張林,何力,張浪,周劍光,甘金華

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北 武漢 430023)

染色體是生物細(xì)胞核中載有遺傳信息(基因)的物質(zhì),是兩性生物進(jìn)化、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),參與生物體的各種代謝活動,對物種繁衍起到重要的作用[1-2]。每種生物染色體具有特定的數(shù)目、形態(tài)、結(jié)構(gòu)及核型。通過物種間染色體的差別可以對生物進(jìn)行分類并探討其親緣關(guān)系,同時也可以為生物的演化提供線索[3]。染色體的觀察、分析、數(shù)目及核型研究,對了解水生生物分類鑒定、親緣關(guān)系、進(jìn)化地位、遺傳變異規(guī)律、雌(雄)核發(fā)育、多倍體誘導(dǎo)、雜交育種、種質(zhì)資源保護(hù)等眾多遺傳學(xué)和分子生物學(xué)內(nèi)容的研究具有重要意義[4-5]。因此,在成本低、簡單易行、快速的基礎(chǔ)上制備出背景清晰、染色體分散良好且形態(tài)好的染色體標(biāo)本很重要,可保障染色體的顯帶處理、性別鑒定及熒光原位雜交(FISH)分析實驗。

水生動物種類豐富,染色體小、數(shù)目多。目前,水生動物染色體的研究在取材方面大多選擇分裂增殖能力強的頭腎(或全腎)。然而,結(jié)合多年的實驗經(jīng)驗發(fā)現(xiàn),并非所有的水生動物頭腎(或全腎)有(或較多)的分裂相?；铙w注射短期培養(yǎng)法和體細(xì)胞體外培養(yǎng)法是制備水生動物染色體常用的兩種方法。前者相對較簡單快速,往往受科研工作者的青睞。本研究運用活體注射短期培養(yǎng)法,總結(jié)了7例難度較大的水生動物染色體制備方法與技巧,供水生動物染色體快速制備參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物血球凝集素(PHA)、秋水仙素(Colchicine)、Giemsa染液均購自Solarbio@LIFE SCIENCES公司;0.075mol/L氯化鉀溶液、甲醇、冰醋酸均購自國藥集團(tuán);蕓豆購自武漢市沃爾瑪超市光谷分店;實驗水生動物采自長江水產(chǎn)研究所種質(zhì)資源庫梁子湖實驗基地。

1.2 染色體標(biāo)本制作

染色體標(biāo)本制備參考國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的體內(nèi)注射法[6-9],針對不同的品種方法如下：

(1)注射PHA(植物血球凝集素)和秋水仙素。自實驗水生動物胸鰭基部、胸腔、腹腔或后腿肌肉注射PHA溶液(0.85%NaCl配制),劑量5～15 μg/g (魚體質(zhì)量);24 h后注射秋水仙素溶液(0.85%NaCl配制),劑量2～6 μg/g (魚體質(zhì)量)。

(2)注射秋水仙素溶液2～6 h后,放血。取出頭、腎、脾臟、腿骨、性腺和脊椎等組織(針對水生動物不同,取不同的組織)用生理鹽水反復(fù)洗滌。

(3)制備細(xì)胞懸液。將所取組織塊置于裝有少許生理鹽水的小燒杯中,用小剪刀剪碎(1 mm3)或研磨組織,加入生理鹽水,用100目尼龍紗絹過濾。

(4)離心洗滌細(xì)胞。將濾液移入離心管1 000 r/min離心8 min。

(5)低滲處理。0.075 0或0.037 5 mol/L KCl溶液低滲處理45～60 min。

(6)固定。在低滲液內(nèi)加少許固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1,V∶V,以下同),用吸管吹打混勻進(jìn)行預(yù)固定2～3 min,隨后1 000 r/min離心8 min (以下時間同)。再重復(fù)固定2次,每次固定20 min。

(7)滴片。將細(xì)胞懸浮液滴于預(yù)冷載玻片上,隨后將載玻片在酒精燈上過火2～3次,自然干燥后用15%姬姆薩染色30 min,蒸餾水將反面沖洗干凈,自然干燥后鏡檢。

在以上通用制備方法的基礎(chǔ)上,總結(jié)7類水生動物染色體制備方法(表1)。

表1 7類水生動物染色體快速制備方法與技巧Tab.1 Methods and techniques for the chromosome rapid preparation of 7 kinds of aquatic animals

