邢麗紅,李兆新,2*,孫曉杰,2,張夢婷,2,鄭旭穎,2,王繼耀,2,王淑文,2,周朝生,朱潔,丁環(huán),劉云龍

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所,山東 青島 266071;2.農業(yè)農村部水產品質量安全風險評估實驗室(青島),山東 青島 266071;3.浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所,浙江 溫州,325005;4.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室和溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室,浙江 溫州 325005;5.山東眾合天成檢驗有限公司,山東 青島 266071)

自1940年首次報道以來,大蒜素因其具有廣泛的生物學特性被廣泛研究。大蒜素(二烯丙基硫代亞磺酸酯)包括二烯丙基一硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基四硫醚,有天然型大蒜素和化學合成型大蒜素。大蒜鱗莖擠壓后產生的蒜氨酸在大蒜素酶的作用下可轉化為天然型大蒜素[1];合成型大蒜素主要是采用氯丙烯-硫代硫酸鈉-硫化鈉法制備。大蒜素可以通過磷脂膜進入生物細胞,并發(fā)揮其廣泛的藥理學特性如抗菌活性[2]、免疫調節(jié)[3]、神經保護[4]、心臟保護[5]和抗腫瘤活性[6]等。大蒜素具有多種生物學功能如活血化淤、清熱解毒、殺菌抑菌等,廣泛地應用于醫(yī)藥、養(yǎng)殖和農業(yè)種植等領域。大蒜素是天然的抗菌物質,在動物體內蓄積低,殘留少。同時,因為其具有抗菌譜較廣,易降解,價格低廉,沒有致畸、致癌、致突變的副作用特點,所以可以作為抗生素的替代品和動物飼料添加劑被廣泛用于水產和畜牧的養(yǎng)殖及疾病防控等方面。

1 大蒜素的藥理作用

1.1 抗菌活性

大蒜素的抗菌活性最早于1944年由Cavallito等[7]提出。因其對多種耐藥微生物的抗菌潛力引起了人們的極大關注。大蒜素的抑制和殺滅范圍包括細菌、真菌、病毒及寄生蟲等[8],是一種廣譜抗菌劑,對水產動物的主要致病菌如腸型點狀氣單孢菌(Aeromonaspunctataf.intestinalis)、熒光極毛桿菌(Pseudomonasfluorescens)、黏球菌(Myxococcus)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、愛德華氏菌(Edwardsiella)、氣單孢菌(Aeromonas)和魯耶爾森氏菌(MoriRouyere)等都有抑制和殺滅作用。Velliyagounder等[9]研究發(fā)現大蒜素對革蘭氏陰性牙周病原菌的放線菌(Actinomycetes)有顯著抗菌活性,能夠減輕由放線菌引起的相關牙齒疾病,在治療放線菌引起的口腔感染方面發(fā)揮著巨大潛力。大蒜素對幽門螺桿菌(Helicoboctonpyloni)也具有抗菌作用。相關體外和體內實驗證明,對許多抗生素具有抗性的幽門螺桿菌對相對較低濃度的大蒜素敏感[10]。大蒜素已經被證實對幾種人類肺部病原菌具有抗菌活性[11]。更重要的優(yōu)勢在于大蒜素獨特的作用機理,大多數細菌對大蒜素不產生抗性。因此,無論大蒜素是單獨使用或者是作為抗生素的輔助劑,用于治療具有藥物敏感性和耐藥性的結核病都具有廣闊的前景[12]。

