李 超，王素春，王楷宬，薛 峰，王玉英

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南方），山東青島 266032；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3. 青島水族館，山東青島 266031）

赤羽?。ˋkabane disease ）又稱阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane disease virus，AKAV）感染牛羊，以懷孕母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎，以及胎兒畸形、新生仔畜關(guān)節(jié)彎曲、積水性無(wú)腦癥等為特征的一種蟲媒傳染病，蚊蟲和庫(kù)蠓是其主要傳播媒介[1]。我國(guó)將牛赤羽病列為三類動(dòng)物疫病[2]。牛赤羽病也是《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》中的二類傳染病，為口岸地區(qū)重點(diǎn)防范和檢疫的外來(lái)動(dòng)物疫病。近年來(lái)，鄰近我國(guó)的韓國(guó)、日本赤羽病疫情頻發(fā)，給當(dāng)?shù)嘏Ｑ蝠B(yǎng)殖業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球化進(jìn)程加快，動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品跨境流動(dòng)頻繁，AKAV通過(guò)牛羊及其產(chǎn)品進(jìn)口等途徑傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)不斷增大。同時(shí)，蚊蟲、庫(kù)蠓等傳播媒介的繁衍、增殖不再局限于特定區(qū)間，而是跨地區(qū)甚至跨洲流動(dòng)，加上氣候環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)變化以及極端天氣增多，進(jìn)一步加大了赤羽病傳入我國(guó)并在國(guó)內(nèi)傳播和擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)赤羽病進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確診斷是控制其傳入、傳播和流行的關(guān)鍵，因此需要加強(qiáng)對(duì)赤羽病防控技術(shù)的研究和儲(chǔ)備。赤羽病診斷技術(shù)包括依靠觀察病理變化的臨床診斷以及依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。本文對(duì)赤羽病診斷技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行分析和綜述，以期為建立赤羽病現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)方法以及制定赤羽病診斷技術(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 臨床診斷

1.1 臨床癥狀

赤羽病臨床癥狀主要表現(xiàn)為，牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，以及胎兒畸形、新生胎兒先天性關(guān)節(jié)彎曲等。本病在非懷孕牛羊中多為隱性感染，在成年牛中也可表現(xiàn)腦脊髓炎等臨床癥狀?；颌裥虯KAV可導(dǎo)致牛腦脊髓炎，基因Ⅱ型僅引起懷孕牛羊繁殖障礙[3]。

1.2 病理變化

AKAV對(duì)胎兒的腦、脊髓和肌肉細(xì)胞有感染組織嗜性，出現(xiàn)的非炎性壞死可干擾細(xì)胞多形性分化[4]。AKAV感染首先導(dǎo)致新生犢牛、羔羊出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，然后出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲和肌肉發(fā)育不良，最終出現(xiàn)腦積水和嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)病變。AKAV感染可造成神經(jīng)和肌肉病變，如非化膿性腦脊髓炎、局部腦退化性腦脊髓炎造成的腦穿孔、小腦癥、腦積水、腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和軸突消失、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束髓磷脂減少，以及伴隨骨骼肌薄壁組織退化的肌管壞死和多發(fā)性肌炎，脊髓病變導(dǎo)致的脊柱側(cè)凸。同時(shí)，駝背和關(guān)節(jié)彎曲可能會(huì)影響全身所有骨骼關(guān)節(jié)[5]。用AKAV人工感染山羊和綿羊發(fā)現(xiàn)，感染羊出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲、積水性無(wú)腦畸形、駝背、脊柱側(cè)凸、頭小和腦穿通畸形、產(chǎn)死胎和流產(chǎn)。AKAV自然感染綿羊胎兒，會(huì)導(dǎo)致圍產(chǎn)期羔羊死亡或患先天性小腦癥。用AKAV人工感染母牛后發(fā)現(xiàn)，其胎兒畸形種類與妊娠期有關(guān)，妊娠后76～104 d常見積水性無(wú)腦畸形，103～174 d多見關(guān)節(jié)彎曲[6]。綿羊由于妊娠期較短，被感染胎兒可同時(shí)出現(xiàn)腦和骨骼病變。

