關(guān)鍵詞： 石榴皮提取物；聚乙烯醇；羧甲基纖維素鈉；水凝膠；傷口敷料

中圖分類號： R318.08;TB34 文獻標(biāo)志碼： A

皮膚作為人體最大的器官，是人體自然防御系統(tǒng)的第一道防線，具有防止外界微生物的入侵、保護內(nèi)部組織等作用[1]。然而，皮膚容易受到各種類型的創(chuàng)傷，如燒傷、燙傷、撕裂等[2]，雖然皮膚具有自我修復(fù)的能力，但是該能力具有一定的局限性，因而傷口敷料成為促進皮膚組織修復(fù)或愈合的有效輔助手段。水凝膠一般由可溶性高分子材料通過化學(xué)或物理交聯(lián)的方法制備而成，是一種三維交聯(lián)親水聚合物，具有較高的含水量，可為傷口提供潮濕的環(huán)境并吸收滲出液[3]，近年來在傷口敷料領(lǐng)域備受關(guān)注。

聚乙烯醇（PVA）是一種無毒、親水、可生物降解的材料，其獨特的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)使其能通過冷凍/解凍的方法制備水凝膠[4]。這種方法制備的PVA 水凝膠可避免引入化學(xué)交聯(lián)劑，從而降低水凝膠的毒性，但該方法制備的水凝膠仍存在透光率低、拉伸性能較差等問題[4，5]，因而限制了其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。羧甲基纖維素鈉（Na-CMC）是一種纖維素衍生物，具有良好的生物相容性和親水性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品和制藥等多個領(lǐng)域[2]。研究證實，Na-CMC 與PVA 通過冷凍/解凍法制備的水凝膠，可通過分子間氫鍵抑制PVA 分子鏈的運動，降低其結(jié)晶度，從而改善水凝膠的拉伸性、吸水性和自愈性等[6，7]。

傷口處的細(xì)菌和活性氧會引發(fā)炎癥反應(yīng)，延緩傷口愈合，因此具有抗菌和抗氧化功能的傷口敷料可以加速傷口愈合，但PVA 與Na-CMC 水凝膠無抗菌和抗氧化活性，因此限制了其在傷口敷料領(lǐng)域的應(yīng)用[8， 9]。石榴作為一種常見水果，在我國種植歷史悠久且種植面積廣泛，其中石榴皮是一種常用中藥材，其質(zhì)量約占石榴質(zhì)量的三分之一，有澀腸止瀉、止血等功效，但大多數(shù)石榴皮被作為廢棄物丟棄。根據(jù)藥理學(xué)研究，石榴皮中存在大量的植物多酚，使石榴皮提取物（PPE）具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物活性[10]。研究表明，PPE對真菌、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌等均具有良好的抑制效果；且PPE 還具有優(yōu)異的抗氧化性，可清除羥自由基、氧自由基等多種自由基[11-14]。此外，Hayouni 課題組[15] 發(fā)現(xiàn)使用石榴皮甲醇提取物制備的軟膏可使豚鼠皮膚創(chuàng)傷愈合時間明顯縮短，證實PPE 在傷口敷料領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。另一方面，相對于抗生素等抗菌藥物，PPE 作為一種天然抗菌物質(zhì)，避免了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。目前關(guān)于石榴皮的研究多集中于化學(xué)成分以及藥理作用機制分析方面，鮮有關(guān)于其應(yīng)用于傷口敷料的研究報道。

本文以PVA 作為基材，向其中引入Na-CMC 和/或PPE，采用循環(huán)凍融法，以丙三醇（GL）水溶液為溶劑，分別制備了PVA/Na-CMC 和PVA/Na-CMC/PPE 水凝膠，并對水凝膠的溶脹性、拉伸性、抗干燥、透明度、釋放性、抗氧化性和抗菌活性進行了測試與表征，探索了該復(fù)合水凝膠在傷口敷料領(lǐng)域的應(yīng)用前景。研究表明，Na-CMC 和PPE 改善了PVA 水凝膠的性能，同時PPE 的加入賦予了水凝膠良好的抗菌性和抗氧化性。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