1.2 免疫調節(jié)作用

研究表明,大蒜素具有抑制性的免疫調節(jié)作用,其通過刺激免疫細胞的增殖、增強溶菌酶活性以及增強促炎性介質(如γ-干擾素)、促進CD4+ T細胞的擴張等方式來調節(jié)外周白細胞的免疫功能[3]。此外,大蒜素還可以通過減少腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)的產生來減輕炎癥。由于大蒜素對腸上皮細胞具有抑制性免疫調節(jié)作用,大蒜素可能具有減輕腸炎癥的潛能[13]。在某些情況下,大蒜素或大蒜提取物也可以作為免疫抑制劑來下調炎癥反應并抑制T細胞與內皮細胞的相互作用。Feng等[14]發(fā)現在嚙齒類瘧疾模型中,大蒜素通過增強宿主的先天性和適應性免疫反應,來保護宿主免受瘧疾感染。同時大蒜素能提高腫瘤患者的細胞免疫功能[15]。由于對多種病原微生物有較好的抑制和殺滅作用,所以大蒜素能提高水產動物的免疫能力,改善水產動物各系統(tǒng)組織的功能,促進水產動物生長[28-32]。

1.3 抗氧化作用

1.4 抗癌作用

大蒜素具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用,因此具有抗腫瘤活性。研究表明其在胃癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、結腸癌和肝癌等多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤活性。在肝細胞癌中,大蒜素導致p53介導的自噬細胞死亡[21]。在成膠質細胞瘤中,大蒜素通過Bcl-2/Bax的線粒體途徑,MAPK/ERK信號傳導途徑和抗氧化酶系統(tǒng)誘導凋亡[22]。在結腸癌中,大蒜素會增加二倍體DNA含量,并增加從線粒體釋放細胞色素C到細胞質的能力,從而導致凋亡性細胞死亡[23]。在胃癌中,大蒜素通過p38絲裂原活化蛋白激酶/caspase-3信號通路抑制增殖并誘導凋亡[24]。

1.5 保護心腦血管作用

大蒜素通過提高抗氧化劑水平,預防高脂血癥和心臟肥大,誘導血管舒張,抑制血管生成甚至抑制血小板凝集,在治療心血管疾病方面具有巨大潛力[25]。大蒜素還可以通過降低活性氧的含量并刺激谷胱甘肽的產生來增強抗氧化劑的狀態(tài),從而進一步保護心血管系統(tǒng)。目前的研究表明,大蒜素能有效減輕由急性阿霉素中毒引起的心臟氧化損傷,可用作由抗阿霉素引起的心臟毒性的細胞保護劑[26]。El-Sheakh等[27]研究發(fā)現,大蒜素可能通過降低血管氧化應激和相關的炎癥(高膽固醇血癥誘發(fā)的動脈粥樣硬化發(fā)病機理的基礎)來改善高膽固醇飲食喂養(yǎng)的兔子的內皮功能障礙。因此,對于高膽固醇血癥患者,適量攝入富含大蒜素對預防血管并發(fā)癥有益。

2 大蒜素的應用

2.1 大蒜素在水產養(yǎng)殖中的應用

在水產養(yǎng)殖中,大蒜素具有改善飼料適口性,促進食欲,健胃殺菌和驅蟲保健等特點,而且無殘留,無抗藥性,不產生致畸、致癌等毒副作用,是一種安全的新型飼料添加劑[28]。

大蒜素能夠促進胃腸蠕動從而促進魚的生長,同時可以提高飼料采食量和飼料利用率[29],提高水產動物體增重率,還能殺菌和抑菌,提高水產動物成活率,減少發(fā)病率,提高水產品肉質。長期飼喂大蒜素的魚肉質更加鮮美。目前,大蒜素對淡水魚的促進作用研究比較廣泛,如鯉(Cyprinuscarpio)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和羅非魚(Oreochromismossambicus)等。李會濤等[30]在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)飼料中加入大蒜素飼養(yǎng)6周發(fā)現,大菱鲆特定生長率、血清溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力均得到提高,同時發(fā)現400 mg/kg的大蒜素能更有效地提高其非特異性免疫力及抗病力。伍莉等[31]研究發(fā)現,大蒜素通過提高斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)腸道淀粉酶活力促進魚體生長。大蒜素還可以改善魚類的非特異性免疫力從而增強抗病能力[32]。有相關研究表明大蒜素可以減少魚體組織中鉛、鎘的積累,從而降低鉛、鎘中毒[33-34],并且對肝臟纖維性病變也能起到一定的作用。大蒜素還可以預防虹鱒由嗜水氣單胞菌引起的相關疾病[35]。大蒜素對羅非魚和鯉的毛線蟲病和陀螺菌病也有抑制作用[36]。大蒜素可通過抑制水生真菌從而防治魚類的水霉病。同時對水霉菌的孢子有一定的殺滅作用,將其用于養(yǎng)殖水體消毒,可以有效地降低受傷魚體感染水霉菌的比例和減少因水霉菌的寄生而引起的死亡數量[37]。大蒜素能增強大菱鲆的體質和免疫力,并對預防大菱鲆腸炎病有明顯的療效[38]。

