關(guān)鍵詞： 血管組織工程；左旋聚乳酸；透明質(zhì)酸；電紡取向纖維；平滑肌細胞；細胞遷移

中圖分類號： R318.08 文獻標志碼： A

目前血管疾病是世界上造成人類死亡的主要疾病之一。原位血管組織工程是未來治愈血管疾病最有前景的方法之一 [1， 2]。理想的原位組織工程血管支架應(yīng)具有募集宿主血管細胞、誘導(dǎo)宿主細胞遷移至支架上，以及調(diào)控細胞增殖、分化和基質(zhì)分泌等行為的能力[3]。其中，誘導(dǎo)細胞在支架上遷移和增殖，使支架快速細胞化的能力尤為重要。當血管支架生物活性差、引導(dǎo)細胞遷移能力弱時，將無法快速誘導(dǎo)宿主細胞向支架遷移和實施細胞功能、調(diào)控血管再生[4]。如何增強支架誘導(dǎo)血管細胞如血管平滑肌細胞（vSMCs）的遷移能力是血管組織工程支架設(shè)計要考慮的一個重要因素。

電紡絲因可制備仿生天然細胞外基質(zhì)（ECM）中的超細纖維結(jié)構(gòu)而被廣泛用于血管支架的構(gòu)建。當將電紡纖維制備成平行排列結(jié)構(gòu)時，可有效誘導(dǎo)vSMCs 定向生長形成仿生天然血管平滑肌層的取向細胞形態(tài)[5]。目前，因可降解聚酯類材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和可控的力學(xué)性能，可降解聚酯類材料如左旋聚乳酸（PLLA）被電紡成高度取向的超細纖維用于血管組織工程[6]，且已證實其可調(diào)控血管細胞形態(tài)及細胞分泌的ECM 定向排列，并誘導(dǎo)vSMCs 向健康收縮表型分化[7]。然而，由于合成聚合物疏水性強且缺乏細胞識別位點等固有特性，使得PLLA 取向纖維生物活性差、引導(dǎo)細胞遷移能力弱，從而一定程度上影響了PLLA 等合成聚合物在血管組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用[8]。為改善該問題，采用天然生物活性成分對其表面進行功能修飾已被證實是比較有效的改進策略。孟慶圓等[9] 在PLLA 納米纖維中混合卵磷脂材料來提高支架的生物相容性；Kang 等[10] 將血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）共價固定在PLLA 支架上，增強了PLLA 支架的血管內(nèi)皮化以及血液相容性。

透明質(zhì)酸（HA）作為ECM 中的重要黏多糖成分，已被證實在調(diào)節(jié)細胞遷移方面扮演著重要角色。通過與細胞表面受體（CD44）和細胞游走受體（RHAMM）的結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞黏附、增殖和遷移行為[11-15]。本課題組前期通過穩(wěn)定射流同軸電紡絲法（SJCES）成功將HA 涂覆到PLLA 取向纖維表面，并證實HA 功能修飾PLLA 取向纖維（HA-PLLA）顯著促進了vSMCs 的定向排列和功能表達，但對vSMCs 的遷移行為尚未探究[7]。本文重點分析HA-PLLA 取向纖維誘導(dǎo)vSMCs 遷移的功效，即先驗證HA 促進vSMCs 遷移的能力；然后對HA-PLLA 取向纖維形貌、結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能等進行表征；最后研究HA-PLLA 取向纖維引導(dǎo)vSMCs 遷移的功效。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

PLLA：Mw = 1×10⁵，濟南岱罡生物工程有限公司； HA：M_w ≥ 4×10⁵，華熙福瑞達生物公司；聚環(huán)氧乙烷（PEO）：M_wgt; 5×10⁶，美國Alfa Aesar 公司；三氟乙醇（TFE）：分析純，美國Sigma-Aldrich 公司；氫氧化鈉（NaOH）、戊二醛、乙酸、丙酮、多聚甲醛、Triton X-100：國藥集團化學(xué)試劑公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染料（DAPI）：瑞士羅氏生物技術(shù)公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）：上海迪申生物技術(shù)有限公司；DMEM-F12 培養(yǎng)基：杭州基諾公司；胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素（P/S）：美國Gibco 公司；CCK-8 試劑：日本同仁化學(xué)試劑有限公司；vSMCs：上海市第九人民醫(yī)院。

