田 敏 劉新春 潘佳佳 梁麗靜 董 雷 劉美池 馮宗云

研究簡(jiǎn)報(bào)

大麥籽粒纖維素、半纖維素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

田 敏 劉新春 潘佳佳 梁麗靜 董 雷 劉美池 馮宗云*

西南作物基因資源發(fā)掘與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥青稞等健康功能作物研究中心, 四川成都 611130

纖維是衡量大麥飼用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一, 其遺傳機(jī)制解析對(duì)飼用大麥品種選育具有一定的指導(dǎo)意義。本研究以316份大麥品種為材料, 連續(xù)2年種植于成都、康定兩地, 利用分布于大麥基因組上的75,289個(gè)SNPs對(duì)籽粒纖維素、半纖維素含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。利用TASSEL軟件的混合線性模型, 纖維素、半纖維素性狀分別重復(fù)檢測(cè)到65個(gè)、34個(gè)顯著SNPs位點(diǎn)(≤0.05/N), 標(biāo)記的平均解釋表型變異率分別為13.18%、14.10%。纖維素、半纖維素含量在3個(gè)及以上環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到的顯著相關(guān)位點(diǎn)分別為4個(gè)、1個(gè), 2個(gè)性狀檢測(cè)到了相同的SNP位點(diǎn), 說(shuō)明2個(gè)性狀存在遺傳相關(guān)性。纖維素性狀挖掘到6個(gè)候選基因, 半纖維素性狀挖掘到1個(gè)候選基因, 為大麥纖維的遺傳與分子機(jī)理研究及遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

大麥; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 纖維素; 半纖維素

大麥(L.)是全球第五大糧食作物, 栽培歷史悠久, 種植面積廣泛。其營(yíng)養(yǎng)成分種類豐富, 含有多種蛋白、纖維、維生素、礦物質(zhì)元素以及生物活性物質(zhì)等, 具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 廣泛應(yīng)用于釀造、食品、飼用等領(lǐng)域[1]。膳食纖維影響動(dòng)物的消化吸收, 其中的纖維含量是影響飼用大麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要因素。可溶性膳食纖維、粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量等性狀被作為大麥飼草品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[2-4]。已有不少學(xué)者對(duì)飼草品質(zhì)性狀進(jìn)行QTL定位分析, 發(fā)掘相關(guān)性狀的遺傳位點(diǎn)[5-9]。

纖維素和半纖維素作為大麥纖維的兩大成分, 其遺傳調(diào)控機(jī)制成為了研究熱點(diǎn)。纖維素合成酶類相關(guān)基因是合成纖維素和半纖維素的關(guān)鍵基因, 圍繞大麥纖維素合酶基因(cellulose-synthase,)和類纖維素合酶基因(cellulase synthase-like,)的鑒定和功能研究已展開(kāi)大量工作。大麥基因家族至少有8個(gè)成員, 其中、和與初級(jí)細(xì)胞壁發(fā)育有關(guān),、和影響次級(jí)細(xì)胞壁的構(gòu)建[10-11]。是半纖維素合成的重要基因家族, 利用生物信息學(xué)分析方法, Burton等[12]鑒定到20個(gè)基因, 王曉雨[13]鑒定到24個(gè)基因, Nishantha等[14]鑒定到18個(gè)基因。大麥中,()、等基因也調(diào)控纖維素的合成與組裝過(guò)程, 進(jìn)而影響細(xì)胞壁的發(fā)育[15]。水解酶GH9中的內(nèi)切-(1,4)-β-葡聚糖酶(纖維素酶)能水解(1,4)-β-糖苷鍵, 使纖維素分解,和等即為該家族基因成員, GH1和GH3家族的一些成員能水解源自纖維素的寡糖[16]。GH9家族中還包括內(nèi)切木聚糖酶和木葡聚糖酶等, 參與半纖維素的水解[17]。MYB和NAC轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子, 是纖維素和半纖維素合成的主轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān), 能夠起始二者的合成[18-19]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)是一種通過(guò)關(guān)聯(lián)全基因組遺傳標(biāo)記和表型變異, 定位目標(biāo)性狀的遺傳位點(diǎn), 在群體水平解析復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳信息的方法[20]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 許多植物完成了基因組測(cè)序工作, GWAS 方法已成為解析植物數(shù)量性狀遺傳構(gòu)成的重要方法, 廣泛應(yīng)用于水稻[21]、小麥[22]、玉米[23]、油菜[24]等作物性狀研究中。在大麥中, 利用GWAS分析了農(nóng)藝性狀[25-26]、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[27-28]、抗逆性[29]、抗病性[30]等性狀, 并發(fā)掘出控制這些性狀變異的遺傳位點(diǎn)和功能基因。本研究以316份大麥品種作為材料, 基于前期課題組利用簡(jiǎn)化基因組開(kāi)發(fā)的高通量SNP分子標(biāo)記對(duì)連續(xù)2年種植于成都、康定兩地的大麥籽粒纖維素、半纖維含量性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 以期挖掘調(diào)控相關(guān)性狀變異的遺傳位點(diǎn)或候選基因, 為培育新型專用型大麥品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料由國(guó)內(nèi)外收集的316份大麥品種構(gòu)成, 其中,國(guó)內(nèi)材料有296份, 主要來(lái)自西藏(159份)、青海(50份)、四川(32份)等省(區(qū)), 國(guó)外材料有6份, 美國(guó)和墨西哥各2份, 加拿大和日本各1份, 14份材料未知來(lái)源。所有材料均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院功能健康作物研究中心提供, 材料編號(hào)、類型及來(lái)源見(jiàn)附表1。

