劉濤濤 綜述 張爭運 審校

MicroRNAs(miRNAs) 是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,屬于小的非編碼RNA(small non-coding RNA)。諸多miRNAs參與調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在胰腺腺泡細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)和免疫細(xì)胞之間構(gòu)成一個復(fù)雜的分子調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)。研究表明,miRNAs有助于胰腺炎診斷和治療[1]。急性胰腺炎和慢性胰腺炎是一類發(fā)病率、住院率和病死率較高的炎癥性疾病。與正常胰腺組織比,急性胰腺炎、慢性胰腺炎患者胰腺組織中miRNAs的表達(dá)異常[2]。miRNAs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移、組織重塑從而影響胰腺纖維化(pancreatic fibrosis,PF)的發(fā)展[3]。單個miRNA可調(diào)節(jié)多個靶基因的表達(dá),為有效治療胰腺炎提供了可能。胰腺炎相關(guān)miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明:潛在的治療靶點有hsa-miR-15a(CCND1)、hsa-miR-16(CCND1)、hsa-miR-155(CCND1/SMAD2)、hsa-miR-375(AKT2/CDK6)和hsa-miR-429(CCND1)[3, 4]。一些miRNAs可調(diào)控胰腺細(xì)胞內(nèi)的信號通路,另一些則通過外泌體在胰腺腺泡細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞、PSCs、胰腺免疫細(xì)胞之間傳遞的信號分子。因此,研究胰腺炎病理生理學(xué)過程中的miRNAs表達(dá),了解其與胰腺炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性,有助于開發(fā)有治療價值的anti-miRNA及miRNAs模擬物用于胰腺炎的治療。本文對miRNAs在胰腺炎發(fā)病和進(jìn)展中的作用及分子機制進(jìn)行綜述。

1 miRNAs在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用

1.1 miRNAs調(diào)節(jié)急性胰腺損傷時的炎癥反應(yīng) 胰腺消化酶過早激活會導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[5]。miRNAs對于維持胰腺細(xì)胞的完整性至關(guān)重要,參與調(diào)節(jié)急性胰腺炎炎癥反應(yīng)進(jìn)展的多個環(huán)節(jié)[6]。miR-21在急性胰腺炎炎癥、細(xì)胞凋亡和壞死中的作用已得到充分證實[6]。急性胰腺炎患者和健康受試者的血液樣本對比研究表明,miR-21和miR-155在急性胰腺炎患者中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。小鼠模型也有助于闡明miR-21在急性胰腺炎相關(guān)肺損傷中的作用[7]。與對照組相比,雨蛙素急性胰腺炎模型小鼠的miR-21水平增加,miR-21KO組小鼠的淀粉酶水平較低[8]。與用雨蛙素處理的對照小鼠相比,雨蛙素處理的miR-21KO小鼠的Hnrnph1,Sgk3,Set,Pdcd10Pten和Pias3水平升高,Kpna2,Hmgb1,Cxcl13,Erbb4,Xiap,Gata3,Thbs1,Atg5,Atg7和Atg16的水平降低,Pias3上調(diào)與STAT3激活的抑制相關(guān),Pias3為STAT3的負(fù)調(diào)節(jié)劑[9]。HMGB1協(xié)調(diào)炎癥、免疫和細(xì)胞死亡的過程[10, 11]。重組Hmgb1(rHMGB1)處理外周血單核細(xì)胞(PBMC),miR-21表達(dá)增加。此外,雨蛙素處理miR-21KO小鼠,重組rHMGB1顯著增加了小鼠肺損傷。以上表明HMGB 1和miR-21均參與調(diào)節(jié)急性胰腺炎期間炎癥反應(yīng)。另外,雨蛙素、L-精氨酸L-arginine和脂多糖(LPS)等多種急性胰腺炎動物模型中,證實了miR-21的表達(dá)上調(diào),miR-21與急性胰腺炎中細(xì)胞壞死密切相關(guān),miR-21通過調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞在急性胰腺炎過程中的內(nèi)在反應(yīng)來發(fā)揮其功能[6,12]。