Multiskan MK3 型酶標儀：美國ThermoFisher Scientific 公司；Nikon 80i 型倒置熒光顯微鏡：日本Nikon 公司；TXR1020 N30-30 型高壓電源：大連泰思曼科技有限公司；KDS-100 型微量注射泵：美國KD Scientific 公司；TM-1000 型掃描電子顯微鏡（SEM）：日本Hitachi 公司；JEM-2100 型透射電子顯微鏡（TEM）：日本JEOL 公司；NEXUS-670 型紅外光譜儀（FT-IR）：美國Nicolet 公司；D/MAX-2550 PC 型X 射線衍射儀（XRD）：日本Rigaku公司；Instron-3343 型萬能材料測試機：美國Norwood 公司。

1.2 HA 促進vSMCs 遷移的能力

1.2.1 血清濃度（FBS 的體積分數(shù)，φ（FBS））對vSMCs 黏附和增殖的影響 為排除細胞增殖對細胞遷移行為的影響，絲裂霉素和饑餓處理（即無血清培養(yǎng)）是目前抑制細胞增殖的常用方法[16]?？紤]到絲裂霉素會損害細胞功能，本研究選用無血清培養(yǎng)方式觀察HA 對vSMCs 遷移行為的影響。本研究配制含不同（FBS）（0、5%、10%、20%）的DMEM-F12 培養(yǎng)基（固定P/S 的體積分數(shù)為1%）對vSMCs 進行培養(yǎng)，觀察vSMCs 的黏附和增殖情況。

細胞黏附：將vSMCs（每孔2×10⁵ 個）種植在6 孔板上，當培養(yǎng)至2、4、8 h 時，采用倒置熒光顯微鏡觀察vSMCs 的貼壁黏附情況，并對細胞黏附數(shù)量和鋪展面積進行分析。

細胞增殖：將vSMCs（每孔2×10⁴ 個）種植在24 孔板上，當培養(yǎng)至1、2、4 d 時，每孔加入20 μL 的CCK-8試劑后在37 ℃ 下避光孵育4 h，取出200 μL 反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96 孔板，采用酶標儀測定樣品在450 nm 處的吸光值。 1.2.2 HA 質(zhì)量濃度對vSMCs 遷移的影響 配制不同HA 質(zhì)量濃度（（HA），0、0.2 mg/mL 和2 mg/mL）的無血清培養(yǎng)基對vSMCs 進行培養(yǎng)，采用常用的細胞“傷口”愈合實驗（劃痕實驗）[17] 研究HA 質(zhì)量濃度對vSMCs 遷移的影響。

將vSMCs（每孔2×10⁴ 個）種植在24 孔板上，當培養(yǎng)至6、12、24 h 時，采用CCK-8 試劑檢測細胞的增殖情況，方法同1.2.1 節(jié)。

將vSMCs（每孔5×10⁵ 個）種植在6 孔板上，當培養(yǎng)24 h 形成細胞層時，用不含HA 的無血清培養(yǎng)基對細胞進行饑餓處理過夜，再利用槍頭在匯合成片的單層細胞上劃一道無細胞“傷口”，經(jīng)PBS 洗滌后分別加入不同HA 質(zhì)量濃度的無血清培養(yǎng)基，并在0、12、24 h 等不同時間點采用倒置熒光顯微鏡觀察“傷口”愈合情況，采用Image J 軟件定量分析“傷口”寬度和vSMCs 的平均遷移速率。

1.3 HA-PLLA 取向纖維的制備與表征

1.3.1 HA-PLLA 取向纖維的制備 首先，稱取適量PLLA 和PEO（m（PLLA）/m（PEO）=4）溶解于三氟乙醇，攪拌得到溶質(zhì)質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 的芯層紡絲液；稱取適量 HA 溶于由0.5 mol/L 的NaOH 水溶液和TFE 組成的混和溶劑（質(zhì)量比為4∶1）中，攪拌得到HA 質(zhì)量濃度為0.02 g/mL 的殼層紡絲液。然后，將兩種紡絲液裝入SJCES 裝置后按如下參數(shù)紡絲：電壓8 kV，滾筒直徑10 cm，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，接收距離 25 cm，芯、殼層注射速率分別為0.5 mL/h 和0.1 mL/h，環(huán)境濕度為40%～60%，環(huán)境溫度為18～25 ℃。同時，按相同紡絲參數(shù)制備純PLLA 取向纖維（注射速率0.5 mL/h）作為對照。最后，采用含0.1 mol/L 戊二醛和0.01 mol/L 乙酸的丙酮水溶液（丙酮與水的體積比為8∶2）對HA-PLLA 取向纖維的HA 涂層進行交聯(lián)處理24 h [7]。

