趙金剛，楊玉瑩

(長(zhǎng)江大學(xué)，湖北 荊州 434023)

隨著規(guī)?；图s化新養(yǎng)殖模式的推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，然而由于存在養(yǎng)殖方式不合理以及環(huán)境污染等問(wèn)題，造成養(yǎng)殖魚(yú)體脂過(guò)度沉積的現(xiàn)象越來(lái)越多(程漢良等，2006)。過(guò)多的脂肪沉積不僅會(huì)影響魚(yú)的品質(zhì)，而且還會(huì)導(dǎo)致魚(yú)免疫機(jī)能受損，患病概率增加，從而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。環(huán)境中多種污染物，包括有機(jī)錫均能夠干擾脂類(lèi)代謝，引起體內(nèi)脂肪增加，這些化合物在低濃度暴露時(shí)，通過(guò)干擾脂肪生成的關(guān)鍵核受體，導(dǎo)致脂肪堆積，而三丁基錫(TBT)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中對(duì)動(dòng)物有致肥胖作用的一種代表性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)TBT 暴露能夠?qū)е赂闻KDNA 損傷，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響肝臟的功能(王云等，2007)。也有研究表明，從鱈魚(yú)肝臟提取的混合物能夠誘導(dǎo)斑馬魚(yú)體重增加，并干擾體脂調(diào)節(jié)(Lyche J L等，2011)，表明環(huán)境內(nèi)分泌污染物可能與魚(yú)脂肪過(guò)度沉積有關(guān)。TBT作為環(huán)境污染中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的代表，研究其對(duì)于脂類(lèi)代謝的影響及其作用機(jī)制具有重要意義。因此，筆者選擇環(huán)境內(nèi)分泌干擾物TBT，在環(huán)境水平下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間暴露，以探究其與魚(yú)脂肪過(guò)度沉積的關(guān)系，為保護(hù)水生態(tài)環(huán)境和漁業(yè)資源提供理論依據(jù)。

一、材料和方法

1.試驗(yàn)材料

(1)試驗(yàn)動(dòng)物。選用的斑馬魚(yú)為同一批次體形基本相近的雌魚(yú)，個(gè)體重為(0.25±0.07)克。每組隨機(jī)選取40尾雌魚(yú)，先在含60升清潔沙濾海水的水族箱中暫養(yǎng)15天，連續(xù)充氣增氧，再選取30尾活力好的個(gè)體進(jìn)行成魚(yú)污染試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)、體重后分缸飼養(yǎng)，保持水溫在26～28℃，設(shè)置對(duì)照組和不同濃度梯度的試驗(yàn)組。每缸9 升水，每天換水4.5升，添加TBT暴露液9微升。

斑馬魚(yú)分別于不同濃度TBT的水體中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)水體每天更換1/2，并清除魚(yú)排泄物。早期幼魚(yú)用草履蟲(chóng)投喂飼養(yǎng)，后期用豐年蟲(chóng)投喂飼養(yǎng)。每天飼喂兩次，上午8 點(diǎn)、下午6 點(diǎn)各1次，每次適量喂食。

(2)試劑。TBT 純度≥95%，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、香蘭素、三油精、膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、PBS 緩沖溶液、MS-222 麻醉劑、磷酸—香蘭素。

(3)試驗(yàn)儀器。電子天平、96 孔“U”形微量反應(yīng)板、量筒、移液器(10、50、200、1 000 微升)、酶標(biāo)板、比色皿、洗滌瓶、250毫升燒杯、容量瓶(250、1 000毫升)、膠頭滴管、試管、試管架，UV-300紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)分析儀。

(4)溶液配置。①TBT 暴露液。先用無(wú)水乙醇配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，避光于4℃保存，試驗(yàn)前用無(wú)氯自來(lái)水分別配置成1、10、100 納克/升3種濃度的TBT 暴露液。對(duì)照組只加無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇的終濃度為1 微升/升。②中性甲醛配制。10毫升甲醛(37%～40%)中加入90毫升雙蒸水、4克磷酸二氫鈉、6.5克磷酸氫二鈉。③磷酸鹽緩沖液(PBS)。稱(chēng)取8克氯化鈉、0.2克氯化鉀、3.63克磷酸氫二鈉和0.24克磷酸二氫鉀，先溶于800毫升雙蒸水，然后用鹽酸調(diào)pH 至7.4，雙蒸水定容至1 升。④4%多聚甲醛(PFA)。稱(chēng)取40克PFA，置于三角燒瓶中，加入500～800毫升PBS，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌，使粉末完全溶解，滴加少許氫氧化鈉溶液使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1摩爾/升的PBS于1升，充分混勻。⑤磷酸—香蘭素。0.12克香蘭素加入20毫升水，充分溶解后用85%磷酸定容至100毫升。

2.方法

(1)暴露試驗(yàn)。培養(yǎng)期間采用自然光周期，溫度控制在26～28℃。雌斑馬魚(yú)分別置于不同濃度的TBT水體中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每天夜里換1/4 體積的水體，重新添加TBT使各組濃度保持不變，對(duì)照組添加無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇的終濃度為1 微升/升。養(yǎng)殖40天后收集各組魚(yú)，用蒸餾水沖洗，除去殘留毒物。

(2)測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)、體重。每組隨機(jī)抓取3尾魚(yú)，用適宜濃度的麻醉液進(jìn)行麻醉。之后測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)；用吸水紙吸干魚(yú)體表的水，再用電子天平測(cè)量體重，測(cè)量后記錄數(shù)據(jù)。