供試材料于2019年、2020年種植在四川成都, 次年收獲, 2020年、2021年種植在四川康定, 當(dāng)年收獲。試點(diǎn)按隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì), 行長(zhǎng)1.5 m, 行距0.4 m, 株距0.05 m, 每行播30粒種子。生長(zhǎng)期間管理措施同大田。成熟期收獲種子, 風(fēng)干后揚(yáng)凈貯藏、選用顆粒大小相近的籽粒用粉碎機(jī)粉碎, 干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 品質(zhì)測(cè)定與表型統(tǒng)計(jì)

參照安玉民等[31]方法測(cè)定纖維素含量和半纖維素含量, 重復(fù)3次。

通過(guò)Microsoft Excel 2010分析整理數(shù)據(jù), 利用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、方差分析及相關(guān)性分析。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

采用Structure 2.3.4軟件, 基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型對(duì)供試的316個(gè)大麥種質(zhì)資源進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析, 將設(shè)置為2～10, 計(jì)算每個(gè)值下的Δ值, 繪制Δ值隨值變化的折線圖, 確定群體亞群數(shù)。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用本課題組前期已獲得該關(guān)聯(lián)分析群體的75,289個(gè)SNP標(biāo)記分型數(shù)據(jù), 運(yùn)用TASSEL 5.2.8軟件中的混合線性模型(mixed linear model, MLM)進(jìn)行纖維素含量、半纖維素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析研究。將顯著性臨界值設(shè)置為=0.05/=6.64×10–7(為本研究的標(biāo)記數(shù))。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果, 將發(fā)掘到顯著性SNP標(biāo)記的物理位置與大麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的物理位置進(jìn)行比對(duì), 以上下游各延伸200 kb作為候選基因區(qū)段。利用大麥基因組網(wǎng)站中的基因功能注釋信息, 挖掘性狀相關(guān)候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素、半纖維素表型分析

2年兩點(diǎn)大麥籽粒纖維素、半纖維素含量的基本描述統(tǒng)計(jì)如表1。2019成都(19 CD)、2020康定(20 KD)、2020成都(20 CD)、2021康定(21 KD)環(huán)境纖維素含量均值分別為9.12%、9.82%、8.37%、8.73%, 最低為2.65%, 最高為22.29%; 半纖維素含量均值分別為12.58%、12.37%、11.47%、12.91%, 最低為6.99%, 最高為27.74%, 各環(huán)境下2個(gè)性狀的變異系數(shù)在22.00%～45.28%之間, 說(shuō)明材料間表型差異明顯, 不同環(huán)境下群體的整體表現(xiàn)有所不同。纖維素、半纖維素含量在4個(gè)環(huán)境的偏度均大于0, 呈正偏態(tài), 峰度多小于1.5, 整體看成擬合正態(tài)分布, 符合數(shù)量性狀特征。