1.3.2 HA-PLLA 取向纖維表面的表征 利用SEM 觀察PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的表面形貌，并用Image J軟件分析纖維直徑大??；利用TEM 觀察HA-PLLA 取向纖維的殼-芯結(jié)構(gòu)；采用FT-IR 檢測PLLA、交聯(lián)后的HA-PLLA、水處理后HA-PLLA 纖維（未交聯(lián)）和純HA 粉末的光譜圖，通過基團特征峰的變化分析HA 是否成功涂覆和交聯(lián)，掃描范圍2 000～1 200 cm?1。

1.3.3 HA-PLLA 取向纖維的力學(xué)性能及其分子取向度測試 使用萬能材料力學(xué)測試儀對PLLA 和HA-PLLA取向纖維膜進行拉伸力學(xué)測試，拉伸速率為20 mm/min，每組測試數(shù)量為8 個，根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線分析纖維膜的楊氏模量、斷裂強度和斷裂應(yīng)變等力學(xué)性能。

利用偏振FT-IR 檢測PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的分子取向度，檢測轉(zhuǎn)動偏振片在0°和90°時纖維的紅外吸收譜圖，算出特征譜帶C=O 和C_―O_―C 平行（//）吸收圖譜的峰面積（A_//）和垂直（⊥）吸收圖譜的峰面積（A⊥），A_///A_⊥即為二向色性比值（D_r）。利用X 射線衍射儀分析PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的微晶取向度，得到平行于0°和90°方位角的樣品光譜。

1.4 HA-PLLA 取向纖維促進vSMCs 遷移的檢測

1.4.1 無菌材料的準備和細胞培養(yǎng) 將PLLA 和HA-PLLA 取向纖維膜剪成相同大小包裹在無菌玻片（直徑為15 mm）上，放入 24 孔板后先紫外光照射6 h、再用體積分數(shù)為75% 的乙醇浸泡2 h 進行材料滅菌處理；經(jīng)PBS 清洗后加入新鮮細胞培養(yǎng)液孵育過夜進行預(yù)培養(yǎng)；再根據(jù)實驗要求將vSMCs 種植到纖維支架上，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.4.2 細胞在HA-PLLA 取向纖維上的遷移能力檢測[16] 首先，將取向纖維膜包覆在玻片上置入24 孔板，放置中間帶有橫杠的特制鋼環(huán)將纖維膜表面分隔成2 個區(qū)域，再將vSMCs（每孔2×10⁵ 個）種植到被鋼環(huán)固壓的材料上無血清培養(yǎng)24 h 形成細胞層。隨后，小心移除鋼環(huán)得到類似劃痕實驗的無細胞“傷口”，以此刻記為細胞遷移的起始時間，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后采用DAPI 對細胞核進行染色，分析細胞遷移狀態(tài)。染色步驟如下：PBS 清洗細胞后加入多聚甲醛溶液（體積分數(shù)為4%）固定細胞10 min；吸棄多聚甲醛，經(jīng)PBS 清洗后加入Triton X-100（體積分數(shù)為0.1%）通透細胞10 min；吸棄通透液，經(jīng)PBS 清洗后加入1 μg/mL 的DAPI 染色液避光孵育10 min。最后，經(jīng)PBS 清洗后用倒置熒光顯微鏡觀察vSMCs 的遷移情況，采用Image J 軟件對細胞的“傷口”大小和細胞平均遷移速率進行統(tǒng)計分析。

1.4.3 細胞在HA-PLLA 取向纖維上的增殖能力檢測 首先以每孔2×10⁴ 個的細胞密度將vSMCs 種植到材料上；培養(yǎng)1、3、5 d 后加入20 μL 的CCK-8 避光孵育4 h；最后將200 μL 反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96 孔板，用酶標儀測定其在450 nm 處的吸光值。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Origin 8. 0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，評價各樣品是否存在顯著性差異。數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，組間比較采用t 檢驗和單因素方差分析（One way ANOVA）。當差異概率 ^*p lt; 0.05 時，認為具有顯著性差異; 當 ^**p lt; 0. 01 時，則認為存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA 促進vSMCs 遷移的能力

首先研究了不同血清濃度下vSMCs 的黏附和增殖情況。結(jié)果證實：無血清培養(yǎng)并不影響vSMCs 的黏附（圖1（a、b）），但卻抑制了細胞的鋪展行為（圖1（c）），顯著降低了vSMCs 的增殖能力（圖1（d）），這主要歸因于饑餓處理促進細胞處于G0/G1 生長周期[18]。比較可知，培養(yǎng)24 h 后，當φ（FBS）=5% 時，vSMCs 的增殖能力最佳，這與胸腺嘧啶核苷類似物（BrdU）的攝入促進DNA 復(fù)制和細胞增殖有關(guān)，但高濃度血清可有效克服細胞的接觸抑制行為，這解釋了培養(yǎng)4 d 后不同濃度血清下細胞增殖無顯著性差異[19]。以上結(jié)果證實了無血清培養(yǎng)法在探索細胞遷移時抑制細胞增殖能力的可行性。

