關(guān)鍵詞： 三嵌段聚合物；聚合物膠束；溫度/pH 雙重響應(yīng)；藥物控釋；自組裝；藥物遞送

中圖分類號： O648.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

隨著時代的發(fā)展，手術(shù)治療、化療、放療等治療癌癥的手段得到了越來越多的研究，并取得了一定的進(jìn)展[1]。然而，用于靜脈化療的藥物本身缺乏特異性，很難通過在病灶部位富集達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，且藥物易在正常的細(xì)胞及組織中積累，引起毒副作用。因此，研發(fā)具有生物特異性、相容性、低毒副作用、低耐藥性的藥物及治療手段迫在眉睫[2， 3]。

腫瘤組織細(xì)胞微環(huán)境與正常組織在溫度、pH、氧化還原性等方面存在較大差異。因腫瘤細(xì)胞過度增殖，靜脈回流系統(tǒng)未發(fā)育完全等原因，腫瘤組織的pH（5.0～6.5） 要低于正常生理條件（pH=7.4）[4]，腫瘤局部溫度（39～42 ℃） 要高于正常組織的溫度（37 ℃）[5]，腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH，2～10 mmol/L） 和活性氧（ROS，50～100 mmol/L） 的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織細(xì)胞中的濃度[6]。因此，研究者們在載藥體系中引入各種環(huán)境響應(yīng)性功能基團(tuán)或嵌段聚合物，通過溫度響應(yīng)[7， 8]、pH 響應(yīng)[9， 10]、氧化還原[6， 11， 12] 等實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)運(yùn)輸和可控釋放。Pu 等[13]制備了一種溫度/pH 雙重響應(yīng)的新型多功能納米顆粒，該納米顆粒以聚（N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸）（PNA） 為納米凝膠核，以具有光-熱轉(zhuǎn)換性能的聚多巴胺（PDA） 為膜，以葉酸（FA） 為主動靶向配體。PNA@PDA-FA 納米顆粒包載阿霉素（DOX），在生理條件下泄漏量低，且在酸性和高溫條件下能快速釋放以完成有效治療。Xiong 等[14] 設(shè)計和合成了一種pH/GSH 雙重響應(yīng)的兩親性聚合物—聚（己內(nèi)酯）-SS-聚（2-（二甲基氨基） 乙基甲基丙烯酸酯）（PCL-SS-PDMAEMA），該聚合物可自組裝形成膠束來包載DOX 和金納米顆粒，用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物控制釋放。另外，該聚合物膠束的體外CT 成像性能優(yōu)于常規(guī)造影劑，可作為腫瘤成像和診斷的工具。

聚合物膠束由兩親性嵌段聚合物自組裝形成，由于其尺寸設(shè)計靈活可變且結(jié)構(gòu)體系易于功能化而被廣泛研究將其作為抗腫瘤藥物的載體[15]。聚合物膠束可以通過修飾特定基團(tuán)來提高與靶向配體的特異性結(jié)合，嫁接環(huán)境響應(yīng)型嵌段聚合物實(shí)現(xiàn)藥物可控釋放[16]，其疏水內(nèi)核還可以提升疏水性藥物（例如喜樹堿、多西紫杉醇、紫杉醇等）的載藥率，從而提高此類藥物的生物利用度[17-19]。

本課題組利用聚甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯（PDPA） 研制了脂質(zhì)體[20， 21]、微凝膠[21， 22]、核-殼結(jié)構(gòu)納米顆粒[23， 24] 等pH 響應(yīng)型藥物載體。Hao 等[20] 將含PDPA 的兩親性聚合物插入脂質(zhì)體，獲得了具有pH“開關(guān)”效應(yīng)的脂質(zhì)體；Lei 等[22] 將PDPA 與聚乙烯亞胺（PEI） 連接獲得二嵌段聚合物，引入二硫鍵作為PEI 層交聯(lián)劑，構(gòu)建的微凝膠體系具有pH/還原雙響應(yīng)刺激協(xié)同效應(yīng)。這類藥物載體對于DOX 的腫瘤細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、pH 刺激釋放有明顯的促進(jìn)作用。然而，關(guān)于疏水性較強(qiáng)藥物的有效包封和釋放研究還比較少。