1.3 鑒別診斷

根據(jù)臨床癥狀和病理變化可對(duì)赤羽病做出初步判斷，發(fā)現(xiàn)可疑病例時(shí)應(yīng)與可引起牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及先天性胎兒畸形等臨床癥狀的其他病毒（如施馬倫貝格病毒、裂谷熱病毒、藍(lán)舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、邊界病病毒等）感染做好鑒別診斷。

2 病原學(xué)診斷

2.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定雖然是診斷赤羽病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，但在進(jìn)出口檢疫、動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程中很少采用。主要原因：一是病毒分離鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)，效率不高；二是AKAV為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，相對(duì)于DNA病毒，其自身穩(wěn)定性較差，容易失活，造成分離失敗。研究[8]表明，從疑似患病動(dòng)物采集肝素抗凝血進(jìn)行病毒分離的成功率較高，偶爾也可從流產(chǎn)胎兒組織中分離到病毒。AKAV可引起雞胚發(fā)育畸形，通過(guò)卵黃囊接種或乳鼠腦內(nèi)接種可分離病毒，可通過(guò)患病毒血癥的哨兵動(dòng)物血漿或攜帶病毒的媒介生物白細(xì)胞中分離病毒，也可通過(guò)1～2日齡乳鼠腦內(nèi)接種待檢組織上清懸液分離病毒。常用哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞系如MDBK、Vero、BHK-21和HmLu-1細(xì)胞系在37 ℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行病毒分離，也可采用昆蟲細(xì)胞C6/36在28 ℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行病毒分離[9]。一般需盲傳3代，直至可見明顯的細(xì)胞病變?？刹捎梅肿由飳W(xué)試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫組化試驗(yàn)或中和試驗(yàn)進(jìn)行分離病原的鑒定。

2.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)方法（immunohistochemistry，IHC）

IHC可采用胎牛和胎羊或用自然感染的新生小牛脊髓組織材料，用福爾馬林固定，過(guò)氧化物酶染色后可進(jìn)行AKAV抗原檢測(cè)。免疫組織化學(xué)試驗(yàn)一般試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不推薦用于基層現(xiàn)場(chǎng)赤羽病診斷。

2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

RT-PCR作為分子生物學(xué)方法中最簡(jiǎn)單的方法，在赤羽病日常診斷檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛。AKAV的基因組由L、M、S3個(gè)基因片段組成，相較于L和M基因的多突變性，S基因相對(duì)保守，因此分子生物學(xué)方法一般將S基因作為AKAV核酸檢測(cè)的靶標(biāo)基因[10]。國(guó)內(nèi)有不少研究已建立了成熟的RT-PCR方法，其檢測(cè)限值可達(dá)1.0×109copies/μL，但與其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比，RT-PCR方法的敏感性略低且耗時(shí)較長(zhǎng)。

2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)方法（quantitative real-time PCR，qPCR）

qPCR具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，比普通RT-PCR靈敏度高且無(wú)需電泳檢測(cè)，不僅能夠保障人員的職業(yè)健康安全，還可減少核酸檢測(cè)時(shí)間，是一種較為快速簡(jiǎn)便的赤羽病病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)。2015年，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布實(shí)施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法》（SN/T 3991—2014），首次將實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（qRT-PCR）檢測(cè)方法納入赤羽病診斷技術(shù)范疇。馬玲等[11]針對(duì)AKAV的S基因建立了SYBR Green I qRT-PCR方法，其檢測(cè)限可達(dá)1.0×101copies/μL，同時(shí)具有較好的特異性和重復(fù)性，更適用于赤羽病傳播媒介蚊蟲、庫(kù)蠓等病毒載量較低樣品的病原檢測(cè)。孟錦昕等[12]建立了AKAV qRT-PCR方法，其檢測(cè)稀釋的病毒標(biāo)準(zhǔn)品限值可達(dá)到10-8，具有較好的敏感性和特異性，為赤羽病的早期診斷提供了技術(shù)支持。

