜蛋白，最初在人類滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)。研究表明TROP-2在正常組織中低表達(dá)或失表達(dá)，其發(fā)揮抑癌基因作用，而在多種惡性腫瘤組織中TROP-2呈過表達(dá)，如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜樣癌和卵巢癌等[13]。Finley等[14]采用類聚分析和寡核苷酸陣列法分析14例PTC和21例良性甲狀腺腫瘤的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)PTC與良性腫瘤組間存在明顯的基因表達(dá)差異，TROP-2在PTC中過表達(dá)。本組前期發(fā)現(xiàn)PTC中表達(dá)TROP-2，而在其它甲狀腺惡性腫瘤和良性病變中均不表達(dá)，TROP-2對(duì)于PTC診斷具有較高的敏感性和特異性[6]。TROP-2與Galectin-3、HBME-1及CK19在診斷PTC的靈敏度和特異度報(bào)道不一。Simms等[7]分析331例甲狀腺癌和BTN中TROP-2的表達(dá)，結(jié)果顯示TROP-2診斷經(jīng)典型PTC的靈敏度和特異度分別為90%和95.2%，與以往研究相比，TROP-2的靈敏度和特異度均高于Galectin-3、HBME-1和CK19。然而，Murtezaoglu等[15]報(bào)道TROP-2在PTC中的表達(dá)高于良性甲狀腺病變，但其準(zhǔn)確度低于HBME-1和Galectin-3，靈敏度低于CK19、HBME-1和Galectin-3。這可能與研究者采用的抗體克隆號(hào)不同、陽性閾值不同等因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)推薦的5%陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中TROP-2陽性閾值，結(jié)果顯示TROP-2在PTC中陽性率達(dá)95.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,16]。TROP-2對(duì)于鑒別PTC與BTN的靈敏度為95.3%、特異度為94.7%、陽性預(yù)測值為98.8%、陰性預(yù)測值為81.8%，準(zhǔn)確度為95.2%，均高于Galectin-3、HBME-1和CK19。Abdou等[17]報(bào)道TROP-2在甲狀腺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中診斷PTC的靈敏度及特異度達(dá)均為100%，其在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的診斷效能優(yōu)于手術(shù)切除標(biāo)本，但該研究中細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的病例較少。本組也發(fā)現(xiàn)TROP-2在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中診斷PTC的靈敏度，高于前期研究中其在手術(shù)標(biāo)本中的靈敏度[6]，進(jìn)一步證實(shí)TROP-2在甲狀腺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中具有較高的輔助診斷價(jià)值。本組進(jìn)一步分析TROP-2、Galectin-3、HBME-1和CK19對(duì)于診斷PTC的效能，TROP-2的AUC為0.950，高于Galectin-3、HBME-1及CK19；TROP-2對(duì)于細(xì)胞學(xué)鑒別PTC與BTN具有較高的診斷效能。

表3 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

本組中除1例橋本甲狀腺炎，其余BTN TROP-2均不表達(dá)。橋本甲狀腺炎中嗜酸性變的濾泡上皮具有PTC樣核改變，可能攜帶與經(jīng)典PTC相同的基因突變(RET/PTC重排)，該突變激活MAPK通路，直接或間接促進(jìn)TROP-2表達(dá)[18]，也可能與這些細(xì)胞具有較高的內(nèi)源性生物素活性，顯示抗體的異常陽性染色模式；提示橋本甲狀腺炎的嗜酸性變?yōu)V泡上皮可能存在TROP-2表達(dá)，給鑒別診斷帶來困難，需結(jié)合其它細(xì)胞病理學(xué)特征進(jìn)行鑒別。橋本甲狀腺炎通常伴較多的淋巴細(xì)胞，嗜酸性變?yōu)V泡上皮的胞質(zhì)豐富嗜酸，核仁明顯，雖然也可偶見核溝，但這些非典型細(xì)胞的核質(zhì)比較低，而PTC腫瘤細(xì)胞核質(zhì)比高，異型性明顯，可與橋本甲狀腺炎進(jìn)行鑒別。本組前期發(fā)現(xiàn)PTC中TROP-2表達(dá)與BRAF V600E基因突變呈正相關(guān)[6]，對(duì)于鑒別診斷困難的病例可以結(jié)合BRAF V600E基因突變狀況進(jìn)行診斷。本實(shí)驗(yàn)尚存在局限與不足，納入的良性細(xì)胞學(xué)病例數(shù)較少，需積累病例進(jìn)一步分析。

Guan等[19]研究顯示TROP-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲性行為密切相關(guān)。本組前期研究也顯示TROP-2在PTC手術(shù)標(biāo)本中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在FNAC標(biāo)本中TROP-2過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，44例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC均表達(dá)TROP-2，而TROP-2不表達(dá)的4例PTC均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究認(rèn)為TROP-2通過AP-1增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致MMP-2上調(diào)，引起Ⅵ型膠原蛋白的降解，從而協(xié)助腫瘤組織向細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散，促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[20]。

總之，TROP-2是診斷PTC的一種高度敏感性和特異性的免疫組化標(biāo)志物，可進(jìn)一步提高甲狀腺FNAC診斷的準(zhǔn)確性；且TROP-2表達(dá)與PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。根據(jù)TROP-2的表達(dá)、BRAF V600E基因突變狀況及影像學(xué)檢查，可為臨床是否行預(yù)防性頸部淋巴結(jié)清掃提供參考。