胰腺腺泡細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在急性胰腺炎疾病進(jìn)展中的起關(guān)鍵作用。來源于雨蛙素處理的胰腺腺泡細(xì)胞外泌體EV可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤,加重急性胰腺炎大鼠模型的損傷[13]。損傷胰腺腺泡細(xì)胞來源的外泌體EV載有miR-183-5p,通過直接抑制Foxo1,誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化并刺激淀粉酶和脂肪酶的產(chǎn)生,導(dǎo)致NF-κB通路的激活和IL-6和TNFα水平升高[13]。與健康人相比,來源于急性胰腺炎患者血液樣本外泌體EV中miR-183-5p水平升高[13]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)與miRNAs之間的相互作用可以介導(dǎo)急性胰腺炎期間胰腺的反應(yīng)。一項關(guān)于大鼠急性胰腺炎模型結(jié)果表明,miR-365a-3p的水平被下調(diào),而lncRNA NEAT1在發(fā)生急性胰腺炎時上調(diào)[14]。雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J,miR-365a-3p的表達(dá)上調(diào),TNFα、IL-1β和IL-6等炎癥標(biāo)志物表達(dá)降低。lncRNA NEAT1-siRNA可降低lncRNA NEAT1的表達(dá)水平,增強miR-365a-3p表達(dá)并降低炎性細(xì)胞因子水平[14]。Song等[15]研究表明,在急性胰腺炎的小鼠模型中,miR-361-5p和IL-17的水平在血清和損傷胰腺組織中顯著增加。miR-361-5p在Th17細(xì)胞中的過表達(dá),導(dǎo)致miR-9、146-3p、365-3p 和 183-5p表達(dá)增加。

研究表明,雨蛙素作用于過表達(dá)miR-9和miR-146b-3p大鼠胰腺腺泡細(xì)胞,炎癥反應(yīng)減輕,Il-1β,IL-6,TNF-α表達(dá)和凋亡水平的降低[16, 17],證明miR-9和miR-146b-3p在急性胰腺炎中有保護(hù)作用。Fgf 10在急性胰腺炎損傷中的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α表達(dá)增加而誘導(dǎo)凋亡,凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase 3和9表達(dá)上調(diào),抗凋亡作用bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。miR-9直接靶向Fgf 10,從而阻止NF-κB信號的激活和減少炎癥反應(yīng)[16]。生物信息學(xué)分析確定了Annexin A2 mRNA 3 UTR區(qū)miR-146 b-3p的結(jié)合位點,體外實驗表明Annexin A2是miR-146b-3p的下游靶基因[17]。急性胰腺炎患者血清Annexin A2水平與miR-146b-3p呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)miR-146b-3p的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)雨蛙素誘導(dǎo)后,AnnexinA2的表達(dá)水平降低;Annexin A2過表達(dá)抑制miR-146 b-3p的功能。并導(dǎo)致IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高[17]。

1.2 在細(xì)胞自噬和線粒體自噬調(diào)節(jié)中的作用 細(xì)胞自噬是一個分解代謝過程,細(xì)胞自噬可去除和回收自身受損細(xì)胞器,自噬的過程可分為選擇性和非選擇性。線粒體自噬屬選擇性自噬,可以清除受損的線粒體[18]。離體胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J細(xì)胞模型證實,?；悄懰?3-硫酸鹽(taurolithocholic acid-3-sulfate,TLCs)可誘導(dǎo)炎癥、自噬受阻[19],證明miRNAs靶基因參與急性胰腺炎相關(guān)的細(xì)胞自噬和線粒體自噬。此外,TLCs誘導(dǎo)的細(xì)胞,炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)水平及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II/I增加,而P62表達(dá)下調(diào)[19]。相反,過表達(dá)的miRNA-146a-5p逆轉(zhuǎn)了TLCs的影響。同樣,下調(diào)Irak1或Traf6表現(xiàn)出與miR-146a-5p過表達(dá)相似的效果,表明miR-146a-5p的過度表達(dá)抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬是通過抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB 信號通路來實現(xiàn)的。

在雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中過表達(dá)miR-92b-3p,可抑制炎癥和自噬[20]。過表達(dá)miR-92b-3p可下調(diào)TNFα和IL-6、Traf 3的表達(dá)。熒光素酶活性測定結(jié)果表明,IL-6是miR-148A的直接靶基因,IL-6的表達(dá)可被miR-148A過表達(dá)抑制[21]。miR-92b-3p和miR-148 A的過表達(dá)可下調(diào)Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平[20, 21]。然而,在體內(nèi)小鼠模型中,miR-155的表達(dá)下調(diào)后,Beclin 1的表達(dá)降低,Tab2表達(dá)上調(diào),使急性胰腺炎進(jìn)展期炎癥及自噬受損減輕起保護(hù)作用[22]。

Ji等[23]發(fā)現(xiàn),Atg7過表達(dá)通過抑制miR-30b-5p促進(jìn)CAMKII的激活。ATG7過表達(dá)增強自噬、促進(jìn)壞死,是由miR-30b-5p/CAMKII信號通路介導(dǎo)的[23]。CAMKII可以作為一種治療靶標(biāo)用于急性胰腺炎治療,利用miRNA的生物信息學(xué)和組織微芯片分析證實,miR-30b-5p是急性胰腺炎相關(guān)CAMKII的一種負(fù)調(diào)控因子[23]。用急性胰腺炎患者和體內(nèi)小鼠雨蛙素模型進(jìn)行的研究表明:在急性胰腺炎患者和小鼠血清中miR-325-3p水平顯著降低[24]。TargetScan在線數(shù)據(jù)庫分析及實驗證實,RIPK 3 3’UTR區(qū)有miR-325-3p的結(jié)合位點。此外,miR-325-3p過表達(dá),導(dǎo)致另一種壞死性調(diào)節(jié)因子MLKL的磷酸化降低?？傊?MiR-325-3p可抑制腺泡細(xì)胞中的RIPK 3/MLKL信號通路。

1.3 參與胰腺炎發(fā)病過程中活性氧ROS及腸黏膜屏障通透性的調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi)的ROS可以增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞和組織中氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡[25]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種重要的抗氧化酶,能減少細(xì)胞及體內(nèi)多余的活性氧。SOD能保護(hù)組織免受超氧陰離子的損傷。黃芩苷具有抗氧化和抗凋亡的影響,可能有預(yù)防急性胰腺炎的保護(hù)作用。研究表明,黃芩苷對AR42J細(xì)胞氧化應(yīng)激、活力、凋亡和死亡率無實質(zhì)性影響[25]。但是,低濃度的黃芩苷可下調(diào)miR-136-5p的表達(dá)、上調(diào)SOD1 mRNA和蛋白表達(dá),使急性胰腺炎時胰腺腺泡細(xì)胞活性氧ROS減少,凋亡增加,腺泡細(xì)胞數(shù)量死亡減少。黃芩苷使促凋亡的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),抗凋亡的蛋白質(zhì)表達(dá)減少。黃芩苷也能減少雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡,而miR-136-5p抑制劑則作用相反。黃芩苷治療使淀粉酶水平的下降,胰腺細(xì)胞損傷,且胰腺腺泡細(xì)胞死亡減少。所以,黃芩苷對胰腺腺泡細(xì)胞有保護(hù)作用機制有必要進(jìn)行更深入地研究。

腸黏膜屏障主要結(jié)構(gòu)是緊密連接,主要由 occludin,Claudin和連接粘附分子組成[26]. 研究表明,上調(diào)miR-122、occludin下調(diào),急性胰腺炎大鼠模型腸通透性增加[26]。急性胰腺炎大鼠血清中IL-1β、TNFα、IL-6及內(nèi)毒素水平均升高。抑制miR-122表達(dá),導(dǎo)致occludin閉塞蛋白表達(dá)水平增加。miR-122可直接與occludin3’UTR結(jié)合。通過抑制miR-122表達(dá),上調(diào)表達(dá)閉塞蛋白,可降低急性胰腺炎患者腸黏膜屏障通透性。