2.5 反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試驗(yàn)方法（reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP是具有獨(dú)特?cái)U(kuò)增模式的一種可視化核酸檢測(cè)方法，可肉眼直接判讀反應(yīng)結(jié)果，擴(kuò)增反應(yīng)可在等溫條件下進(jìn)行，不需要設(shè)備輔助，從核酸提取到結(jié)果判定，整個(gè)周期僅需1.5 h，檢測(cè)成本低，使用簡(jiǎn)單，但其引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。2018年，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布實(shí)施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牛羊赤羽病病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》（SN/T 4824—2017），首次將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法納入赤羽病的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。張吉紅等[13]建立了AKAV RT-LAMP檢測(cè)方法，其特異性良好，靈敏度可達(dá)11.5 copies/μL，采用SYBR Green I染色，肉眼即可判定檢測(cè)結(jié)果。魚海瓊等[14]建立了RT-LAMP檢測(cè)方法，其核酸檢測(cè)的最低檢測(cè)限為1.08 ng/μL，比RT-PCR靈敏度高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。高峰等[16]利用LAMP技術(shù)的高特異性和敏感性等特點(diǎn)，嘗試與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，基于LAMP技術(shù)，建立了包括AKAV在內(nèi)的5種牛傳染病病原的新型高通量快速檢測(cè)基因芯片，其靈敏度可達(dá)102～105copies/μL，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

2.6 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)方法（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）

RT-RAA可在常溫條件下利用重組酶，在恒定溫度下使引物和模板DNA發(fā)生鏈置換反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間低于30 min，并通過(guò)熒光判定結(jié)果，具有引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。宋瑞鵬等[21]首次建立了AKAV熒光RT-RAA方法，42 ℃反應(yīng)20 min即可快速檢測(cè)出AKAV核酸，檢測(cè)靈敏度可達(dá)6.26×101copies/μL，并且具有良好的特異性和重復(fù)性，為AKAV的現(xiàn)場(chǎng)快速即時(shí)檢測(cè)提供了可靠方法。

2.7 聚類規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列-關(guān)聯(lián)蛋白12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein，CRISPR-Cas12a）核酸檢測(cè)試驗(yàn)方法

CRISPR-Cas12a核酸檢測(cè)試驗(yàn)方法采用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，聯(lián)合便攜式檢測(cè)試劑條、便攜式熒光可視化系統(tǒng)或者超靈敏熒光傳感系統(tǒng)等生物傳感器，在滿足高敏感性和高特異性的同時(shí)具備了檢測(cè)高效、便捷的特點(diǎn)。一般須結(jié)合RT-RAA或者RT-LAMP技術(shù)進(jìn)行核酸預(yù)擴(kuò)增，相較于傳統(tǒng)AKAV核酸檢測(cè)技術(shù)，基于CRISPR/Cas12a技術(shù)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)具有較多優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)單且便攜，不依賴于昂貴的設(shè)備和嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件，操作便捷的同時(shí)可達(dá)到理想的靈敏度和特異性，檢測(cè)所需時(shí)間較短，結(jié)果讀取簡(jiǎn)單方便，通過(guò)熒光信號(hào)或肉眼即可進(jìn)行結(jié)果讀取，相應(yīng)試劑可以凍干粉形式存放，便于保存和攜帶?；贑RISPR/Cas12a的AKAV熒光檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)尚屬于研究空白。唐浩等[17]基于CRISPR/Cas12a技術(shù)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)方法（RT-LAMP）建立了一種便攜式檢測(cè)新型布尼亞病毒方法，其最低檢測(cè)限可達(dá)25 copies/μL，在試紙條上顯示肉眼可見的信號(hào)，可在2 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)新型布尼亞病毒的核酸檢測(cè)。