在細胞培養(yǎng)液中，引入不同質(zhì)量濃度的HA 研究其對vSMCs 增殖和遷移行為的影響。在無血清培養(yǎng)條件下，HA 對vSMCs 的增殖行為無顯著性影響（圖1（e））；經(jīng)12 h 和24 h 培養(yǎng)后（圖1（f）），HA 顯著促進了“傷口”愈合，且HA 質(zhì)量濃度越大，“傷口”愈合越佳（圖1（g））。這說明HA 具有顯著促進vSMCs 遷移的作用。從24 h 內(nèi)細胞平均遷移速率看，隨著HA 質(zhì)量濃度的增加，vSMCs 的遷移速率也在加快，表明HA 具有增強vSMCs 遷移速率的功能。

2.2 HA-PLLA 取向纖維的表征

本課題前期工作已證實HA 取向纖維可在維持纖維高取向度的情況下對纖維形態(tài)特征不產(chǎn)生顯著影響[7]，這在本研究進一步得到驗證。SEM 結(jié)果顯示，通過穩(wěn)定射流電紡絲法制備的PLLA 和HA-PLLA 取向纖維均形貌良好、纖維間無明顯黏連現(xiàn)象，且纖維高度取向排列（圖2（a））。從纖維直徑分布看，雖然HA 功能修飾后降低了纖維直徑的均一性，但組間平均直徑（D）并無顯著性差異（圖2（b、c））。TEM 結(jié)果顯示，HA-PLLA取向纖維具有明顯的殼-芯結(jié)構(gòu)，表明HA 已成功涂覆到PLLA 纖維表面（圖2（d））。

FT-IR 結(jié)果顯示，PLLA、HA-PLLA 和水洗后HA-PLLA 取向纖維均在1 753 cm^?1 處出現(xiàn)明顯特征峰（圖2（e）），這主要歸因于PLLA 的酯鍵[20]；HA 的酰胺I 和酰胺II 特征峰分別在1 625 cm^?1 和1 557 cm^?1 處[21]。相比于純PLLA，HA-PLLA 取向纖維在1 612 cm^?1（酰胺I）和1 520 cm^?1（酰胺II）處形成新的明顯特征峰，從而證實了HA 的成功修飾。但相比HA 粉末，HA-PLLA 的酰胺I 和酰胺II 特征峰發(fā)生明顯紅移現(xiàn)象，這是因為交聯(lián)處理增強了HA 羰基官能團的離子相互作用[22]。未交聯(lián)的HA-PLLA 取向纖維經(jīng)水洗后HA 的特征峰消失，也證明了HA 在PLLA 纖維上的成功修飾。

對PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的干態(tài)拉伸力學(xué)檢測結(jié)果顯示（圖3（a～d）），HA 的引入顯著降低了PLLA取向纖維的楊氏模量和斷裂強度。雖然PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的拉伸強度均高于天然血管（約11 MPa）[23]，但與PLLA 取向纖維相比，HA-PLLA 取向纖維剛性的顯著降低則更適用于血管組織工程支架的構(gòu)建。由于HA-PLLA 取向纖維的延伸率主要由PLLA 芯層結(jié)構(gòu)主導(dǎo)，因此HA 的引入對PLLA 取向纖維的最大延伸率無顯著性影響。

為分析HA 引入降低PLLA 取向纖維剛性的原因，對PLLA 和HA-PLLA 取向纖維的分子取向度進行了檢測。在偏振紅外圖譜中，平行吸收圖譜和垂直吸收圖譜偏離越大說明纖維的分子取向度越高。即當Dr 接近1 時，纖維的分子取向度不明顯；當Dr 遠離1 時，纖維分子取向性良好[24]。PLLA 取向纖維的平行吸收圖譜和垂直吸收圖譜差異性明顯大于HA-PLLA 取向纖維的（圖3（e）），PLLA 取向纖維的Dr 也明顯大于HAPLLA取向纖維的相應(yīng)值。分析表明HA 的引入顯著降低了PLLA 取向纖維內(nèi)的分子取向度，證實了HAPLLA取向纖維的剛性低于純PLLA 取向纖維的原因；XRD 微晶取向度結(jié)果也支持這一結(jié)論（圖3（f））。穩(wěn)定射流電紡絲中電荷主要均勻分布在纖維表面，并在電場作用下產(chǎn)生靜電引力對纖維進行拉伸[25]。在該機理下，當純PLLA 取向纖維電紡時，靜電引力可充分拉伸PLLA 分子鏈使其高度取向排列；而在HA-PLLA 取向纖維電紡過程中，因殼-芯結(jié)構(gòu)的存在電荷主要集中在HA 殼層表面，使得承擔纖維力學(xué)主體的PLLA 芯層所受的靜電引力顯著下降，導(dǎo)致PLLA 分子鏈沒有被充分拉伸、分子取向度變差（圖3（g））。