多點(diǎn)聯(lián)合方差分析表明, 基因型、環(huán)境以及基因型與環(huán)境互作存在極顯著差異(表2), 說(shuō)明關(guān)聯(lián)群體纖維素、半纖維素含量遺傳變異豐富, 且受環(huán)境影響較大, 廣義遺傳率分別為79.45%、75.29%, 說(shuō)明遺傳因素是影響性狀的主要因素。4個(gè)環(huán)境兩性狀的相關(guān)系數(shù)分別為0.313、0.880、0.976和0.977, 在<0.01水平上顯著相關(guān), 表明2個(gè)性狀存在相關(guān)性。

表1 不同試點(diǎn)大麥籽粒纖維素和半纖維素含量的表現(xiàn)

CD: 成都; KD: 康定。CD: Chengdu; KD: Kangding.

表2 大麥籽粒纖維素和半纖維素含量的多環(huán)境聯(lián)合方差

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

采用Structure軟件對(duì)供試材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)計(jì)算出的Δ值繪制Δ值隨值變化(= 2～10)的折線圖(圖1-A),=3時(shí)Δ出現(xiàn)明顯的峰值, 其余值對(duì)應(yīng)的Δ值均趨于0, 因此選定=3為最適的群體數(shù)目, 將本群分為3個(gè)亞群(圖1-B)。第1亞群包含102份材料(32.28%), 第2亞群包含139份材料(43.99%), 第3亞群包含75份材料(23.73%)。其中來(lái)源于西藏的159份材料主要位于第2亞群, 占該類群總數(shù)的71.07%, 青海的50份材料中有35份分布于第1亞群(64.00%), 四川的32份材料中有23份分布于第1亞群(71.88%), 貴州、河南、黑龍江、江蘇、山西、陜西等省的材料主要分布于第3亞群, 同一來(lái)源地的材料之間親緣關(guān)系較近。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用混合線性模型(MLM)對(duì)籽粒纖維素、半纖維素含量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖2)。在4個(gè)環(huán)境重復(fù)檢測(cè)到65個(gè)纖維素含量顯著SNP分子標(biāo)記位點(diǎn), 這些位點(diǎn)可解釋的平均表型變異率為13.18%, 分布在大麥所有的染色體上, 其中在5H染色體上發(fā)現(xiàn)的顯著性標(biāo)記數(shù)最多, 有21個(gè)。2號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)25574694和5號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)471635005在2020康定、2020成都、2021康定3個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到, 2號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)28768234和5號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)437943810在2019成都、2020成都、2021康定3個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到, 在2020成都和2021康定發(fā)現(xiàn)較多相同的顯著位點(diǎn)。在4個(gè)環(huán)境重復(fù)檢測(cè)到34個(gè)半纖維素含量相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn), 位點(diǎn)的平均表型變異率為14.10%, 在5H染色體上發(fā)現(xiàn)的顯著性標(biāo)記數(shù)最多, 有14個(gè), 其余染色體上也定位到顯著相關(guān)位點(diǎn)。在2019成都、2020成都和2021康定3個(gè)環(huán)境中檢出一個(gè)相同的顯著位點(diǎn), 為2號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)28768234, 在2020成都和2021康定檢出較多相同的顯著位點(diǎn)。纖維素和半纖維素有多個(gè)相同顯著SNP位點(diǎn), 也有遺傳距離相隔極近的顯著位點(diǎn), 說(shuō)明2個(gè)性狀遺傳上具有相關(guān)性(附表2和附表3)。

圖1 316份大麥材料群體結(jié)構(gòu)分析

A: 通過(guò)假定不同值計(jì)算得到的Δ值; B: 通過(guò)Structure軟件分析的遺傳結(jié)構(gòu)(紅色: 第1亞群; 綠色: 第2亞群; 藍(lán)色: 第3亞群)。

A: Δ-value calculated by assuming different-values; B: genetic structure analyzed by structure software (red: the first subgroup; green: the second subgroup; blue: the third subgroup).

