【摘要】" 目的" 了解山楂提取物干預(yù)下高溫運(yùn)動(dòng)大鼠T淋巴細(xì)胞的變化，探究山楂提取物干預(yù)對(duì)機(jī)體免疫的影響。方法" 24只6w齡雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為四組，分別為常溫運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、高溫運(yùn)動(dòng)模型組、高溫運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充低劑量山楂提取物組（高溫低劑量組）、高溫運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充高劑量山楂提取物組（高溫高劑量組）。其中，高溫環(huán)境的濕球黑球溫度（wet bulb globe temperature，WBGT）系數(shù)為33±2℃，高劑量為156mg/kg，低劑量為78mg/kg。跑臺(tái)傾角15°，轉(zhuǎn)速為14rpm，上、下午各運(yùn)動(dòng)30min，每天共1h，共進(jìn)行4w。每周稱量大鼠體質(zhì)量。4w后，稱量胸腺、肝臟和脾臟的質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞的百分含量并計(jì)算CD4＋/CD8＋。結(jié)果" 四組大鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)后四組大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中高溫低劑量組大鼠體質(zhì)量最低，增重最少。四組大鼠胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；兩兩比較顯示，高溫低劑量組大鼠胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組及高溫高劑量組；高溫低劑量組大鼠脾臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組及高溫高劑量組；高溫高劑量組脾臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。四組大鼠血液T細(xì)胞亞群比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中高溫高劑量組 CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞比例最高，CD3＋T淋巴細(xì)胞、CD4＋/CD8＋比例較高，表明高溫下攝入高劑量山楂提取物，能夠提高T淋巴細(xì)胞各亞群百分含量。結(jié)論" 補(bǔ)充山楂提取物可以調(diào)節(jié)高溫運(yùn)動(dòng)條件下大鼠T淋巴細(xì)胞各亞群的水平，穩(wěn)定和改善機(jī)體免疫系統(tǒng)。

【關(guān)鍵詞】" 山楂提取物；高溫；臟器系數(shù)；T淋巴細(xì)胞

中圖分類號(hào)" R285.5" " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A" " 文章編號(hào)" 1671-0223（2023）20--04

【Abstract】" Objective" To study the changes of T lymphocytes of rats undergoing high-temperature exercise under the intervention of hawthorn extract， and investigate the impact of hawthorn extract intervention on immune function of the body. Methods" Twenty-four 6-week-old male SD rats were randomly divided into 4 groups after adaptive feeding for 1 week， which were divided into normal temperature exercise control group， high temperature exercise model group， hawthorn supplement high temperature low dose exercise group， hawthorn supplement high temperature high dose exercise group. Among them， the Wet Bulb Globe Temperature （WBGT） index in a high-temperature environment is 33 ± 2℃. The high dose is 156 mg/kg and the low dose is 78 mg/kg. The running platform has an inclination of 15° and a rotational speed of 14 rpm. Exercise for 30 minutes in the morning and afternoon， a total of 1 hour per day， for a total of 4 weeks. Weigh the body weight of rats every week. After 4 weeks， the weight of thymus， liver and spleen in rats was weighed and the organ index was calculated; The percentage content of blood T lymphocyte subsets CD3+， CD4+， CD8+T lymphocytes in rats was measured by flow cytometry and the CD4+/CD8+was calculated. Results" "The difference between the mass of the four groups （Pgt;0.05） and the four groups （Plt;0.05）， with the high temperature and low dose group had the lowest mass and the least weight gain. The differences between thymus coefficient， liver coefficient and spleen coefficient of the four groups were statistically significant （Plt;0.05）. The ison between the differences showed that high temperature and high temperature dose group exceeded high temperature and high temperature dose group; the differences were statistically significant （Plt;0.05）. The blood T cell subsets of the four groups were statistically significant （Plt;0.05）， in which the high-dose group had the highest proportion of CD3+， CD4+，CD8+ and CD4+/CD8+， indicating that the high-dose hawthorn extract at high temperature could increase the percentage content of each subset of T lymphocytes. Conclusion Supplementing hawthorn extract can regulate the levels of various subsets of T lymphocytes in rats under high-temperature exercise conditions， stabilize and improve the body's immune system.