本文設(shè)計合成了三嵌段ABC 聚合物聚乙二醇單甲醚-聚甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯-聚（丙烯酰胺-co-丙烯腈）（mPEG-PDPA-P（AAm-co-AN）），其中丙烯酰胺（AAm） 和丙烯腈（AN） 通過無規(guī)共聚賦予該聚合物較高的臨界溶解溫度（UCST），和PDPA 共同構(gòu)建環(huán)境刺激響應(yīng)性多層疏水核，有望提升對疏水性藥物的包封率，獲得溫度和pH 可控的多形態(tài)自組裝體，其在不同環(huán)境下的自組裝結(jié)構(gòu)如圖1 所示。本文通過研究聚合物自組裝體的粒徑、電位和形貌對環(huán)境條件的響應(yīng)性，以及親水性藥物DOX 和疏水性藥物槲皮素的體外模擬釋藥行為，探究了環(huán)境溫度和pH 刺激響應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

甲基丙烯酸二異丙胺基乙酯（DPA，其中的阻聚劑用固定相為48～74 μm 堿性氧化鋁的吸附柱來去除）、五甲基二乙烯三胺（PMDETA）：分析純，上海百靈威科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、溴化亞銅（CuBr）、二氯甲烷（DCM）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮：分析純，上海泰坦試劑有限公司；丙烯酰胺（AAm）、丙烯腈（AN，用堿性氧化鋁層析柱去除阻聚劑）、聚乙二醇單甲醚（mPEG；M_n=2.0×10³）、溴代異丁酰溴（BiBB）、中性氧化鋁（100～200 μm）：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN）、乙基黃原酸鉀、三乙胺（TEA）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器

動態(tài)光散射儀（DLS）：英國Malvern 儀器公司Nano ZS 型；紫外-可見分光光度計：日本島津公司UV-2450型；熒光分光光度計：美國PerkinElmer 公司LS55 型；傅里葉紅外光譜儀：美國尼高力公司Nicolet 6700 型；核磁共振光譜儀：瑞士Bruker 公司AVANCE Ⅲ 400 型；高效凝膠滲透色譜儀：美國Waters 公司W(wǎng)aters1515型；元素分析儀：德國Elementare 公司VARIO ELⅢ型；透射電子顯微鏡：日本JEOL 公司JEM-1400 型。

1.3 mPEG-PDPA_k-P（AAmm-co-AN_n） 的合成

mPEG-PDPA_k-P（AAmm-co-AN_n） 的合成路線如圖2 所示，具體步驟如下。

1.3.1 mPEG-PDPA_k-Br 的合成 將mPEG 溶于超干DCM 中，加入三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH，在冰水浴磁力攪拌下，逐滴滴加溴代異丁酰溴，在常溫下反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾旋蒸，用乙醚沉降3 次，離心，真空干燥得到白色固體mPEG-Br，4 ℃ 冰箱中冷凍避光保存。

通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（ATRP） 合成目標(biāo)產(chǎn)物。將引發(fā)劑mPEG-Br、配體PMDETA、單體DPA 和超干溶劑DCM 加入到干燥的史萊克燒瓶中，通過3 次冷凍-脫氣-通氮?dú)?解凍循環(huán)處理，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入催化劑CuBr。在室溫條件下，反應(yīng)攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用固定相為中性氧化鋁的吸附柱來除去溴化銅。通過旋蒸、沉降除去溶劑和未反應(yīng)的單體。真空干燥，得到無色透明的黏稠液體mPEG-PDPAk-Br。

1.3.2 鏈轉(zhuǎn)移劑（macro RAFT，mPEG-PDPA_k-S₂OC₃H₅） 的合成 將mPEG-PDPA_k-Br 和乙基黃原酸鉀溶于超干溶劑丙酮中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量為3 500 的透析袋透析，除去未反應(yīng)的乙基黃原酸鉀和溶劑，冷凍干燥得淡黃色固體macro RAFT 試劑。