圖2 不同環(huán)境大麥籽粒纖維素、半纖維素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

A、B、C、D分別表示2019成都、2020康定、2020成都、2021康定纖維素含量的曼哈頓圖; E、F、G、H分別表示2019成都、2020康定、2020成都、2021康定半纖維素含量的曼哈頓圖。

A. B, C, and D represent Manhattan diagram of cellulose content in 2019 Chengdu, 2020 Kangding, 2020 Chengdu, and 2021 Kangding, respectively; E, F, G, and H represent the Manhattan diagram of hemicellulose content in 2019 Chengdu, 2020 Kangding, 2020 Chengdu, and 2021 Kangding, respectively.

2.4 預(yù)測(cè)候選基因

據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果, 在4個(gè)環(huán)境重復(fù)3次檢測(cè)到的性狀顯著位點(diǎn)上下共400 kb區(qū)間范圍內(nèi)尋找候選基因。根據(jù)已知纖維素、半纖維素基因的編碼蛋白類型與數(shù)據(jù)庫(kù)候選基因功能注釋信息, 初步篩選到6個(gè)與纖維素有關(guān)的候選基因, 1個(gè)與半纖維素相關(guān)的候選基因,和編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶, 其中也是半纖維素相關(guān)的候選基因,和編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,編碼UDP-葡萄糖4-差異構(gòu)酶家族蛋白,編碼內(nèi)切葡聚糖酶(表3)。

3 討論

關(guān)聯(lián)分析是解析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的常用方法, 群體大小、標(biāo)記數(shù)量、表型數(shù)據(jù)獲取和統(tǒng)計(jì)分析方法等因素會(huì)影響關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性, 因此需要從多方面進(jìn)行考慮, 以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[32-34]。為提高結(jié)果可信度, 可將關(guān)聯(lián)分析與其他分析方法整合, 如GWAS與QTL定位結(jié)合[35-36]、GWAS與WGCNA (加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)結(jié)合[37-38]等, 同時(shí)可對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表3 纖維素、半纖維素含量相關(guān)候選基因信息

本研究對(duì)纖維素和半纖維素含量進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), 2個(gè)性狀在4個(gè)環(huán)境下均存在顯著的正相關(guān)性, 說(shuō)明二者緊密聯(lián)系, 相互影響。后續(xù)關(guān)聯(lián)分析2個(gè)性狀發(fā)掘出相同的顯著SNP位點(diǎn), 馬珍珍等[39]對(duì)甘藍(lán)型油菜中的纖維素和半纖維素含量QTL分析也發(fā)現(xiàn)二者存在重疊區(qū)段, 說(shuō)明纖維素和半纖維素性狀具有一定的遺傳相關(guān)性。海拔高度、土壤土質(zhì)、氣候條件、農(nóng)藝措施等會(huì)影響植物的生長(zhǎng)狀況, 從而改變植物的性狀表現(xiàn)。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 不同地區(qū)、不同年份大麥籽粒纖維素和半纖維素含量存在差異,環(huán)境對(duì)2個(gè)性狀有較大影響。因此在全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí), 主要關(guān)注檢測(cè)出的重合位點(diǎn), 將在3個(gè)及以上環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)出的顯著位點(diǎn)作為2個(gè)性狀的遺傳調(diào)控位點(diǎn), 并在這些位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)段挖掘候選基因。

2個(gè)性狀分別預(yù)測(cè)到了6個(gè)、1個(gè)候選基因, 皆是酶類基因, 涉及糖的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與分解過(guò)程。和均編碼糖基轉(zhuǎn)移酶, 具有尿苷二磷酸(UDP)糖基轉(zhuǎn)移酶活性。纖維素和半纖維素的合成以核苷酸糖為底物, 尿苷二磷酸葡萄糖是纖維素合成的重要底物, 多種尿苷二磷酸糖和鳥(niǎo)苷二磷酸糖可作為糖基轉(zhuǎn)移酶的底物參與半纖維素的合成。Nishantha等[14]利用GWAS發(fā)掘影響大麥稈纖維素含量的候選基因, 鑒定到2個(gè)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(和), 并對(duì)進(jìn)行共表達(dá)分析, 結(jié)果推測(cè)其調(diào)控次生壁纖維素的合成。和編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。核苷酸糖多在胞質(zhì)中合成, 然后轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體腔, 這一過(guò)程需要定位于高爾基體的核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。水稻OsNST1是一種UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,點(diǎn)突變后, 細(xì)胞壁中的單糖葡萄糖含量降低, 纖維素的含量也減小, 而其他細(xì)胞壁多糖的含量增加, 表明高爾基體定位的核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞壁生物合成的調(diào)控作用[40]。編碼內(nèi)切葡聚糖酶, 是糖基水解酶9 (cellulase E)家族成員, 能水解(1,4)-β-糖苷鍵, 參與纖維素的分解過(guò)程。