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體中期分裂相

每條(只)實驗水生動物累計統(tǒng)計至少100個中期分裂相,確定染色體數(shù)目。對于具有非眾數(shù)染色體的分裂相,可能是低滲或滴片過程中丟失了少量染色體。本研究中,發(fā)現(xiàn)烏龜(Mauremysreevesii)染色體個數(shù)為48～53,52的占65%,這與黃喉擬水龜(Mauremysmutica)[10]一致,因此確定烏龜2n=52。2008—2022年,研究發(fā)現(xiàn)不同批次、不同地理種群中華鱉(Trionyssinensis)的染色體個數(shù)為60～68,66的占67.5%以上,確定2n=66,這與付建平[11]、《中華鱉》(GB 21044—2007)[12]一致。另外研究發(fā)現(xiàn)個別三倍體鱉(Plodiscussinensis)3n=198?？耸显椢r(Procambarusclarkii)2014年發(fā)現(xiàn)拍攝的84張中期分裂相中,為2n=176的占51%,并且拍攝的20張減數(shù)分裂相中,n=88的有9張,占45%,當(dāng)時誤以為其眾數(shù)2n=176,后來通過反復(fù)試驗,通過不同地方、不同批次的送檢樣,確定克氏原鰲蝦2n=188,文獻(xiàn)報道其數(shù)目有2n=192[13-14]和2n=188[15]兩種眾數(shù),本研究與Murofushi等[15]的研究結(jié)果吻合。羅氏沼蝦(Macrorachiumrosenbergii)2n=118[16]。對于雌雄個體差異顯著的魚類,我們試圖找到性染色體,發(fā)現(xiàn)刀鱭(CoiliaMacrognathosBleeker)2n(♀)=47,2n(♂)=48,與莊平[17]報道一致。本團(tuán)隊近期研究的大量雌雄金錢魚(Scatophagusargus)染色體中期分裂相與其相似。牡蠣(Ostreodae)的染色體2n=20,同時發(fā)現(xiàn)遺傳改良的三倍體牡蠣染色體個數(shù)在27～32。3n=30的比例占最多,結(jié)合流氏細(xì)胞儀測量DNA含量,最終確定普通牡蠣2n=20,而通過染色體加倍分子遺傳改良選育的三倍體牡蠣3n=30。確定紫怡貝(Mytilusedulis)2n=48,褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)2n=48,大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)2n=48,青藏冷水性魚類黑斑原鮡(Glyptosternummaculatum)的染色體2n=48,與武云飛等[18]報道一致。拉薩裂腹魚(Racomawaltoni)的2n=92,與武云飛等[18]報道不一致,可能與采集樣本差異有關(guān)。下圖為7類水生動物染色體中期分裂相(圖1～12)。

圖1 烏龜染色體中期分裂相(×1 000)Fig.1 The metaphase chromosomes of Mauremys reevesii(×1 000)

圖2 鱉染色體中期分裂相(×1 000)Fig.2 The metaphase chromosomes of Trionyx sinensis(×1 000)

圖3 克氏原鰲蝦染色體中期分裂相(×1 000)Fig.3 The metaphase chromosomes of Procambarus clarkii(×1 000)

圖4 羅氏沼蝦染色體中期分裂相(×1 000)Fig.4 The metaphase chromosomes of Macrobraclvium rosenbergii(×1 000)

圖5 雌性刀鱭染色體中期分裂相(×1 000)Fig.5 The metaphase chromosomes of female Coilia macrognathos Bellker(×1 000)

圖6 雄性刀鱭染色體中期分裂相(×1 000)Fig.6 The metaphase chromosomes of male Coilia macrognathos Bleeker(×1 000)

圖7 紫貽貝的染色體中期分裂相(×1 000)Fig.7 The metaphase chromosomes of Mytilus edulis(×1 000)

圖8 牡蠣的染色體中期分裂相(×600)Fig.8 The metaphase chromosomes of Ostreidae(×600)

圖9 褐菖鲉的染色體中期分裂相(×1 000)Fig.9 The metaphase chromosomes of Sebastiscus marmoratus(×1 000)

圖10 大瀧六線魚的染色體中期分裂相(×1 000)Fig.10 The metaphase chromosomes of Hexagrammos otakii(×1 000)

圖11 黑斑原鮡的染色體中期分裂相(×1 000)Fig.11 The metaphase chromosomes of Glyptosternum maculatum(×1 000)

圖12 拉薩裂腹魚染色體中期分裂相(×1 000)Fig.12 The metaphase chromosomes of Racoma waltoni(×1 000)

3 討論

水生動物染色體活體制備方法早有報道,一般活體胸腔或腹腔注射蕓豆液(一顆2 g蕓豆充分研磨后用10 mL生理鹽水浸泡過夜,按0.2～0.5 mL/500 g魚體質(zhì)量注射)或PHA(5～10 μg/g魚體質(zhì)量),間隔24 h后(少部分物種需間隔48 h),腔體注射秋水仙素(1.5～2.5 μg/g魚體質(zhì)量),取樣部位為腎臟[19-20]。但此常規(guī)方法,并不適宜所有的水生動物,如大鯢(Andriasdavidianus)、螃蟹(Brachyura)等。