1.3.3 mPEG-PDPA_k-P（AAmm-co-AN_n） 的合成 通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法（RAFT） 來制備聚合物。將鏈轉(zhuǎn)移劑macro RAFT 試劑、單體AAm、單體AN、引發(fā)劑AIBN 以及超干溶劑DMSO 和DMF 加入史萊克燒瓶中，通過3 次循環(huán)處理后，在80 ℃ 的油浴鍋中反應(yīng)攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，通過沉降和透析除去單體和溶劑，冷凍干燥得白色固體mPEG-PDPA_k-P（AAmm-co-AN_n），其中原料AAm、AN、macro RAFT、AIBN 的物質(zhì)的量之比為m∶n∶1∶0.25。

1.4 臨界膠束濃度（CMC） 測定

將芘溶于丙酮中，加入1 mmol/L、pH 7.4 的磷酸鹽（PBS） 緩沖液，在恒溫箱中攪拌48 h，通過揮發(fā)除去丙酮，配制成1×10^-7 mol/L 的芘溶液。將聚合物溶于DMSO 中，在高速攪拌下滴加濃度為1 mmol/L、pH 7.4 的PBS 緩沖液，透析除去DMSO，固定聚合物溶液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，并用上述芘溶液將其稀釋成不同的質(zhì)量濃度。以334 nm 為激發(fā)波長，用熒光分光光度計檢測不同質(zhì)量濃度聚合物的芘溶液在372 nm 和383 nm的熒光強(qiáng)度。以聚合物質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以372 nm 和383 nm 處熒光強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)，其突變值即為該聚合物的CMC。

1.5 mPEG-PDPAk-P（AAmm-co-ANn） 的pH 響應(yīng)性和溫度響應(yīng)性測定

取聚合物mPEG-PDPA_k-Br 置于螺口瓶中，加入1 mL 四氫呋喃溶液，溶解后通過旋蒸使溶劑完全揮發(fā)，聚合物黏附在容器底部。加入稀鹽酸，超聲溶解，使聚合物完全溶解到溶液中。緩慢加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液配制成1 mg/mL，pH 約為10 的聚合物溶液。用紫外-可見分光光度計測量溶液在不同pH 下的透射率，其透射率下降的最大值為該聚合物的pH 敏感點(diǎn)。

將聚合物mPEG-PDPA_k-P（AAm_m-co-AN_n） 溶于稀鹽酸，超聲后配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液（pH=3），通過UV-2450 檢測聚合物在不同溫度下的透光率來考察聚合物的溫度響應(yīng)性能，透光率上升幅度最大處即為該聚合物的溫度敏感點(diǎn)（UCST）。在不同溫度（30、40、50 ℃） 下檢測聚合物的pH 敏感點(diǎn)。

1.6 聚合物膠束的制備以及藥物釋放的研究

聚合物膠束的制備：將聚合物溶解在DMSO 中配制成5 mg/mL 的聚合物溶液，取2 mL 于干凈的螺口瓶中，在高速攪拌下逐滴滴加8 mL 濃度為1 mmol/L、pH 7.4 的PBS 緩沖液，透析48 h 除去DMSO。

載藥膠束的制備：載藥膠束的制備方法與聚合物膠束的制備方法大致相同。向聚合物的DMSO 溶液中加入8 mg DOX，在高速攪拌下加入三乙胺，滴加8 mL 濃度為1 mmol/L、pH 7.4 的PBS 緩沖液，攪拌3 h 后轉(zhuǎn)移到透析袋中透析，除去DMSO 和未包載的DOX。用UV-2450 測定溶液在485 nm 處的吸光度，根據(jù)式（1，2），計算得到DOX的載藥量（C_DL） 和包封率（E_DL）。

式（1，2）中，m（Drug）、m（Micelles）、m（Feed）分別為膠束中載藥的質(zhì)量、膠束質(zhì)量、給藥質(zhì)量。

在DOX 藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，取6 份2 mL 載藥膠束于透析袋中，將透析袋置于50 mL 離心管內(nèi)，并加入20 mL、pH 分別為5.0 和7.4 的PBS 緩沖液，將其分別放在37 ℃ 和45 ℃ 的恒溫震蕩箱中震蕩。每小時從離心管取出一定量的溶液，采用UV-2450 檢測溶液在波長為485 nm 處的最大吸收值，計算DOX 在不同時間段的累積釋放率（ η）。

