羅瀾 賀宇

摘要：目的 探討外周血let-7e-5p表達(dá)水平與缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。方法 將2018年4月～2019年4月在公安縣人民醫(yī)院就診的缺血性腦卒中患者作為研究對象（觀察組），對照組為在本院進(jìn)行常規(guī)檢查且年齡、性別滿足研究標(biāo)準(zhǔn)者，使用實時定量PCR法測定患者外周全血let-7e-5p表達(dá)水平，深入剖析缺血性腦卒中患者miRNA表達(dá)水平與發(fā)病風(fēng)險間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果 外周全血let-7e-5p表達(dá)水平上升時，患者發(fā)病風(fēng)險也會隨之出現(xiàn)快速升高的情況，校正處理傳統(tǒng)風(fēng)險和血脂水平以后，依然與之存在著直接的聯(lián)系。在模型Ⅰ里面，ROC曲線下，外周全血let-7e-5p表達(dá)水平的面積與傳統(tǒng)危險因素的面積基本相同。納入miRNA后，外周全血let-7e-5p表達(dá)水平的面積卻出現(xiàn)了大幅度增加，表現(xiàn)出較強(qiáng)的差異性，且有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險與let-7e-5p表達(dá)水平之間存在著明顯的關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：let-7e-5p表達(dá)水平；缺血性腦卒中；關(guān)聯(lián)性

缺血性腦卒中的基因調(diào)控作用受miRNA影響非常明顯，如腦缺血再灌注、腦水腫以及動脈粥樣硬化等[1]。表觀遺傳學(xué)取得的成績非常顯著，非編碼小RNA（miRNA）所發(fā)揮的作用得到了業(yè)界的一致好評。對于miRNA來說，其大小能夠滿足25個核苷酸非編碼RNA標(biāo)準(zhǔn)的要求，在剖析靶基因的3非編碼區(qū)的過程中，使用的主要方式為堿基互補(bǔ)配方，有效指導(dǎo)了沉默復(fù)合體降解靶mRNA的翻譯活動。

通過大量研究發(fā)現(xiàn)[2～4]，人類約1/3 基因的表達(dá)能夠借助人類miRNA得以快速調(diào)節(jié)，高效調(diào)節(jié)了各種形式的生理狀態(tài)和病理狀態(tài)。在缺血性腦卒中患者病情不斷地發(fā)展時，miRNA能夠?qū)ζ淠X缺血再灌注、腦水腫、動脈粥樣硬化等病理過程起到積極的基因調(diào)控作用。對缺血性腦卒中患者血液循環(huán)時，miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行客觀檢測，最終結(jié)論明確了循環(huán)miRNA能不能當(dāng)做缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物[5]。

1資料與方法

1.1 一般資料

將2018年4月～2019年4月在公安縣人民醫(yī)院就診的缺血性腦卒中患者作為研究對象（觀察組），對照組為在本院進(jìn)行常規(guī)檢查且年齡、性別滿足研究標(biāo)準(zhǔn)者，以上研究對象均為漢族，兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組患者調(diào)查表內(nèi)容和生物樣本非常完整。

以相關(guān)分類標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)對缺血性腦卒中患者進(jìn)行診斷，患者癥狀與其保持比較穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)性，各種癥狀和體征要與分類標(biāo)準(zhǔn)基本相同，持續(xù)時間保持在24 h以上，MRI或CT檢查出現(xiàn)陽性改變時需將患有癌癥史、冠心病史等患者排除在外。所有被選擇的對照者都要經(jīng)過全面的體質(zhì)檢查和病史問詢，將存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、心臟手術(shù)和腦卒中病史的患者排除掉。采用問卷調(diào)查法對病例一般情況進(jìn)行調(diào)查，問卷中包括家族史、既往病史和一般情況等內(nèi)容。所有研究對象中，現(xiàn)在吸煙指的是在過去一年中每天都會吸煙，至少1根以上。同時，分析血常規(guī)檢驗、生化檢驗等結(jié)果，在患者入院24 h內(nèi)完成血液樣本采集任務(wù)。

1.2 方法

抽取所有研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下的肘靜脈血5 ml，使用EDTA-K2抗凝管采血，在-80℃冰箱中進(jìn)行全血儲存?zhèn)溆?，有效提取全血中的RNA。mirVanaPARIS miRNA的主要生產(chǎn)企業(yè)為美國Life Technologies公司，對每位研究對象抽取200 μl血進(jìn)行檢測。TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)為美國Life Technologies公司，完成對miRNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而使逆轉(zhuǎn)錄得到快速、高效完成。0.05 μl的100 mmol/LdNTPs、5μl的反應(yīng)體系、1.387 μl的無RNA酶水、1.67 μl的RNA、1μl的5x逆轉(zhuǎn)錄引物、0.063 μl的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、0.5μl的lOx逆轉(zhuǎn)錄緩沖液以及0.33 μl逆轉(zhuǎn)錄酶。稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時，使用25 μl的無RNA酶水完成相關(guān)操作，TaqMan MiRNA檢測試劑盒的主要生產(chǎn)企業(yè)為美國Life Technologies公司，開展PCR擴(kuò)增，做到實時、定量。