【Key words】" "Hawthorn extract; High-temperature; Organ index; T lymphocytes

高溫作業(yè)人員長期處于高溫環(huán)境中進(jìn)行勞動(dòng)，會(huì)影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并誘發(fā)多種免疫性疾病[1]。有研究表明高溫下機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂可造成免疫器官萎縮，影響T淋巴細(xì)胞的成熟，降低細(xì)胞免疫功能，輔助性T細(xì)胞的缺失也會(huì)導(dǎo)致體液免疫功能減弱[2]。山楂提取物是一種藥食兩用的藥物，其中所含的黃酮類化合物可以顯著調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，減輕機(jī)體免疫系統(tǒng)受到環(huán)境影響的程度[3]。有研究總結(jié)了山楂中多酚類化合物對(duì)機(jī)體的作用，表示山楂多酚在免疫治療方面效果明顯，具有很大的研究潛力[4]。山楂提取物對(duì)機(jī)體在長期高溫和運(yùn)動(dòng)條件下的T淋巴細(xì)胞有哪些影響，有待進(jìn)一步探索。本研究通過建立大鼠高溫環(huán)境下跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型，模擬高溫工作人群的現(xiàn)狀[5]，觀察大鼠血液T淋巴細(xì)胞水平變化，從器官和細(xì)胞水平探討山楂提取物對(duì)高溫環(huán)境下大鼠的T淋巴細(xì)胞亞群的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑與儀器

山楂提取物（西安匯林生物科技有限公司），T淋巴亞群抗體試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)開發(fā)公司Anti-Rat），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（淮北正華生物儀器設(shè)備公司ZH-PT），流式細(xì)胞儀（美國BD公司AccuriC6），濕球黑球溫度系數(shù)儀（美國QUEST公司QT-32），高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司5425R）。

1.2" 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

24只SPF級(jí)的6w齡雄性SD大鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)選取6只，作為常溫運(yùn)動(dòng)對(duì)照組；隨機(jī)選取6只，作為高溫運(yùn)動(dòng)模型組，剩余大鼠隨機(jī)分為數(shù)量相同的兩組，分別為高溫運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充低劑量山楂提取物組簡稱為高溫低劑量組6只和高溫運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充高劑量山楂提取物組簡稱為高溫高劑量組6只。

1.3" 動(dòng)物模型構(gòu)建

大鼠飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)柜（溫度：22±2℃，濕度：50%～60%），自由飲食。大鼠用普通飼料（中國遼寧長生生物）按GB 14924.3-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-配合飼料營養(yǎng)成分喂食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作程序符合學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求，符合3R原則。高溫組的溫度設(shè)置參照高溫作業(yè)分級(jí)中的重度危害作業(yè)溫度（GBZ/T 229.3-2010），高溫溫度用鹵素管加熱，熱系數(shù)測(cè)定儀測(cè)量濕球黑球溫度（wet bulb globe temperature，WBGT）系數(shù)33±2℃。大鼠運(yùn)動(dòng)的設(shè)定依據(jù)Bedford動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)理論[6]，設(shè)定跑臺(tái)傾角15°，轉(zhuǎn)速為14rpm，上、下午各運(yùn)動(dòng)30min，每天1h，共4w。補(bǔ)充劑組每天進(jìn)行山楂提取物補(bǔ)充劑干預(yù)；對(duì)照組予以等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)過程中，每天記錄采食量，每周稱量大鼠體質(zhì)量。

1.4" 干預(yù)劑量計(jì)算

采用人與動(dòng)物體表面積法來換算高溫作業(yè)工人與實(shí)驗(yàn)大鼠的等效劑量[7-8]。參照DRIs中原花青素的UL800mg/d[9]，根據(jù)資料得知鋼鐵高溫作業(yè)工人的平均身高為175.3cm，平均體重為78.5kg[10]，計(jì)算出大鼠的黃酮類化合物最大耐受劑量為62.77mg/kg。按照山楂提取物中的黃酮類含量40.21%，計(jì)算得出大鼠每天山楂提取物灌胃劑量不超過156.1mg/kg。按照大鼠山楂提取物的最大耐受劑量，將156mg/kg作為每日灌胃高劑量，取其量的一半78mg/kg作為每日灌胃低劑量。

1.5" 樣品采集與處理

補(bǔ)充劑干預(yù)4w后，將大鼠麻醉，取胸腺、肝臟、脾臟組織，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=[臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）]×100%[11]。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞含量。