3 血清學(xué)診斷

3.1 膠體金免疫層析試驗(yàn)方法（colloidalgold immunochromatography assay，GICA）

GICA以抗原抗體的特異性反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，檢測(cè)時(shí)間通常只需10 min左右，且不需要設(shè)備和人員培訓(xùn)，其缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度比分子生物學(xué)方法要低，僅可用于輔助診斷?？子穹降萚18]研制的牛赤羽病血清抗體膠體金檢測(cè)試紙，檢測(cè)靈敏度達(dá)1:512，特異性較好，僅可與AKAV 的N蛋白抗體牛血清反應(yīng)，可用于基層養(yǎng)殖戶的赤羽病初篩。楊素等[19]采用雙抗體夾心免疫層析技術(shù)，研制了適合田間快速試驗(yàn)的AKAV膠體金免疫層析試紙條，其檢測(cè)限可達(dá)10 TCID50，特異性較強(qiáng)，還具有快速、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于赤羽病的大批量、田間快速初篩和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

3.2 血清中和試驗(yàn)方法（serum neutrlization test，SNT）

SNT是依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原理，將待檢牛羊血清按比例稀釋后，與確定含量的AKAV混合、孵育，作用一段時(shí)間后再接種到AKAV敏感細(xì)胞內(nèi)（如BHK-21或MDBK細(xì)胞），通過(guò)觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）來(lái)判定血清陽(yáng)性與否的血清學(xué)檢測(cè)方法。SNT特異性高，其缺點(diǎn)是容易受抗原純度、抗體效價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清質(zhì)量影響，需要制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和微量病毒中和試驗(yàn)抗原，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的質(zhì)量。SNT是確定AKAV抗體陽(yáng)性血清的標(biāo)準(zhǔn)方法。2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布實(shí)施農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病細(xì)胞微量中和試驗(yàn)方法》（NY/T 549—2002），2007年SNT被列入《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）中。

3.3 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原理，運(yùn)用已知的AKAV抗原來(lái)檢測(cè)待檢樣品中的AKAV血清抗體，其操作簡(jiǎn)便快速，尤其適應(yīng)于大量血清樣品的檢測(cè)，但其特異性較差，敏感性也較低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題，需要AKAV抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清[20]。該方法作為一種赤羽病輔助診斷的血清學(xué)檢測(cè)方法，被列入《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）中。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA既可以用來(lái)檢測(cè)AKAV抗原，也可以檢測(cè)AKAV抗體。因現(xiàn)階段我國(guó)尚無(wú)赤羽病相關(guān)疫苗可用，因此不管是AKAV抗原陽(yáng)性還是抗體陽(yáng)性結(jié)果均可正確、快速診斷赤羽病。在商品化診斷試劑方面，法國(guó)ID-Vet公司研發(fā)的ID Screen AKAV抗體檢測(cè)試劑盒[21-22]，是以純化的AKAV為包被抗原，以抗AKAV囊膜蛋白的單克隆抗體為競(jìng)爭(zhēng)抗體所建立的競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，其敏感性可達(dá)96.52%，特異性可達(dá)98.83%，能夠?qū)崿F(xiàn)與施馬倫貝格病毒血清的鑒別檢測(cè)，是目前公認(rèn)的敏感性高、特異性強(qiáng)的AKAV抗體檢測(cè)試劑盒，被廣泛應(yīng)用于牛羊血清中的AKAV抗體檢測(cè)和赤羽病診斷。國(guó)內(nèi)也有不少單位正在進(jìn)行AKAV ELISA試劑盒的研發(fā)工作。陳冬杰等[23]利用表達(dá)純化的N重組蛋白作為包被抗原，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗N蛋白單克隆抗體為競(jìng)爭(zhēng)性抗體，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件不斷優(yōu)化，最終建立了AKAV N蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法采用N蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原包被酶標(biāo)板，可避免采用AKAV全病毒作為標(biāo)準(zhǔn)抗原包被酶標(biāo)板時(shí)，因滅活不徹底而產(chǎn)生的生物安全隱患，同時(shí)保留了檢測(cè)方法的敏感性和特異性[24]，為目前國(guó)內(nèi)臨床上赤羽病血清學(xué)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)手段。王建華等[25]采用表達(dá)的AKAV重組截?cái)嗄夷さ鞍祝ǖ?07～614位氨基酸）包被酶標(biāo)板，優(yōu)化反應(yīng)條件建立了AKAV間接ELISA方法。該方法具有良好的特異性和重復(fù)性，對(duì)1:1 280稀釋的AKAV陽(yáng)性血清仍可檢測(cè)出陽(yáng)性；針對(duì)同樣樣品盤，該間接ELISA方法的陽(yáng)性檢出率要高于SNT，但低于ID Screen AKAV抗體檢測(cè)試劑盒。間接ELISA方法的建立為血清樣品中AKAV抗體檢測(cè)提供了有效手段。