式（3） 中，A_m 為藥物在不同時間下的紫外吸光度；A_n 為膠束被完全瓦解，藥物完全釋放時的紫外吸光度。

載槲皮素膠束的制備：在聚合物的DMSO 溶液中加入8 mg 槲皮素，用恒流泵緩慢滴加含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8% 的吐溫80 的PBS 緩沖液，透析除去溶劑和未包載的槲皮素。根據(jù)式（1，2），計算得載槲皮素膠束對槲皮素的CDL 和EDL。取6 份1 mL 的載槲皮素膠束于透析袋中，并依次加入15 mL、pH 分別為5.0 和7.4 的PBS緩沖液（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8% 的吐溫80），將其放置到37 ℃ 和45 ℃ 的恒溫震蕩箱震蕩，每小時從離心管取出3 mL PBS 緩沖液，通過UV-2450 檢測溶液在波長為373 nm 處的最大吸收值，根據(jù)式（3） 計算其累積釋放率。

2 結(jié)果與討論

2.1 mPEG-PDPA_k-P（AAm_m-co-AN_n） 的結(jié)構(gòu)表征

通過取代反應(yīng)得到mPEG-Br，將其作為引發(fā)劑，通過ATRP 反應(yīng)合成不同嵌段的聚合物mPEG-PDPA_k-Br。mPEG-PDPA_k-Br 的1H-NMR 譜圖如圖3（a） 所示?；瘜W(xué)位移1.0 處為PDPA 側(cè)鏈末端甲基質(zhì)子峰，1.7～2.0 處為PDPA 主鏈亞甲基氫峰，2.5～2.7 處為PDPA 側(cè)鏈亞甲基氫峰（H，_―N_―CH_2―），2.9～3.1 處為PDPA 側(cè)鏈次甲基氫峰（H， _― N_― CH_― ）， 3.6～ 3.8 處為mPEG 主鏈亞甲基氫峰， 3.9 處為PDPA 側(cè)鏈亞甲基氫峰（H，_―O_―CH2_―）。1H-NMR 結(jié)果說明通過ATRP 法成功合成了聚合物mPEG-PDPA_k-Br。通過核磁峰面積計算可得聚合物數(shù)均分子量為7.6×10³，通過GPC 檢測可得其數(shù)均分子量為8.1×10³，多分散性指數(shù)（PDI） 為1.13，由此可以計算得到聚合度k 約為30，且分子量分布較均勻。

AAm 為強(qiáng)親水性單體，所選溶劑均為高沸點(diǎn)溶劑，無法用層析柱分離的方法除去催化劑，所以不適合用ATRP 反應(yīng)合成，故采用黃原酸酯調(diào)控的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合（RAFT/MADIX）方法合成了macroRAFT 試劑。對macro RAFT 試劑進(jìn)行元素分析，N、C、H、S 元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.95%、63.31%、9.59%、0.33%，證明含二硫代的鏈轉(zhuǎn)移劑成功合成。圖3（b） 為聚合物mPEG-PDPAk-P（AAmm-co-ANn） 的核磁共振氫譜。化學(xué)位移6.7～7.7 處為AAm 支鏈胺基質(zhì)子峰，1.2 處為PDPA 側(cè)鏈末端甲基氫峰，3.8 處對應(yīng)mPEG 主鏈亞甲基氫峰，1.3～2.0 處為聚合物主鏈亞甲基質(zhì)子峰，2.0～2.6 處和2.4～3.4 處分別為AAm 和AN 主鏈次甲基氫峰，證明聚合物已成功合成。

圖4 為聚合物的FT-IR 譜圖。mPEG-Br 在1 740 cm?1 處出現(xiàn)碳氧雙鍵伸縮振動峰，說明引發(fā)劑mPEG 的成功制備。mPEG-PDPA_k-P（AAm_m-co-AN_n） 在2 240 cm^?1處出現(xiàn)屬于AN 的碳氮三鍵伸縮振動峰，在3 450 cm^?1處出現(xiàn)屬于AAm 的N_―H 鍵的伸縮振動峰，進(jìn)一步證明了聚合物mPEG-PDPA_k-P（AAm_m-co-AN_n） 的成功制備。