2.3 HA-PLLA 取向纖維誘導(dǎo)vSMCs 的遷移能力

vSMCs 定向鋪展的能力包括提高細胞的延伸率（即細胞形貌縱橫比）和細胞定向排列的取向度[7]?；谌∠蚶w維的各向異性結(jié)構(gòu)特性[16]，本研究分別觀察了vSMCs 在PLLA 和HA-PLLA 取向纖維在垂直纖維方向和平行纖維方向的遷移情況。如圖4（a）所示，HA 引入后，纖維的“傷口”愈合情況得到明顯改善，說明HA 功能修飾PLLA 取向纖維可顯著促進vSMCs 的遷移。從vSMCs 細胞層“傷口”在取向纖維不同方向的愈合情況看，vSMC 細胞層沿著平行纖維取向方向的愈合效果均明顯優(yōu)于垂直纖維取向方向的愈合效果，說明取向纖維有利于引導(dǎo)vSMCs 的定向遷移，這與文獻報導(dǎo)結(jié)果一致[16]。定量的“傷口”愈合寬度也與定性觀察結(jié)果一致（圖4（b））。從細胞平均遷移速率看，取向纖維具有定向引導(dǎo)vSMCs 的遷移特性，且HA 功能修飾后可顯著增強vSMCs 在PLLA 取向纖維上的遷移能力。這可能歸因于HA-PLLA 纖維中 HA 的存在可以被細胞受體CD44 識別，從而促進細胞遷移[26]。

圖4（d）是vSMCs 在PLLA 和HA-PLLA 取向纖維上的增殖情況，并以細胞培養(yǎng)板（TCP）上的增殖情況為陽性對照。相比純PLLA 纖維，HA-PLLA 取向纖維顯著促進vSMCs 的增殖。但該結(jié)果與無血清培養(yǎng)下HA對vSMCs 增殖的影響結(jié)果不一致，主要原因可歸因于以下兩點：（1）饑餓處理導(dǎo)致的生長因子和結(jié)合蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)的缺失對細胞增殖的抑制無法通過添加HA 單一活性分子進行改善；（2）相比純PLLA 取向纖維，HA 功能修飾后改變了vSMCs 的黏附基底，通過增強細胞受體的識別可提高細胞-基質(zhì)間的相互作用[11]，激活vSMCs 的響應(yīng)行為，促進其增殖和遷移。

研究證實，HA 可通過促進細胞CD44 受體表達和細胞骨架重塑等促進內(nèi)皮細胞遷移[27]，并在調(diào)控內(nèi)皮層修復(fù)和功能表達、抑制炎癥響應(yīng)和動脈硬化等方面扮演重要角色[28， 29]。此外，HA 也被證實可通過誘導(dǎo)成纖維細胞遷移促進皮膚愈合[30， 31]。這些結(jié)果均表明HA 的引入在促進細胞遷移及其他細胞行為調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，并提示當前的HA-PLLA 取向纖維在調(diào)控結(jié)構(gòu)特異性組織中的細胞遷移行為方面存在潛在應(yīng)用價值。這為今后構(gòu)建具有引導(dǎo)vSMCs 定向遷移功能的血管組織工程仿生支架提供了合理依據(jù)，也為改善其他組織工程領(lǐng)域的細胞遷移問題提供了指導(dǎo)性方法。

3 結(jié)論

（1）HA 具有促進vSMCs 遷移的功效，這為采用HA 功能修飾PLLA 取向纖維促進vSMCs 遷移策略提供了實驗依據(jù)。

（2）SJCES 法可成功制備出形貌良好、高取向、有明顯殼-芯界面的HA-PLLA 殼-芯纖維，且HA 功能修飾后可通過降低PLLA 分子取向度提高纖維彈性，更適用于血管支架的構(gòu)建。

（3）HA 功能修飾PLLA 取向纖維可顯著促進vSMCs 在取向纖維膜上的生長和遷移。