2.2 大蒜素在農業(yè)中的應用

大蒜素作為一種植物農藥通常被認為是化學農藥的理想替代品,其在陽光、空氣和高濕度下容易降解,分解為毒性較小或無毒的化合物,因此對非目標生物的危害較小[39]。大蒜素在番茄生產中能激活番茄類植物中的抗氧化酶活性,進而能促進其生長和增加產量[40]。大蒜素還能用于防治番茄疫霉根腐病、胡蘿卜鏈格孢黑腐病、稻瘟病、黃瓜枯萎病和柑橘類由青霉菌種引起的腐爛[41]。大蒜素作為一種具有廣譜抗性的植物農藥,具有良好的應用前景。

3 大蒜素的提取技術

3.1 水蒸氣蒸餾

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入提取物中,使目標物隨水蒸氣一起蒸餾出來的一種浸提方法。該方法設備簡單、操作方便、成本相對較低和易于推廣,是常用的一種提取方法。但是水蒸氣蒸餾法不適合提取熱敏性化合物,提取率較低,提取物中的有效成分不易分離。仇小艷等[42]以大蒜揮發(fā)油提取率為指標,通過單因素和L9(34)正交試驗確定了水蒸氣蒸餾法提取大蒜素的最佳提取工藝及條件。

3.2 溶劑提取法

溶劑萃取法是利用單一有機溶劑或幾種有機溶劑混合作為提取劑,將目標化合物提取出來的一種常用方法。有機溶劑萃取法設備簡單、操作便捷、提取率相對于水蒸氣蒸餾提取法高,應用更加廣泛。溶劑提取通常和超聲輔助提取、微波輔助萃取相結合。根據大蒜素溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚等有機溶劑的特性,通常情況下采用的提取試劑為甲醇、乙醇、丙酮、正己烷或這些溶劑的混合物。孫艷等[43]以大蒜素的提取率為指標,通過單因素試驗和正交試驗,確定有機溶劑提取大蒜素的最佳提取工藝：大蒜泥在40 ℃下酶解80 min后,按料液比為1∶4加入95%的乙醇,溫度為25 ℃時萃取大蒜提取物100 min?？灯嚼萚44]采用微波萃取技術提取大蒜素中的大蒜新素,同時對萃取條件進行優(yōu)化,得出微波萃取的最佳條件：二氯甲烷為萃取劑,用量控制在200 mL,萃取時間為30 s。

3.3 超臨界CO2萃取

超臨界CO2萃取技術作為一種新興萃取技術備受關注。在超臨界相中,CO2具有氣體和液體性質,并且具有良好的溶解能力。隨著壓力的增加,超臨界CO2的密度增加,因此可以通過改變壓力來調節(jié)其溶解能力。超臨界CO2提取具有提取率高、提取溫度低的優(yōu)點,因此特別適合提取大蒜素,但所得大蒜素純度低,需要進一步純化,而且超臨界CO2萃取需要精密的儀器,成本相對較高,無法滿足一般實驗室的要求。梁兵等[45]在超臨界條件下,研究用CO2作萃取劑從大蒜中萃取大蒜油的工藝條件(溫度、壓力、萃取劑用量)對大蒜油提取效率的影響,結果表明,超臨界CO2萃取最佳工藝及條件為溫度35～40 ℃,壓力15 MPa,萃取劑用量5～6 L/h·g,大蒜油的回收率為0.1%。