2.2 mPEG-PDPA_k-P（AAm_m-co-AN_n） 的物性探究

利用RAFT 法合成的聚合物P1～P4 的性質(zhì)如表1 所示。CMC 是聚合物在水溶液中自組裝形成膠束的最低濃度，是判定膠束穩(wěn)定性的重要因素。P1～P4 的CMC 為0.12～5.24 mg/L，可以確保在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中膠束的穩(wěn)定形成。

圖5（a） 為聚合物P1 在不同溫度、不同質(zhì)量濃度下的透射率曲線。聚合物溶液在低溫時透射率較?。ㄐ∮?0%），隨著溫度升高到UCST 以上時，透射率隨之增加（大于80%）。這是因?yàn)樵诘蜏貤l件下，聚合物鏈與鏈之間易形成分子內(nèi)氫鍵（C=O…H_―N），隨著溫度的升高，分子內(nèi)氫鍵斷裂，聚合物鏈易與水分子形成分子間氫鍵，由疏水狀態(tài)轉(zhuǎn)為親水狀態(tài)，從而透射率增加。這說明該聚合物具有溫度響應(yīng)特性。當(dāng)聚合物溶液的質(zhì)量濃度分別為3.0、1.0、0.5、0.3 mg/mL 時，所對應(yīng)的UCST 分別為33、24、22、16 ℃。隨著聚合物質(zhì)量濃度的降低，聚合物的UCST 逐步減小，表明其相分離溫度具有濃度依賴性，且隨著聚合物質(zhì)量濃度的降低，透射率的變化由急劇變?yōu)橄鄬ζ骄彛琔CST 轉(zhuǎn)變的溫度范圍變寬。這是因?yàn)榫酆衔锏馁|(zhì)量濃度過低，聚合物鏈與鏈之間形成氫鍵的可能性降低，更易與水分子形成氫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致聚合物的UCST 降低。

固定聚合物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，聚合物P1～P4 在不同溫度下的透射率曲線如圖5（b） 所示。P1～P4均具有溫度響應(yīng)性，P4 的溫度轉(zhuǎn)變范圍較寬，溫度響應(yīng)靈敏性較差。P1～P4 的UCST 分別為24、50、44、31 ℃。P2、P3、P4 的UCST 高于P1，推測是因?yàn)镻2、P3、P4 中單體AN 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%）比P1 中AN 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（25%）高。PAAm 溶于水，疏水性單體AN 的引入，使其周圍的水分子之間氫鍵作用力增強(qiáng)，對溶解熵（ΔS） 產(chǎn)生負(fù)影響，從而使UCST 增大[25]。由此可見，單體的比例、聚合物的質(zhì)量濃度均會對聚合物的UCST 產(chǎn)生影響。聚合物P3 的溫度敏感點(diǎn)為40～45 ℃，略高于人體溫度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇P3 作為研究對象。

在室溫條件下，根據(jù)不同pH 下的透射率變化來探究聚合物的pH 響應(yīng)性。由圖6（a） 可知，在pH 較低的條件下，因PDPA 上的N 原子含有孤對電子，易通過配位鍵與水中的氫離子發(fā)生質(zhì)子化，此時PDPA 是溶于水的，透射率較高。在中性和堿性條件下，PDPA 會發(fā)生去質(zhì)子化，由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷裕干渎鼠E降。從圖6（a） 看出mPEG-PDPA_k-Br 的pH 敏感點(diǎn)為6.53。圖6（b） 為聚合物P3 在不同溫度下透射率隨pH 變化的曲線。雖然溫度改變，聚合物溶液的透射率會發(fā)生變化，但其pH 敏感點(diǎn)均為6.53，不受溫度的影響，且與mPEGPDPA_k-Br 的pH 敏感點(diǎn)相吻合，說明溫敏嵌段P（AAm-co-AN） 的銜接不會對pH 敏感點(diǎn)產(chǎn)生明顯的影響。

2.3 聚合物膠束自組裝體的性質(zhì)