4 展望

AKAV是正布尼亞病毒屬中最重要的病原體，可在蚊蟲、庫(kù)蠓的腸道或唾液腺中復(fù)制，蚊蟲、庫(kù)蠓叮咬健康牛羊后，可將病毒通過(guò)血液傳播給新宿主，因此蚊蟲和庫(kù)蠓不屬于機(jī)械性傳播媒介。牛在發(fā)生病毒血癥3～4 d后出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)化，可檢測(cè)到AKAV抗體[26]。赤羽病暴發(fā)可對(duì)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，其暴發(fā)條件包括易感動(dòng)物處于懷孕早期，某地區(qū)傳播媒介物數(shù)量激增（特別是在病毒已消失數(shù)年時(shí)）、降雨量激增等情況[27]。在赤羽病流行地區(qū)，高水平的母源抗體可防止胎兒被感染，但AKAV可在牛羊胎盤中長(zhǎng)期持續(xù)性感染，一般發(fā)生在母羊妊娠后30～70 d及母牛妊娠后30～150 d[28]。當(dāng)牛羊出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲和積水性無(wú)腦畸形等上述臨床癥狀和病理變化時(shí)，牛群和羊群發(fā)病率較高，傳播迅速，可判定為疑似赤羽病，但最終確診需要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。

赤羽病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷，其中病原學(xué)診斷主要檢測(cè)AKAV抗原或核酸，血清學(xué)診斷主要檢測(cè)牛羊血清中是否存在AKAV特異性抗體[29]。赤羽病是我國(guó)口岸重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的跨境動(dòng)物疫病，其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）、《赤羽病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法》（SN/T 3991—2014）和《牛羊赤羽病病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》（SN/T 4824—2017）等。其中ELISA方法是我國(guó)檢疫進(jìn)口牛羊赤羽病常用的血清學(xué)檢測(cè)方法[30]。但現(xiàn)階段我國(guó)對(duì)進(jìn)境牛羊赤羽病檢疫嚴(yán)重依賴國(guó)外進(jìn)口抗體檢測(cè)試劑盒，檢疫單頭份成本高。因此，開展赤羽病新型診斷技術(shù)和檢測(cè)方法研究，開發(fā)新的簡(jiǎn)便、易行，具有高度特異性和敏感性，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化，且適宜于大規(guī)模篩查的赤羽病檢測(cè)方法，研制相應(yīng)的赤羽病診斷試劑，對(duì)于提高赤羽病的檢疫和監(jiān)測(cè)能力具有重要的實(shí)際意義[31]。

AKAV因其特殊的傳播途徑及感染方式，導(dǎo)致多數(shù)感染動(dòng)物為隱性感染，不利于早期感染診斷，這大大增加了赤羽病防控難度。因此，除了研發(fā)特異性強(qiáng)、敏感性高的診斷試劑外，還要做好赤羽病疫苗的相關(guān)技術(shù)儲(chǔ)備。當(dāng)赤羽病形成暴發(fā)和流行時(shí)，疫苗可提供有效免疫屏障[32]。目前我國(guó)尚未系統(tǒng)開展家畜AKAV感染的持續(xù)性監(jiān)測(cè)工作，下一步應(yīng)加強(qiáng)赤羽病的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)預(yù)警。此外，還需要即時(shí)修訂赤羽病診斷相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，制定赤羽病暴發(fā)調(diào)查技術(shù)規(guī)范[33]，以滿足我國(guó)赤羽病防控的實(shí)際需要。