石榴皮收集于新疆烏魯木齊；PVA：醇解度為98%～99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na-CMC：取代度為0.7～0.9，黏度為600～3 000 mPa·s，上海麥克林生化科技股份有限公司；GL、無水乙醇：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）：北京索萊寶科技有限公司；福林酚（1 mol/L）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）和1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，純度≥98%）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌（S. aureus，菌株編號ATCC 25923）和大腸桿菌（E. coli，菌株編號ATCC 25923）：南通凱恒生物技術(shù)有限公司；酵母浸粉、瓊脂、蛋白胨等：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實驗儀器

傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）：德國Bruker 公司VERTEX70 型， 4 000～500 cm^?1 范圍內(nèi)進行掃描；紫外-可見分光光度計：上海屹譜儀器制造有限公司U-T9S 型，透光率掃描范圍為400～800 nm；高清微觀成像系統(tǒng)：中國國儀量子技術(shù)有限公司TGY3100 型，將干凝膠裁剪成0.2 cm×0.5 cm 的長方形，噴金后置于掃描電子顯微鏡（SEM）中觀察凝膠的微觀形貌，電壓15 kV，放大5 000 倍；電子拉力試驗機：東莞市智取精密儀器有限公司ZQ-990 LB 型， 將水凝膠制作成啞鈴樣， 長度約為30 mm， 兩端寬10 mm， 中間寬5 mm， 拉伸速率為50 mm/min；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠BG-160 型；凈化工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SW-CJ-2 FD 型；熒光倒置顯微鏡：德國Carl Zeiss AG 公司X-Cite 120 Q 型。

1.3 PPE 的制備

將干燥的石榴皮粉碎后過420 μm 的篩網(wǎng)，取100 g 石榴皮粉末浸泡于4.8 L 乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為50%）中，靜置于80 ℃ 水浴中2 h 后真空抽濾。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液后使用石油醚（體積比為1∶1）萃取3 次，濃縮凍干后得到PPE。

式中：A₀ 為樣品在512 nm 處的吸光度，A₁ 為空白組在512 nm 處的吸光度。每個樣品測試3 次取平均值。

1.9 水凝膠的抑菌性能測試

利用抑菌圈法測定水凝膠對S. aureus 和E.coli 的抑菌性能。將水凝膠剪切成直徑10 mm 的圓柱形，紫

外滅菌。放置于涂有100 μL 菌液（10⁶～10⁷ 個/mL）的固體培養(yǎng)基上，使用隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱在37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈情況。

1.10 水凝膠的抑菌機制初步分析

取PGC₀，PGC₁，PGC₁P 水凝膠各200 mg 分別與S. aureus 和E.coli 于37 ℃ 孵育6 h。PBS 洗滌菌體，加入60 μL DAPI（40 μg/mL），避光染色15 min。PBS 洗滌菌體后，加入60 μL PI（40 μg/mL），避光染色15 min。PBS 重懸菌體，去除多余染料，利用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)菌。

取PGC₀，PGC₁，PGC₁P 水凝膠各1 g 分別與S. aureus 和E.coli 于37 ℃ 孵育6 h。取出樣品后，使用PBS洗滌、離心；然后將兩種細(xì)菌分別浸泡于1 mL 戊二醛溶液（體積分?jǐn)?shù)為2.5%）中，在4 ℃ 放置12 h，離心后去掉上清液；接著使用濃度梯度的乙醇對細(xì)菌逐步脫水，每次靜置5 min；最后使用SEM 觀察細(xì)菌的形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外分析