2008—2020年期間,對于來自全國不同地方不同批次的大鯢,本團(tuán)隊用以上常規(guī)活體制備染色體,發(fā)現(xiàn)取腎臟、骨髓無法獲得染色體中期分裂相。當(dāng)在上述的基礎(chǔ)上,我們采用PHA兩針注射法,首先PHA10 μg/g腹腔注射24 h,再PHA 5 μg/g腹腔注射24 h后,秋水仙素2.5 μg/g注射3 h,取腎臟、脾臟及骨髓可以獲得少量分裂相,同時取其他大鯢樣本,上述方法注射后,再用0.005%秋水仙素,浸泡以上組織,可以獲得稍多點清晰且分散度較好的中期分裂相。

螃蟹也是注射法結(jié)合0.005%秋水仙素活體浸泡12 h,取性腺(精巢和卵巢)方可得到染色體減數(shù)分裂相及中期分裂相。

染色體制備的另一種方法是細(xì)胞培養(yǎng)法,首先建立細(xì)胞系,然后分別用適當(dāng)濃度的PHA刺激及秋水仙素抑制,促使細(xì)胞停留在分裂中期[21-22]。此法適合大多數(shù)水生動物,也并非所有的水生動物,因為有的品種建立了不同組織來源的細(xì)胞系,并傳了20多代,秋水仙素用不同的濃度及時間處理,最后得不到染色體中期分裂相,而用活體法在3～5 d內(nèi)便得到較清晰、分散度較好的中期分裂相,并統(tǒng)計獲得雌雄個體的染色體眾數(shù)。此法費時、費力、成本高,儀器設(shè)備要求較高,有的水生動物根本無法建立有效的細(xì)胞系。因此,本研究采用PHA或蕓豆液注射活體魚、蝦、蟹類等代表性水生動物,用秋水仙素處理后進(jìn)行染色體制備的方法表明：無論是體外培養(yǎng)法還是體內(nèi)活體注射法,只有在PHA的刺激和秋水仙素抑制下才能使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。當(dāng)活體生物體內(nèi)注射適量濃度的PHA,經(jīng)24～72 h,大多數(shù)淋巴細(xì)胞正處于第二增殖周期內(nèi),此時注射適量秋水仙素,可使許多分裂細(xì)胞停止在分裂中期[20-21]。當(dāng)PHA注射劑量不足時,就不能刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為原淋巴細(xì)胞,使細(xì)胞重新進(jìn)入增殖周期進(jìn)行有絲分裂。但是,當(dāng)采用體外培養(yǎng)法時,PHA濃度過大會造成紅細(xì)胞凝集。體內(nèi)短期活體培養(yǎng)法即使注射大劑量的PHA也不存在這種現(xiàn)象。對于龜、鱉等生命力頑強的動物用蕓豆液,或兩者結(jié)合比只注射PHA刺激效果好,且蕓豆液便宜易得,而且從蕓豆中能提取植物血球凝集素。此外,腔體比肌肉注射效果好,對于貝殼類等無法注射的水生動物,采用低劑量PHA浸泡24～48 h[23],獲得盡可能多的淋巴細(xì)胞。然后采用0.04%～0.05%秋水仙素浸泡12～24 h。當(dāng)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法時,不適合用蕓豆液,而只能使用PHA。

秋水仙素是一種細(xì)胞紡錘體抑制劑。PHA注射間隔24～72 h后,用秋水仙素處理,作用時間為2.5～3 h,劑量為1.5～3 μg/g魚體質(zhì)量。對于刀鱭和銀鯧(Pampusargenteus)這種應(yīng)激反應(yīng)特別強烈的水生動物,實際操作中PHA和秋水仙素同時注射。秋水仙素溶液的濃度與處理時間存在時效關(guān)系。秋水仙素的濃度過高或處理的時間過長,雖然標(biāo)本中的分裂細(xì)胞較多,但染色體過于濃縮、形態(tài)特征模糊,難以進(jìn)行核型分析與后期的細(xì)胞遺傳學(xué)實驗[24]。相反,如果秋水仙素的濃度過低或處理的時間過短,則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少。對于冷水性水生動物,秋水仙素作用的時間稍長,需3～4 h。對于螃蟹、蝦、大鯢、黃緣閉殼龜(Cuoraflavomarginata)等水生動物秋水仙素作用時間需要更長,一般肌肉或腹腔注射4～6 h,或采用低劑量的秋水仙素浸泡12～24 h。