纖維素和半纖維素是大麥?zhǔn)秤美w維的重要成分, 作為不可溶性膳食纖維具有通便之效。在大鼠食物中添加大麥膳食纖維, 與對(duì)照相比, 大鼠的增重較少, 排便增多, 胃腸道運(yùn)輸能力改善[41]。對(duì)人類來(lái)說(shuō), 膳食纖維能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu), 通過(guò)物理效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、結(jié)腸發(fā)酵等多種機(jī)制來(lái)改善機(jī)體健康狀況, 有助于防治肥胖癥、糖尿病、結(jié)腸癌等疾病[42]。纖維也是考察大麥飼用品質(zhì)的重要指標(biāo), 粗飼料干物質(zhì)中粗纖維含量應(yīng)在18%以上, 中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維影響飼料消化率、潛在采食量, 含量越低, 粗飼料品質(zhì)越好[43]。莖稈強(qiáng)度與作物的產(chǎn)量、抗性直接相關(guān), 是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀, 次生壁的組分結(jié)構(gòu)與植株莖稈機(jī)械強(qiáng)度直接相關(guān)。次生壁纖維素含量降低, 會(huì)使壁變薄, 植株機(jī)械強(qiáng)度降低, 半纖維素含量變化也會(huì)引起莖稈強(qiáng)度的改變[44-45]?？梢?jiàn), 纖維素和半纖維素含量對(duì)于大麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、飼用品質(zhì)和農(nóng)藝性狀具有一定影響, 有重要的研究意義。

附表 請(qǐng)見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.chinacrops. org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http:// c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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Genome-wide association analysis of cellulose content and hemicellulose content in grains of barley

TIAN Min, LIU Xin-Chun, PAN Jia-Jia, LIANG Li-Jing, DONG Lei, LIU Mei-Chi, and FENG Zong-Yun*

State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China / Research Center for Healthy Functional Crops such as Barley and Hulless Barley / College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

Fiber is one of the important indexes to evaluate the forage quality of barley, and the analysis of its genetic mechanism has important guiding significance for the selection and breeding of forage barley. In this study, 316 barley varieties were planted in Chengdu and Kangding for two consecutive years, and 75,289 SNPs distributed in barley genome were used for genome-wide association analysis of grain cellulose and hemicellulose content, 65 and 34 significant SNPs (≤ 0.05/N) were repeatedly detected for cellulose and hemicellulose traits using the mixed linear model of TASSEL software, respectively. The mean explained phenotypic variation rates of markers were 13.18% and 14.10%, respectively. There were four and one significant correlation loci repeatedly detected for cellulose and hemicellulose content in three or more environments, respectively. The same SNP loci were detected for two traits, indicating that there was genetic correlation between the two traits. Six candidate genes were found for cellulose traits, and one candidate gene was found for hemicellulose traits, which laid the foundation for genetic and molecular mechanism research and genetic improvement of barley fiber.

barley; genome-wide association analysis; cellulose; hemicellulose

10.3724/SP.J.1006.2023.21043

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD1000705), 四川省國(guó)際科技創(chuàng)新合作項(xiàng)目(2021YFH0113)和財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(大麥青稞, CARS-05)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD1000705), the Sichuan International Science and Technology Innovation Cooperation Project (2021YFH0113), and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Barley and Hulless Barley, CARS-05).

馮宗云, E-mail: zyfeng49@126.com

E-mail: 2030214850@qq.com

2022-06-22;

2022-11-27;

2022-12-13.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20221209.1820.002.html

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