1.6" 數(shù)據(jù)分析處理方法

整理實(shí)驗(yàn)記錄，建立數(shù)據(jù)庫。采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用“±s”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較使用LSD法檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" 四組大鼠體質(zhì)量比較

四組大鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)后，四組大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），其中常溫運(yùn)動(dòng)組最高，高溫運(yùn)動(dòng)組次之，高溫低劑量組最低，見表1。

2.2" 四組大鼠胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)及脾臟系數(shù)比較

四組大鼠胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；兩兩比較顯示，高溫低劑量組大鼠胸腺系數(shù)、肝臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組及高溫高劑量組；高溫低劑量組大鼠脾臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組及高溫高劑量組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），并且高溫高劑量組脾臟系數(shù)高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。見表2。

2.3" 大鼠血液T細(xì)胞亞群

四組大鼠血液T細(xì)胞亞群比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。兩兩比較顯示，常溫運(yùn)動(dòng)組大鼠血液CD3＋、CD4＋T細(xì)胞百分比及CD4＋/CD8＋高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；高溫低劑量組大鼠血液CD4＋T細(xì)胞百分比高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD3＋、CD4＋T細(xì)胞百分比高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD8＋T細(xì)胞百分比高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD4＋/CD8＋高于高溫運(yùn)動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；高溫高劑量組大鼠血液CD3＋、CD4＋、CD8＋T細(xì)胞百分比高于高溫低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。見表3。

3" 討論

在高溫環(huán)境下工作的工人會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激，造成內(nèi)環(huán)境紊亂，引起特異性或非特異性反應(yīng)，直接或間接地?fù)p害人體的免疫系統(tǒng)[12-13]。山楂含有豐富的植物化學(xué)物質(zhì)，其提取物中所含的黃酮類物質(zhì)具有天然地生物活性，為改善高溫環(huán)境下機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的研究提供了物質(zhì)來源基礎(chǔ)[14]。本研究從免疫器官、免疫細(xì)胞進(jìn)行不同層面的分析探究山楂提取物調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的機(jī)制，并通過設(shè)置高溫運(yùn)動(dòng)的環(huán)境條件，為研究營養(yǎng)干預(yù)下特殊環(huán)境作業(yè)人群的免疫調(diào)節(jié)提供參考。

免疫器官的重量在一定程度上可反映免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量。脾臟作為外周免疫器官，可以儲(chǔ)存、增殖淋巴細(xì)胞和分泌多種抗體和細(xì)胞因子，參與機(jī)體特異性和非特異性免疫[15]。脾臟系數(shù)的降低，不僅直接說明免疫功能的降低，也間接說明淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞數(shù)量減少，從而可以間接了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞總體水平[15]。有研究通過對(duì)小鼠灌胃不同含量的沙蔥黃酮，檢測(cè)小鼠免疫器官系數(shù)的變化，結(jié)果顯示高劑量沙蔥黃酮顯著提高小鼠的脾臟系數(shù)[16]。本研究中，與高溫運(yùn)動(dòng)組比較，高溫運(yùn)動(dòng)劑量組脾臟系數(shù)顯著提高，說明補(bǔ)充山楂提取物可以提高外周免疫器官的活性。而與山楂補(bǔ)充劑高溫低劑量運(yùn)動(dòng)組比較，山楂補(bǔ)充劑高溫高劑量運(yùn)動(dòng)組脾臟系數(shù)明顯降低，表示補(bǔ)充劑劑量過大會(huì)導(dǎo)致外周免疫器官活性受到抑制。