3.4 分子蒸餾技術

分子蒸餾(Molecular distillation,MD)的純化原理基于各種分子平均自由距離的不同,是一種應用于液體分離的先進技術,由于其操作和蒸餾溫度低,可長時間加熱和無污染。因此,MD特別適用于熱敏性物質的分離。Liang等[46]首先通過超臨界CO2萃取獲得大蒜素后利用分子蒸餾對其進行純化,同時研究了絕對壓力、蒸餾溫度和進料流速等操作條件對大蒜素純度和回收率的影響。

4 大蒜素的檢測技術

4.1 定硫檢測法

定硫法利用大蒜素中含有的硫代亞砜基被濃硝酸氧化成硫酸離子,與氯化鋇反應形成硫酸鋇沉淀,根據硫酸鋇的重量換算出大蒜素的含量。馬往校等[47]采用定硫法測定蒼山大蒜中的大蒜素含量,同時對氧化劑用量、酸度及稱樣量等因素進行優(yōu)化,確定了定硫法測定大蒜素含量的最佳條件。與硝酸汞法進行比較,經t-檢驗,兩種方法間不存在顯著性差異。

4.2 分光光度法

根據大蒜素能夠與某些化合物發(fā)生反應而顯色的特性可以采用分光光度法檢測。大蒜素能與半胱氨酸定量反應,然后利用二硫代二硝基苯甲酸測定過量的半胱氨酸,從而間接測得大蒜素的含量。Talia等[48]利用商品化生色硫醇4-巰基吡啶,通過分光光度法測定大蒜素的含量。唐輝等[49]建立4-巰基吡啶紫外分光光度法測定大蒜素總量。但這類測定方法只能夠測定大蒜素總量,對每種分解物質的具體含量仍需要有效的分離和檢測手段。

4.3 氣相色譜法

潘浩等[50]采用氣相色譜(GC)法研究了以7.5 mg/kg(體質量)單次劑量口灌給藥后,大蒜素在鯽(Carassiusauratus)體內的藥物代謝動力學及藥物殘留消除規(guī)律。宮玲玲等[51]以苯乙酮為內標利用氣相色譜法測定飼料添加劑大蒜素的含量。但是氣相色譜法受溫度的影響,采用氣相色譜-氫火焰檢測器測定大蒜素時溫度不能太高。一些研究表明：當程序升溫較慢、柱溫較低、進樣溫度較低時,檢測到的降解產物以二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基甲基硫醚、烯丙基甲基二硫醚和烯丙基甲基三硫醚等為主;而當程序升溫較快、柱溫較高、進樣溫度較高時,檢測出的降解產物主要是二硫雜環(huán)-己烯衍生物,其次是各種硫醚和硫代亞磺酸酯,其中二烯丙基三硫醚和二硫醚的含量高[52]。因此采用氣相色譜法測定大蒜素時溫度不能過高。

4.4 高效液相色譜法

大蒜素的紫外線發(fā)色團吸收較弱,因此采用HPLC方法時檢測靈敏度相對較差。Sankhadip等[53]采用高效液相色譜-紫外檢測器測定大蒜素的含量。色譜柱為kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相由甲醇-水(v/v,50∶50)組成,流速為0.5 mL/min,UV檢測器波長設置為254 nm。Liang 等[54]利用高效液相色譜法測定雙層片劑中的大蒜素。色譜柱為C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相由甲醇-0.4%甲酸(v/v,65∶35)組成,流速為1 mL/min,UV檢測波長設定在242 nm。李齊歡等[ 55]運用高效液相色譜法以kromasil C18為色譜柱,甲醇-水-甲酸(v/v,85∶15∶0.1)為流動相,流速為0.8 mL/min,紫外檢測波長為252 nm,測定了大蒜素膠囊中二烯丙基三硫醚的含量,結果表明本法快速、準確、靈敏,對實現大蒜素膠囊的質量監(jiān)控具有重要意義。徐麗紅等[56]選取了固體類、液體類和半固體類3類保健食品為研究對象,運用液相色譜法對其中大蒜素的主要功效成分二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚進行了測定,并對提取溶劑、乙醇體積分數、提取溫度和色譜柱類型進行了優(yōu)化分析。同時將HPLC和GC分析進行比較,結果無明顯差異。張文斌等[57]建立了HPLC測定大蒜油膠丸中主要有效成分二烯丙基三硫醚的方法,該方法只需要普通的ODS柱,進樣量少,樣品不需特殊處理,準確性好,靈敏度高,是測定原大蒜油及其膠丸中二烯丙基三硫醚較為理想的方法,對于控制產品的質量也具有重要意義。許珂珂等[58]利用高效液相色譜法測定鮮蒜中大蒜素二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的含量。以C18柱(4.6×250 mm,5 μm)為色譜柱、乙腈-水(v/v,75∶25)為流動相,紫外檢測波長為215 nm,方法學指標良好,適用于鮮蒜產品提取與檢測。