樣品的紅外譜圖如圖1 所示。PGC0、PGC1、PGC1P 分別在3 366、3 383、3 336 cm^?1 處出現(xiàn)了較寬的峰，這與―OH 的伸縮振動有關(guān)。由于每個GL 分子可以提供3 個_―OH，在凍融過程中可與PVA 鏈結(jié)合形成多個協(xié)同氫鍵體系，導(dǎo)致出現(xiàn)的峰較寬[16，17]。同時， 3 種水凝膠均在2 939 cm^?1 處出現(xiàn)了較小的峰，原因是C―H 的拉伸作用。在PGC1 與PGC1P 的FT-IR 譜圖中，兩者分別于1 701 cm^?1 與1 713 cm^?1 處出現(xiàn)了較小的峰，這是由于Na-CMC 中羧酸根的C=O 振動造成的。3 448 cm^?1 和1 638 cm^?1 處的特征峰為PPE 的―OH 伸縮振動和C=C 伸縮振動[18]。從圖中可以看出，PGC₁P 與PGC₁ 的特征峰相似，但由于PPE 的加入，PGC₁P 紅外光譜中的―OH 振動峰向低波數(shù)移動，從3 383 cm^?1 遷移至3 336 cm^?1，該結(jié)果說明PPE 已成功負(fù)載至水凝膠中[18，19]。PGC₁P 光譜中并未出現(xiàn)新的吸收峰，僅觀察到吸收峰遷移，表明PPE 與水凝膠之間是物理相互作用，無明顯的化學(xué)反應(yīng)[20]。

2.2 透明度

由于以水作為溶劑，通過反復(fù)凍融制備的PVA 水凝膠呈白色、不透明，因此常使用二甲基亞砜等有機溶劑提高水凝膠的透明度，但大多數(shù)有機溶劑具有毒性，很難從凝膠中去除[4]。研究表明，GL 可降低PVA 水凝膠的結(jié)晶度，擾亂分子鏈的順序，從而使水凝膠的透光率更高[21]。為獲得較好透明度的水凝膠，本研究以GL水溶液為溶劑制備水凝膠。圖2 顯示了水凝膠的透光率，未添加PPE 時，水凝膠的透光率良好，在600 nm 處PGC₀、PGC₁、PGC_1.2、PGC_1.5 的透光率分別為87.8%，86.8%，86.4% 和85.9%，且透光率與Na-CMC 的含量呈負(fù)相關(guān)。由于PPE 中含有色素物質(zhì)，負(fù)載PPE 后PGC₀P、PGC₁P、PGC_1.2P、PGC_1.5P 在600 nm 處的透光率分別為55.9%、55.1%、52.2% 和51.2%，透光率雖有所降低，但仍可通過水凝膠觀察到下方的直尺與數(shù)字。

2.3 抗干燥性能

研究表明，在水凝膠中加入如GL、乙二醇和山梨醇等醇類物質(zhì)可以提高水凝膠的抗干燥性能[20]。24 h與72 h 后水凝膠的余重比如圖3 （a）所示，各組水凝膠暴露于空氣中24 h 后質(zhì)量雖有所降低，但仍維持在初始質(zhì)量的56.25%～60.51%，72 h 后質(zhì)量降低至初始質(zhì)量的54.17%～56.49%。添加PPE 的水凝膠與未添加PPE 的水凝膠兩者余重接近，說明PPE 的加入并未對水凝膠的失水率產(chǎn)生影響。干燥72 h 后水凝膠仍具有完整性，并未出現(xiàn)塌縮現(xiàn)象（圖3（b））。這是由于GL 屬于低蒸氣壓液體，能與PVA 形成氫鍵，維持水凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[22]。同時，凝膠表面孔隙較少，三維結(jié)構(gòu)被覆蓋。這可能是由于多余的GL 留在水凝膠的孔隙中，并在水凝膠表層形成保護層，導(dǎo)致水凝膠失水率較低。