使用0.075 0或0.037 5 mol/L氯化鉀溶液作為低滲液孵育細(xì)胞,使紅細(xì)胞及分裂細(xì)胞的細(xì)胞核膨脹、細(xì)胞膜破裂,染色體分散良好而便于觀察計數(shù)。低滲時間40～60 min為宜,當(dāng)?shù)蜐B處理時間過長時,細(xì)胞膜往往過早破裂,導(dǎo)致分裂細(xì)胞丟失,或染色體丟失;當(dāng)?shù)蜐B處理時間不足時,細(xì)胞膨脹不夠,則染色體分散不佳,難以進(jìn)行染色體計數(shù)分析。經(jīng)過低滲處理的細(xì)胞因已膨脹,易破裂,造成染色體丟失,所以低滲后應(yīng)特別注意不要用力沖吸。

低滲孵育后,1 000 r/min離心6 min,去掉細(xì)胞膜碎片。離心時的速度如太慢,會使許多細(xì)胞丟失;速度如過快,細(xì)胞團(tuán)塊不易打碎。固定液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,甲醇和冰醋酸按3∶1的體積比配制。如果固定液不新鮮或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不好時,染色體模糊,并有絲狀胞質(zhì)成分相連。加固定液時,最好沿管壁輕輕的邊加邊搖晃。

滴片時玻片必須干凈、且冰凍過。其次距離恰當(dāng)、滴加量適當(dāng)、合適的烤片時間和溫度也是獲得高質(zhì)量染色體的必然要求。高質(zhì)量的染色體是后期顯帶、染色體遺傳操作實驗的保障。

染色體標(biāo)本運用活體注射法,多采用生物細(xì)胞分裂能力較強時期或組織獲取染色體中期分裂相,一般是頭、腎、鰓等代謝旺盛組織,細(xì)胞分裂指數(shù)高,并且取材及后續(xù)的處理簡單,易得到較多的中期分裂相[25]。如果在腎中找不到有效分裂相或分裂相不多時,取脾臟、腿骨、骨髓、性腺等,其機(jī)制可能與水生動物特有的生理條件有關(guān)。

在處理細(xì)節(jié)上,本研究中發(fā)現(xiàn),烏龜(草龜、黃緣閉殼龜)需用相對大的PHA劑量20 μg/g(體重)腹腔或肌肉注射36～48 h,而其他水生動物,如：淡水魚或海水魚只需5～10 μg/g(體重)腹腔或胸腔注射20～24 h,而后再秋水仙素處理,并且作用時間較長1.5 h左右。并且組織具有偏好性,前者取脾臟,后者取腎臟。脾臟是烏龜?shù)拿庖咂鞴?同時也是細(xì)胞分裂最旺盛的組織。此外,像有殼的貝類,如牡蠣、螃蟹,本研究采用10 μg/L 的PHA充氧浸泡12～72 h,一般浸泡24 h,如果覺得水生動物生命力旺盛,用蕓豆液浸泡最好,簡單經(jīng)濟(jì)效果好。再用0.005%的秋水仙素浸泡過夜。對于蝦類,小蝦用浸泡法,而大于30 g以上的蝦用肌肉注射法,效果更好。有殼的水生物,首先優(yōu)先取代謝旺盛、分裂指數(shù)較高的組織如腎臟、性腺、腮、肝胰臟。蝦一般取性腺(精巢或卵巢),可觀察到較多的減數(shù)分裂相,這將有助于確定染色體中期分裂相眾數(shù)。

有的水生動物雌雄染色體個數(shù)及核型有區(qū)別,比如刀鱭2n(♀)=47,2n(♂)=48[17],核型公式：2n(♀)=47t(SAT),2n(♂)=48t(SAT),性染色體可能發(fā)生融合。所以在制備染色體時,雌雄個體一般各5～10尾(只),甚至更多的個體,每個個體拍攝較多的中期分裂相,以便觀察帶有隨體和次溢痕的染色體和異型染色體,分析雌雄個體差異及有無性染色體。此外不同實驗室條件下的實驗處理、實驗材料的區(qū)域性,分裂相及核型分析結(jié)果會略微有差異,但往往差異不顯著。

4 結(jié)論

本研究運用經(jīng)典的活體短期注射法,在處理環(huán)節(jié)上根據(jù)每類物種生理生長特異性和組織偏好性,介紹了快速獲得7例難度較大的水生動物染色體中期分裂相的方法與技巧,為廣大科研工作者進(jìn)行性別倍鑒定、基因定位、FISH分析等實驗需要制備染色體中期分裂相時,根據(jù)這7種水生動物的處理細(xì)節(jié),快速的獲得染色體,為后期的實驗打好基礎(chǔ)。