T淋巴細(xì)胞在臨床上是判斷細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，其功能取決于T淋巴細(xì)胞總值（CD3＋）及其亞群（CD4＋、CD8＋）的相對(duì)組成。正常情況下，亞群間互相拮抗達(dá)到平衡；當(dāng)免疫失衡，細(xì)胞數(shù)及比值發(fā)生紊亂，則易引發(fā)疾病。當(dāng)CD4＋/CD8＋的值約為2時(shí)，表示機(jī)體的免疫系統(tǒng)保持在穩(wěn)定狀態(tài)。如果該比值偏離穩(wěn)態(tài)過高或過低，則意味著免疫系統(tǒng)功能和身體的易感性增強(qiáng)[17]。研究顯示[17]，與安靜時(shí)相比，長期高溫運(yùn)動(dòng)后即刻檢測(cè)顯示受試者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋以及CD4＋/CD8＋的值均有不同程度的降低。有研究進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，在黃酮類化合物原花青素刺激下，脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋T細(xì)胞亞群數(shù)量增加，且活化了輔助性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，證明原花青素可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性[18]。在本研究中，隨著攝入山楂提取物劑量的不同，大鼠T淋巴細(xì)胞亞群有相關(guān)變化，表現(xiàn)為與補(bǔ)充低劑量山楂提取物比較，補(bǔ)充高劑量可以使大鼠T淋巴細(xì)胞亞群占比提高，且CD4＋/CD8＋升高到接近常溫運(yùn)動(dòng)時(shí)的水平，說明山楂提取物對(duì)免疫紊亂下的大鼠有調(diào)節(jié)作用，有助于免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。

4" 參考文獻(xiàn)

[1] Presbitero A，Melnikov Valentin R，Krzhizhanovskaya Valeria V，et al.A unifying model to estimate the effect of heat stress in the human innate immunity during physical activities[J].Sci Rep，2021，11（1）：16688.

[2] 周京江.熱應(yīng)激及運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的影響及其機(jī)制的研究[D].北京：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院，2015.

[3] 史曉龍.金釵石斛等3種藥用植物的化學(xué)成分與免疫調(diào)節(jié)活性[D].昆明：云南大學(xué)，2021.

[4] Mehdadi Z，Hamdaoui M，Latreche A.Evaluation of parietal polysaccharides and polyphenols of crataegus monogyna jacq and valorization prospects[C].Kuala Lumpur，Malaysia： Int Inst Chem Biol Environ Eng，2015.

[5] Sareh H，Tulapurkar M E，Shah N G，et al.Response of mice to continuous 5-day passive hyperthermia resembles human heat acclimation[J].Cell Stress Chaperones，2011，16（3）：297-307.

[6] Poole D C，Copp S W，Colburn T D，et al.Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol.2020，318（5）：H1100-H1138.

[7] 魏偉，吳希美，李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：870-880.

[8] 黃欣欣.大果山楂黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化性和降血脂功能研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2016.

[9] 孫長顥.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)第8版[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2017：121-122.

[10] Yong-Mei T，Dao-Gang W，Jun L，et al.Relationships between micronutrient losses in sweat and blood pressure among heat-exposed steelworkers[J].Ind Health，2016，54（3）：215-223.

[11] Qiang F，Yan H，Bian L，et al.Organ index of immunological and anti-tumor effect of intratumor injection of penicillin sodium combined with chemotherapy drug for tumor-bearing mice.[J].J Clin Exp Oncol，2020（15）：34-38.

[12] 李小媛.高溫對(duì)多系統(tǒng)損傷的研究現(xiàn)況[J].職業(yè)與健康，2017，33（8）：1149-1152.

[13] Jafari M J，F(xiàn)arhang S，Pirposhteh E A，et al.Relationship between heat stress exposure and some immunological parameters among foundry workers[J].Int J Biometeorol，2020，64（5）：853-861.

[14] Li R，Luan F，Zhao Y，et al.Crataegus pinnatifida：A botanical，ethnopharmacological，phytochemical，and pharmacological overview[J].J Ethnopharmacol.2023.301：115819.

[15] Du K，Wang L，Wang Z，et al.Angelica sinensis polysaccharide antagonizes 5-Fluorouracil-induced spleen injury and dysfunction by suppressing oxidative stress and apoptosis[J].Biomed Pharmacother.2023，162（6）：114602.

[16] 劉玉蓉，敖長金，張艷梅，等.不同組分沙蔥黃酮對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國畜牧雜志，2023，59（02）：304-307，313.

[17] 陳小瓊，肖國強(qiáng).長期高溫預(yù)處理對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)后T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].體育學(xué)刊，2010，17（10）：109-112.

[18] Ying-zi L，Yong-guo C，Jun-qing Y，et al.Immunomodulatory effects of proanthocyanidin A-1 derived in vitro from Rhododendron spiciferum.Fitoterapia.2010，81（2）：108-114.

[2023-05-26收稿]