2 miRNAs在慢性胰腺炎中的作用

受損胰腺腺泡細(xì)胞、免疫細(xì)胞和PSCs之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與慢性胰腺炎的進(jìn)展密切相關(guān)。受損的胰腺腺泡與免疫細(xì)胞之間的交互作用可增加炎癥反應(yīng),導(dǎo)致PSCs的活化和纖維化的發(fā)展和進(jìn)展[27]。新近研究表明,miRNAs在調(diào)節(jié)參與PSCs損傷的基因轉(zhuǎn)錄中起著重要作用。miRNAs通過外泌體的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)允許胰腺腺泡細(xì)胞影響PSCs活性。miRNAs通過纖維化、凋亡和自噬等方式調(diào)節(jié)PSCs激活。研究表明,miR-15b/miR-16水平在慢性胰腺炎發(fā)展和進(jìn)展時降低,并與α-SMA和BCL-2水平負(fù)相關(guān)[28]。有研究表明,大鼠采用HDAC抑制劑(伏立諾他和曲古抑菌素A)治療,可減輕慢性胰腺炎的纖維炎癥,降低血清IL-6和TNFα水平及降低活化的PSCs標(biāo)記物(如GFAP和α-SMA)水平[29]。同時,Vorinostat治療增加了miR-15/miR-16并誘導(dǎo)PSCs凋亡。miR-15/miR-16的過度表達(dá)降低了SMAD5、TGFβ通路效應(yīng)子和BCL-2的表達(dá)[28,29]。

TGFβ信號通過誘導(dǎo)幾種基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑的表達(dá),在慢性胰腺炎期間激活PSCs中發(fā)揮作用,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑、膠原纖維沉積和組織硬度增加。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn),TGFβ增加lnc-PFAR水平,然后與未成熟的miR-141-5p結(jié)合,阻斷其成熟,并激活PSCs中的纖維化和自噬。此外,miR-141-5p通過與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤卷曲螺旋蛋白1的3’UTR結(jié)合,抑制ULK1去磷酸化并減少自噬來防止自噬。然而,在慢性胰腺炎中,miR-141-5p的水平下調(diào),因此,PSCs的纖維化和自噬增加。MicroRNA-30b-5p 可能通過抑TLR4/NF-κB 通路的表達(dá),從而減弱 LTC-14 細(xì)胞炎癥反應(yīng)、改善纖維化。OM 對 LTC-14 細(xì)胞炎癥反應(yīng)、纖維化的調(diào)節(jié)可能是通過影響 microRNA-30b-5p 而實現(xiàn)的[31]。

一項研究結(jié)果顯示,結(jié)締組織生長因子2 (CTGF/CCN2)和慢性胰腺炎中miR-21之間的正反饋環(huán)[32]。另有研究表明,CTGF是由乙醇、腫瘤壞死因子α、轉(zhuǎn)化生長因子β、PDGF和激活素信號誘導(dǎo)[33],證明CTGF水平的增加與miR-21和纖維形成的增加呈正相關(guān)。值得注意的是,miR-21正調(diào)節(jié)CTGF轉(zhuǎn)錄,并提供自我調(diào)節(jié)的自分泌模式。從PSCs收集的外泌體包含CTGF和miR-21,CTGF和miR-21的過度表達(dá)明顯增加這兩種因子在外泌體中的水平。還有研究發(fā)現(xiàn),活性氧 /miR-21軸促進(jìn)PSCs活化和糖酵解[34],表明過氧化氫誘導(dǎo)miR-21表達(dá),而用白藜蘆醇(RSV)或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)治療則抵消了其在PSCs中的誘導(dǎo)作用。miR-21的下調(diào)抑制了活性氧誘導(dǎo)的PSCs活化、遷移和侵襲。此外,它還減少糖酵解酶,如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、己糖激酶2、丙酮酸激酶M2和乳酸脫氫酶A[35]。這些研究表明,通過直接抑制miR-21或用RSV治療PSCs來減少乳酸分泌。