2.4 溶脹性能

水凝膠的溶脹性能如圖4 所示，9 h 內(nèi)水凝膠快速吸水膨脹，最大溶脹率由PGC₀ 組的（392.0±5.2）% 上升至PGC_1.5P 組的（452.1±12.7）%。這主要是由于水凝膠中含有大量的氫鍵等親水性基團。隨著Na-CMC 含量的增加，水凝膠的溶脹率有所提高，PPE 的加入進一步提高了水凝膠的溶脹率（圖4（b））。水凝膠的溶脹率由PGC₀P 組的（414.3±7.4）% 提升至PGC1.5P 組的（454.0±10.2）%。這可能是PPE 的加入使得水凝膠凍融產(chǎn)生的氫鍵減少，交聯(lián)強度降低，吸水率提高[23]。如圖4（c）所示，水凝膠溶脹4 h 后出現(xiàn)大量孔洞，與圖3（b）形成鮮明對比，這可能是由于水溶解了覆蓋在水凝膠表面以及三維結(jié)構(gòu)中的GL 而產(chǎn)生的，因此水分可以快速進入到水凝膠中。浸泡9 h 的水凝膠結(jié)構(gòu)與72 h 時的結(jié)構(gòu)相似，說明9 h 后水凝膠溶脹速率降低，這可能是導(dǎo)致水凝膠溶脹速率變緩的原因。

2.5 拉伸性能

通過單向拉伸測試，水凝膠的力學(xué)性能試驗結(jié)果如圖5 所示。隨著Na-CMC 含量的增加，水凝膠的拉伸強度逐漸降低（圖5（a）），斷裂伸長率逐漸增加（圖5（b））。這可能是由于Na-CMC 阻礙了PVA 與GL 之間的結(jié)合，導(dǎo)致凍融后產(chǎn)生的氫鍵減少，因此交聯(lián)強度降低[2]。而PPE 的加入對水凝膠的拉伸性也有一定的影響，水凝膠的斷裂強度由PGC₀P 組的（0.42±0.02）MPa 降低至PGC_1.5P 組的（0.30±0.06）MPa，拉伸強度適中，伸長率由（209.92±25.01）% 提升至（300.52±38.34）%。但含有PPE 的水凝膠其斷裂強度和斷裂伸長率均略高于未添加PPE 組的數(shù)值。這可能是PPE 與聚合物分子間形成氫鍵或分子間相互作用，導(dǎo)致水凝膠的強度和柔韌性有一定提高[24]。

2.6 水凝膠的體外模擬釋放

圖6 為水凝膠在37 ℃、72 h 內(nèi)PPE 的累積釋放曲線。從圖中可以看出。前9 h，PGC₀P、PGC₁P、PGC_1.2P、PGC_1.5P 這4 組水凝膠中的PPE 呈爆發(fā)式釋放， PPE 的累積釋放率分別為（57.77±5.59） %、（60.27±4.82） %、（61.79±5.43）%、（64.94±5.16）%。隨后水凝膠中的PPE 釋放逐漸變緩，到72 h 時PPE 的累積釋放率分別為（ 60.77±6.71） %、（ 62.27±6.21） %、（ 64.30±4.21）% 和（ 67.47±3.75） %。這一結(jié)果與溶脹結(jié)果相對應(yīng)，浸泡于PBS 中的水凝膠迅速溶脹，水分子大量溶解水凝膠表面的GL 并進入水凝膠三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部，PPE 為水溶性物質(zhì)，溶解于表層GL 的PPE 以及存在于水凝膠孔隙中的PPE 被快速溶解釋放，因此在前9 h PPE 呈爆發(fā)式釋放，隨后水凝膠骨架中的GL 逐漸與水結(jié)合，而其中溶解的PPE 緩慢釋放到溶液中，因此釋放曲線變緩[21]。