聚合物P3 膠束的粒徑和PDI 如圖7 及表2 所示。聚合物P3 在室溫、中性環(huán)境下自組裝成以PDPA 和P（AAm-co-AN） 為疏水核、mPEG 為親水殼結(jié)構(gòu)的膠束，粒徑約為135 nm。隨著外界溫度的升高，聚合物溶液的粒徑和PDI 均下降，粒徑分布圖由原來的多強(qiáng)度分布峰轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏澹▓D7（a）），這是因?yàn)镻（AAm-co-AN） 嵌段的氫鍵作用，隨著溫度的增加發(fā)生了疏水到親水的轉(zhuǎn)變。三嵌段聚合物由原來親-疏-疏狀態(tài)變?yōu)橛H-疏-親狀態(tài)，推測聚合物結(jié)構(gòu)由原來的核-殼膠束結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榻浦锌盏牟粚ΨQ囊泡結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)變得更加緊密。隨著pH 減小，膠束的粒徑明顯增大并出現(xiàn)多種分布峰（圖7（b））。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，此時的pH 小于聚合物的pH 敏感點(diǎn)，PDPA 因質(zhì)子化，由疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，導(dǎo)致PDPA 層發(fā)生溶脹。此外，推測聚合物P（AAmco-AN） 嵌段中酰胺基酸性水解作用也會對粒徑產(chǎn)生影響。PDI 也隨著pH 的降低有了明顯的增大，說明分散度增加，均勻性和穩(wěn)定性下降。

聚合物膠束在不同環(huán)境下的電位變化如表3 所示。當(dāng)pH 一定時，溫度上升，膠束的電位略微下降；當(dāng)溫度一定時，pH 降低，膠束的Zeta 電位略有增加，這是因?yàn)榍抖蜳DPA 的質(zhì)子化以及膠束最外層mPEG 嵌段的屏蔽作用，使聚合物膠束表面電位上升，但上升幅度不大。

為了進(jìn)一步探究其自組裝結(jié)構(gòu)變化，用TEM 觀察了不同環(huán)境下聚合物膠束的形貌，結(jié)果如圖8 所示。在37 ℃、pH 7.4 條件下聚合物形成了粒徑為130 nm 左右、均勻的球形膠束（圖8（a））；隨著溫度的升高，原來的膠束變?yōu)橹胁客该鞯哪遗轄罱Y(jié)構(gòu)，證明聚合物結(jié)構(gòu)向不對稱囊泡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變（圖8（b））。在37 ℃、pH 5.0 條件下（圖8（c）），膠束的粒徑明顯增大，但仍然保持球形結(jié)構(gòu)，與DLS 檢測的結(jié)果相符。在45 ℃、pH 5.0 環(huán)境下（圖8（d）），聚合物不再保持均勻的球體，膠束呈不規(guī)則的形狀，而且粒徑很大，表明膠束由于聚合物分子整體變成親水而充分溶脹舒展，從粒徑和TEM 結(jié)果可以證實(shí)其膠束結(jié)構(gòu)沒有完全瓦解，推測P（AAm-co-AN） 嵌段之間仍然存在分子內(nèi)氫鍵相互作用[26]，聚合物并沒有完全變成游離的分子。

2.4 聚合物膠束的釋藥情況

P3 的UCST 比較適合用于藥物載體研究，首先將DOX 作為模擬藥物進(jìn)行釋藥行為研究，結(jié)果如圖9（a）所示。為了盡可能地對藥物進(jìn)行包載，加入三乙胺去鹽酸化，親水性藥物轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷运幬?，可與聚合物膠束的疏水部分發(fā)生疏水締合。聚合物膠束包載DOX 的C_DL 與E_DL 分別為12.66% 與43.94%。從圖9（a） 可知，在37 ℃，pH 7.4 條件下，膠束的累積釋放率只有20%，當(dāng)溫度升高至45 ℃，其累積釋放率為30%。在pH 5.0條件下，溫度為37 ℃ 和45 ℃ 時膠束的累積釋放率分別為66%、77%，表明在釋藥過程中pH 的敏感性高于溫度敏感性，為此可以推測藥物可能更多地包裹在PDPA 層了。