3 miRNAs作為胰腺炎的生物標(biāo)記物及治療中的作用

近十年的廣泛研究證實,miRNA參與胰腺炎的發(fā)生發(fā)展。各種動物體內(nèi)外模型及胰腺炎患者臨床研究證實miR在急性胰腺炎和慢性胰腺炎中的功能意義[35]。miR-21和miR-155在急性胰腺炎的發(fā)病中至關(guān)重要,并可能作為胰腺炎的生物標(biāo)志物[7]。在雨蛙素處理大鼠胰腺損傷后,血清中檢測到miR-216a/b和miR-217表達(dá)上調(diào)[36, 37]。此外,雨蛙素誘導(dǎo)大鼠和犬引起急性胰腺損傷,miR-216a和miR-375 在表達(dá)升高[38, 39]?；诖笫蠛腿囊认贀p傷研究表明,miR-216a、miR-217和miR-375是胰腺損傷和胰腺炎最有希望的候選生物標(biāo)志物。

從血清中鑒定miRNAs,可作為慢性胰腺炎的鑒別診斷生物標(biāo)志物[40-44]。有學(xué)者對77例患者血清標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),miR-210-3p的表達(dá)是一種非侵入性的生物標(biāo)志物,可區(qū)分PDAC和慢性胰腺炎[40]。另一項研究報告發(fā)現(xiàn),患者血清樣本中的miR-221(AUC=100%)和miR-130 a(AUC=87.5%)可用于慢性胰腺炎的早期診斷[41]。一項對15例慢性胰腺炎患者血漿源性外泌體EV miRNAs的水平調(diào)查發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,慢性胰腺炎患者miR-579-3p的表達(dá)水平明顯減少[42]。另外,一項對90例PDAC及慢性胰腺炎患者的EV樣本的研究表明,miR-95-3p與PDAC、miR-26b-5p與胰腺炎有關(guān),miR-95-3p/miR-26b-5p及CA-19-9可以用于慢性胰腺炎與PDAC患者的鑒別診斷,miR-335-5p/miR-340-5p與PDAC轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[43]。還有研究發(fā)現(xiàn),與健康對照者、慢性胰腺炎患者比較,1型自身免疫性胰腺炎患者(AIP)的miR-21-5p表達(dá)水平明顯增加[44]。

目前,對于血漿或血清中循環(huán)miR作為胰腺炎的生物標(biāo)志物的研究已廣泛開展。Hamada等[45]使用miRNA寡核苷酸芯片陣列技術(shù)研究了AIP患者血清樣品中miR的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-150-5p表達(dá)顯著升高,輕中度急性胰腺炎患者miR-216a水平均顯著升高。Blenkiron等[46]報告了12例不同嚴(yán)重程度(輕度和重度)的急性胰腺炎患者血清中miR-92b、miR-10a和miR-7表達(dá)下調(diào),此外,miR-551 b-5p和miR-126a-5p表達(dá)水平可區(qū)分重度急性胰腺炎和輕度急性胰腺炎 。輕中度和重度急性胰腺炎人群大型隊列研究表明。與輕中度急性胰腺炎患者比,miR-7表達(dá)水平在重癥胰腺炎中明顯升高 。

綜上,胰腺炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中,miRNAs可影響炎癥反應(yīng)及PSCs激活、遷移和侵襲。此外,miRNAs可影響胰腺腺泡細(xì)胞的增殖、凋亡和壞死;誘導(dǎo)或抑制胰腺炎病生理學(xué)進(jìn)程。根據(jù)目前的研究資料及數(shù)據(jù),miRNAs作為診斷生物標(biāo)志物中具有應(yīng)用價值,也可能成為治療胰腺炎的關(guān)鍵候選靶分子。