4.5 色譜聯用法

色譜聯用法相較于單純的氣相色譜和液相色譜法在準確度和靈敏度上有顯著的優(yōu)勢。大蒜素的測定中常采用的是氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法。王建等[59]采用GC-MS法測定大蒜油及其軟膠囊中二烯丙基三硫醚等大蒜素的含量。針對目前尚無大蒜油軟膠囊有關產品標準和檢測方法的現狀,利用GC-MS檢測方法可以對大蒜油及以大蒜油為原料生產的大蒜油軟膠囊中的硫醚類化合物進行定性分析和定量測定。鄭屏等[60]采用GC-MS法對天然大蒜油和合成大蒜素的成分進行分析和鑒定,研究其主要組分及分布情況。通過對兩者質譜圖的比較,發(fā)現在合成的大蒜素中含有氯丙烯,以此判斷實際大蒜油樣品中是否含有合成大蒜素。康平利等[44]建立了用微波萃取技術提取大蒜中大蒜油的方法,并運用氣相色譜-質譜分析方法對提取物中的大蒜新素進行測定,結果表明,該方法具有快速、萃取劑用量少、精度好、回收率高、準確可靠等優(yōu)點,并通過對萃取條件的選擇,得出二氯甲烷為微波萃取大蒜油的最佳萃取劑。郭曉斐等[61]采用改進的水蒸氣蒸餾法從大蒜中提取揮發(fā)物,運用氣相色譜-質譜技術對大蒜油進行定性分析,共鑒定出20種物質,并用面積歸一化法對各物質的相對含量進行測定,結果表明含硫化合物約占揮發(fā)油總成分的95%以上,其中大蒜新素約占揮發(fā)油總量的三分之一,含量最高。

由于烯丙基硫化物弱極性難電離,因此利用液相色譜-質譜聯用法測定大蒜素含量的研究報道很少。李來生等[62]以AgNO3誘導使二烯丙基硫化物離子化,通過正離子模式測試較好實現了使用液相色譜-質譜聯用法檢測大蒜素,但是該方法缺乏普適性。

利用色譜及質譜檢測技術測試大蒜素的參數指標如表1。

表1 大蒜素色譜及質譜檢測技術參數指標對比表Tab.1 Comparison of parameters of allicin chromatography and mass spectrometry

4.6 其他方法

大蒜素的檢測方法還有硝酸汞滴定法。該方法的原理是利用大蒜素分子中含有的硫能與硝酸汞形成沉淀測定大蒜素的含量。該法操作相對繁瑣。周重陽等[63]利用大蒜素具有抗菌作用這一特點,建立了大腸桿菌生物法測定大蒜油中大蒜辣素和大蒜新素含量的方法。方法簡便易操作,并與化學方法檢測結果具有一致性。

隨著對大蒜素的藥理作用機制的不斷深入研究,大蒜素的應用將更加廣泛,其提取效率更加高效,產品加工方式不斷創(chuàng)新。對大蒜素成分及低含量殘留檢測技術的要求也會相應提高。隨著現代高分辨質譜的普遍應用,檢測技術將會更加精確、快速和高效。