本文考察了聚合物膠束對不同環(huán)境刺激的應(yīng)變能力，DOX 的階梯型釋藥結(jié)果如圖9（b） 所示。在37 ℃，pH 7.4 條件下，5 h 時膠束的累積釋放率達(dá)到20%，已經(jīng)趨于平穩(wěn)，將溶液調(diào)節(jié)為pH 5.0 的環(huán)境，發(fā)現(xiàn)累積釋放率又有增長現(xiàn)象，10 h 時膠束的累積釋放率達(dá)到42%，證明該膠束對pH 極其敏感。然后，將溫度提升至45 ℃，膠束的累積釋放率再次提升，最終的累積釋放率達(dá)74%，同膠束始終在45 ℃、pH 5.0 條件下（圖9（a） 中藍(lán)色曲線） 的累積釋放率基本一致，說明在此條件下，聚合物整體變?yōu)橛H水結(jié)構(gòu)，膠束不斷溶脹促使藥物釋放，證實(shí)聚合物膠束具有良好的控制釋放的功能并且能快速響應(yīng)環(huán)境條件的改變。

本文還選擇了疏水性較強(qiáng)的槲皮素作為模擬藥物進(jìn)行研究。槲皮素作為具有抗癌特性的疏水性藥物，因其溶解性差、生物利用度低在臨床應(yīng)用上具有局限性。同時，槲皮素由于本身的不穩(wěn)定性，其在水溶液中的UV-2450 檢測信號會發(fā)生一定的衰減[27]。因此，在釋藥過程中采取了每12 h 更新一次透析液的辦法來完成釋藥實(shí)驗(yàn)。聚合物膠束包載槲皮素的CDL 與EDL 分別為27.82% 與62.83%。與DOX 相比，膠束的載藥量有所增加，這是因?yàn)殚纹に厥杷愿鼜?qiáng)，易與膠束形成疏水締合導(dǎo)致的。

圖10 是負(fù)載槲皮素膠束的釋藥結(jié)果。在溫度為37 ℃、pH 為7.4 與5.0 時，載藥膠束的累積釋放率分別為54% 與74%；當(dāng)溫度為45 ℃ 時，膠束在pH 5.0 條件下的累積釋放率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pH 7.4 條件下的累積釋放率，說明該膠束具有一定的pH 響應(yīng)性。另外，在pH 5.0 條件下，45 ℃ 時膠束的累積釋放率高于37 ℃ 時膠束的累積釋放率，而pH 7.4 的情況正好相反。通過不同條件下槲皮素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素在pH 7.4、較高溫度（45 ℃） 時容易分解，從而造成檢測到的累積釋放率低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，槲皮素可能不太適用于溫度敏感載體的研究，或者需要更頻繁地更換釋放環(huán)境溶液。

綜合以上釋藥結(jié)果，本文所制備的聚合物膠束作為藥物載體具有pH 和溫度雙重敏感性，可用于環(huán)境條件可控藥物的遞送研究。多階段釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該載體環(huán)境刺激響應(yīng)性能較好，有望用于兩種藥物的同時包裹，即在PDPA 層和P（AAm-co-AN） 層分別包載不同的藥物，通過環(huán)境條件控制實(shí)現(xiàn)藥物的先后釋放。

3 結(jié)論

（1） 利用ATRP 和RAFT 法合成了溫度/pH 雙重敏感的三嵌段聚合物mPEG-PDPA-P（AAm-co-AN），其UCST 可以通過調(diào)整單體比例來調(diào)節(jié)。選擇了溫度敏感點(diǎn)為44 ℃、pH 敏感點(diǎn)為6.53 的聚合物通過自組裝形成膠束用于載藥、釋藥研究。

（2） 在室溫、中性環(huán)境下，聚合物自組裝成以PDPA 和P（AAm-co-AN） 為核、以mPEG 為殼的膠束。溫度升高，由核-殼膠束轉(zhuǎn)變?yōu)椴粚ΨQ囊泡結(jié)構(gòu)。

（3） 聚合物膠束作為載體對小分子藥物DOX 和槲皮素均有較好的載藥和包封效果，體外釋藥實(shí)驗(yàn)說明該載體具有良好的環(huán)境刺激感知能力和藥物控釋功能。