2.7 水凝膠的抗氧化性能

創(chuàng)傷愈合過程中產(chǎn)生的自由基會攻擊和破壞組織中的蛋白質(zhì)，影響傷口愈合，因此傷口敷料應(yīng)具備清除自由基的能力[25， 26]。DPPH 自由基清除實驗被廣泛應(yīng)用于檢測材料的抗氧化活性[27]。如圖7 所示，未負(fù)載PPE 的水凝膠均無法清除DPPH 自由基，而負(fù)載了PPE 的水凝膠均表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，PGC₀P，PGC₁P，PGC_1.2P，和PGC_1.5P 的DPPH 清除率分別為（71.31±5.67）%、（89.34±2.98）%、（92.52±1.68）% 和（93.65±2.27）%，這可能是由于PPE 中含有豐富的多酚類和黃酮類物質(zhì)，對DPPH 自由基具有良好的清除效果，因此使得水凝膠抗氧化活性良好[28]。此外，PGC₀P、PGC₁P、PGC_1.2P、PGC_1.5P 對DPPH 的清除率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，這與圖6 的PPE 釋放曲線結(jié)果相對應(yīng)，隨著水凝膠中PPE 的累積釋放量的升高其DPPH 清除能力逐漸增強。

2.8 水凝膠的抗菌性能

在傷口愈合過程中，傷口被細(xì)菌等微生物感染是創(chuàng)面愈合延遲的常見原因，其中 S. aureus 和E.coli 是傷口感染常見的致病菌[29，30]。如圖8（a）所示，未負(fù)載PPE 的水凝膠并未表現(xiàn)出抑菌性，而加入PPE 的凝膠對S. aureus 和E.coli 顯示出了較強的抑菌性。抑菌圈直徑如圖8（b）所示，水凝膠對S. aureus 與E.coli 的抑菌圈直徑分別由PGC₀P 組的（15.29±0.41）mm、（14.59±0.25）mm 上升到至PGC1.5P 組的（18.78±0.26）mm、（15.11±0.23）mm?？咕鷮嶒灲Y(jié)果顯示水凝膠對S. aureus 與E.coli 均具有較好的抗菌性，這可能是因為石榴皮中的酚類物質(zhì)能夠有效抑制細(xì)菌生長和繁殖[31]。

2.9 水凝膠的抑菌機制初步分析

為了分析水凝膠的抑菌機制，以不含水凝膠的實驗組為空白對照組，PGC₀ 和PGC₁ 為陰性對照組，檢測PPE 體外釋放量最少的PGC₀P 組的抑菌機理。水凝膠與細(xì)菌共同孵育后利用DAPI 與PI 雙熒光染色檢測細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。其中DAPI 可以穿過具有活性的細(xì)菌細(xì)胞膜對細(xì)菌DNA 染色而呈現(xiàn)藍色熒光，PI 則不能穿過活細(xì)菌的細(xì)胞膜，只能與凋亡或破損細(xì)菌DNA 結(jié)合呈現(xiàn)紅色熒光[32]。如圖9 所示，空白組、PGC₀ 與PGC₁ 組的S. aureus 與E.coli 染色均呈現(xiàn)藍色熒光，SEM 結(jié)果顯示，這3 組的S. aureus 與E.coli 仍保持著完整的細(xì)胞形態(tài)，分別呈球狀與桿狀。與PGC₀P 共同孵育后，細(xì)菌染色呈現(xiàn)紅色，SEM 觀察到部分細(xì)菌已無固定形狀，細(xì)胞表面出現(xiàn)破損、坍塌及細(xì)胞內(nèi)容物外泄的現(xiàn)象。由此說明PPE 可以通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜從而抑制細(xì)菌的生長。

3 結(jié)論

（1）采用循環(huán)凍融法，以PVA 和Na-CMC 為原料，GL 水溶液為溶劑，制備了負(fù)載PPE 的水凝膠。

（2）水凝膠具備較好的透明度和抗干燥性能，溶脹性能良好，拉伸性適中，可滿足傷口敷料的要求。

（3）水凝膠的抗氧化性能較強，其PPE 累計釋放率最高可達（67.47±3.75）%，對DPPH 自由基的清除率超過70%。

（4）PPE 可通過破壞細(xì)胞膜抑制細(xì)菌生長，使水凝膠具備良好的抗菌性能。