PCR分體系構(gòu)成情況：10 μl反應(yīng)體系、4.5 μl的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.5 μl的20xTaqMan miRNA探針和5 μl的TaqM an通用PCR反應(yīng)液。計算miRNA的相對表達(dá)量時，主要使用-ΔCt法來完成，其公式為ΔCt=CtmiRNA-CtU6，內(nèi)參基因為U6[6～7]。

1.3 觀察指標(biāo)

分析患者miRNA表達(dá)水平與缺血性腦卒中的關(guān)聯(lián)性，以及miRNA作為分子生物標(biāo)志物的可行性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

缺血性腦卒中分子標(biāo)志物的曲線下面積主要使用受試者工作特征（ROC）曲線來開展全面分析，在對不同模型的曲線下面積進(jìn)行對比時，使用的主要軟件類型為Medcalc軟件。使用重新分類分析法對miRNA的綜合判別指數(shù)（IDI）和凈重分類指數(shù)（NRI）進(jìn)行分析。使用Spearman分析法對miRNA與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1 關(guān)聯(lián)性

對照組外周全血let-7e-5p表達(dá)水平相對表達(dá)量為（4.06±1.22），觀察組外周全血let-7e-5p表達(dá)水平的相對表達(dá)量為（4.98±1.06），觀察組表達(dá)水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.86，P＜0.01）。缺血性腦卒中患者發(fā)病風(fēng)險與let-7e-5p表達(dá)水平存在直接的關(guān)系，及時校正血脂和危險因素進(jìn)行后，缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險持續(xù)升高會給let-7e-5 p表達(dá)水平的增加帶來直接的影響，具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.87，P＜0.01；OR=2.05；95%CI：167～2.42，P＜0.01）。見表1。

注：在模型1（傳統(tǒng)危險因素的曲線下面積）中，miRNA是的自變量；在模型2中，miRNA和傳統(tǒng)危險因素被全部包含在自變量中，并將吸煙、性別、年齡、飲酒、糖尿病史和高血壓史全部包含在內(nèi)；在模型3中，傳統(tǒng)危險因素、miRNA和血脂水平被包含于自變量中，包括甘油三醋和總膽固醇。

2.2 miRNA作為分子生物標(biāo)志物的可行性

綜合使用ROC曲線后，深入剖析let-7e-5p表達(dá)水平作為分子生物標(biāo)志物的具體情況，最終得出的結(jié)論為具有較強(qiáng)的可行性。在模型Ⅰ里面，ROC曲線狀態(tài)下，外周全血let-7e-5p表達(dá)水平的面積與傳統(tǒng)危險因素（總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇等高）的面積基本相同。納入miRNA后，外周全血let-7e-5p表達(dá)水平的面積卻出現(xiàn)了大幅度增加，與傳統(tǒng)危險因素進(jìn)行比較后，差異明顯，具有較強(qiáng)的統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

3討論

早期診斷和治療對于降低卒中引起的死亡率以及改善預(yù)后具有重要意義。目前缺血性腦卒中診斷主要依賴影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)，尚缺乏有效可靠的血液生物標(biāo)記物，增加了對缺血性腦卒中開展早期篩查的難度[8]。因此，積極尋找有效的血液生物標(biāo)記物有著極其重要的臨床價值。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者表現(xiàn)出的相關(guān)信息直接影響著缺血性腦卒中患者與外周血let-7e-5p表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)性，且二者之間的關(guān)聯(lián)性非常強(qiáng)。在傳統(tǒng)危險因素的基礎(chǔ)之上，將let-7e-5p引入其中，會使疾病的診斷與預(yù)測準(zhǔn)確性得到明顯的提高，為后期將外周血let-7e-5p表達(dá)水平作為核心生物標(biāo)記物奠定了堅實的基礎(chǔ)[9]。相關(guān)研究顯示[10～11]，let-7e-5p在Ⅱ型糖尿病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞里出現(xiàn)了上升情況，與血管生成功能紊亂之間存在著千絲萬縷的聯(lián)系。在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中，let-7e-5p起到了至關(guān)重要的作用。血液粘度升高、內(nèi)膜損傷和腦動脈粥樣硬化等都會導(dǎo)致腦動脈血栓出現(xiàn)，血小板聚集性發(fā)生根本的改變以后，血液流動性就會發(fā)生不同程度的變化，血小板質(zhì)量和內(nèi)皮損傷起到了重要的作用。在腦卒中患者急性發(fā)病時，血小板會快速消耗，導(dǎo)致血小板數(shù)量快速下降，刺激骨髓巨核細(xì)胞增生和血小板形成，血小板快速生長后，其體積和分布寬度都會發(fā)生不同程度的變化。在該研究中，研究對象的相關(guān)指標(biāo)要比對照組高很多，剩余指標(biāo)變化不突出。通過對血小板參數(shù)信息進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者的病情變化與血小板有著直接的關(guān)系，能夠?qū)颊卟∏樽兓龀隹陀^分析[12]。

綜上，缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險與let-7e-5p表達(dá)水平之間存在著明顯的關(guān)聯(lián)。

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