(3)斑馬魚(yú)的解剖。將麻醉過(guò)后的斑馬魚(yú)用大頭針固定在石蠟培養(yǎng)基上，注意不能傷害內(nèi)臟，可以將大頭針插在斑馬魚(yú)頭部和尾部。未解剖的雌性斑馬魚(yú)須用冰塊冷凍保存。使用眼科剪沿魚(yú)體腹部剪開(kāi)，用鑷子掀開(kāi)腹部皮膚，暴露出腹腔，分離出肝臟和性腺，放入PBS溶液中保存。

(4)檢測(cè)總脂質(zhì)、甘油三酯、膽固醇。將提取的組織用勻漿器研磨均勻，研磨液倒入小試管，用2∶1 的氯仿、甲醇洗滌勻漿管，研磨后可用2∶1 的氯仿、甲醇混合液進(jìn)行組織勻漿，萃取脂質(zhì)。萃取物中加入0.88%氯化鉀，靜置過(guò)夜。為防止試管溶液揮發(fā)，可用塑料保鮮膜覆蓋在試管頂部。經(jīng)過(guò)靜置過(guò)夜的組織液，小心移除上層液相層，在下層的有機(jī)相層中加入氯仿、甲醇、水(3∶48∶47)洗滌、萃取，靜置一段時(shí)間。待溶液完全分層后，用移液器穿過(guò)上層液，直接抽取下層液體。將下層液抽取出來(lái)3等分，分別置于3支試管中，做好標(biāo)記。最終的萃取物用氮吹儀在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下吹干，加入100微升雙蒸水，用于脂質(zhì)的測(cè)定。

檢測(cè)總脂質(zhì)：每個(gè)試驗(yàn)樣本各取1支試管用于總脂質(zhì)的測(cè)定。脂質(zhì)的測(cè)定采用Tietz(1976)的方法。在每個(gè)待測(cè)的樣品中加入2毫升硫酸，沸水浴10分鐘，室溫水浴冷卻5分鐘；然后加入磷酸—香蘭素試劑，37℃水浴15分鐘，室溫水浴冷卻10分鐘；用雙蒸水調(diào)零，在UV300 紫外分光光度計(jì)540納米吸收波長(zhǎng)處讀取光密度。以梯度稀釋的三油精(10～100微克)作為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算脂質(zhì)含量。

檢測(cè)甘油三酯：甘油三酯的測(cè)定采用甘油三酯測(cè)定試劑盒(酶偶聯(lián)比色法/單試劑型)取3 微升待測(cè)樣品，在每個(gè)待測(cè)的樣品中加入300微升檢測(cè)試劑，混勻，置37℃水浴5分鐘，以空白管校零，在酶標(biāo)儀570 納米波長(zhǎng)下比色讀取各管吸光光度值，計(jì)算甘油三酯含量。

總膽固醇的檢測(cè)：采用總膽固醇測(cè)定試劑盒(酶偶聯(lián)比色法/單試劑型)取3 微升待測(cè)樣品在酶標(biāo)儀570納米波長(zhǎng)下，利用終點(diǎn)法檢測(cè)各管的吸光光度值，計(jì)算總膽固醇的含量。

二、結(jié)果

1.TBT暴露對(duì)雌性斑馬魚(yú)肥滿度的影響

當(dāng)TBT 濃度為1 納克/升和100 納克/升時(shí)，基本沒(méi)有引起肥滿度發(fā)生變化，當(dāng)TBT 濃度為10 納克/升時(shí)引起雌性斑馬魚(yú)肥滿度升高，但差異不顯著。

2.TBT暴露對(duì)雌性斑馬魚(yú)肝臟脂質(zhì)的影響

當(dāng)TBT 濃度為1 納克/升時(shí)，雌性斑馬魚(yú)總脂質(zhì)含量差別不大，而TBT 濃度為10 納克/升和100 納克/升時(shí)，肝臟的總脂質(zhì)顯著增加，表現(xiàn)出顯著性變化(P＜0.05)，分別是對(duì)照組的1.4 倍和2.67倍。與對(duì)照組相比，TBT暴露未使雌性斑馬魚(yú)肝臟中甘油三酯含量呈現(xiàn)顯著性變化，但隨著TBT濃度的升高，雌性斑馬魚(yú)肝臟中甘油三酯的含量逐漸上升。當(dāng)TBT濃度為10納克/升和100納克/升時(shí)，雌性斑馬魚(yú)膽固醇含量有所降低，但差異不顯著。當(dāng)TBT 濃度為1 納克/升時(shí)，雌性斑馬魚(yú)膽固醇含量顯著增加(P＜0.05)，為對(duì)照組的1.4倍。

三、討論

通過(guò)比較雌性斑馬魚(yú)甘油三酯的含量，能更直觀地發(fā)現(xiàn)TBT 的誘導(dǎo)致肥作用。隨著TBT 濃度的增加，試驗(yàn)組雌性斑馬魚(yú)甘油三酯含量隨之而增加。乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)在哺乳動(dòng)物脂肪酸合成和分解代謝中發(fā)揮著重要作用(lnagaki T，2007)。Murondoti A(2004)證實(shí)，ACC 在奶牛肝臟中脂肪酸的合成及氧化代謝起著關(guān)鍵作用，ACC的mRNA 表達(dá)水平對(duì)于研究奶牛酮病、脂肪肝等物質(zhì)代謝障礙性疾病具有重要意義。ACC1 和ACC2 催化乙酰輔酶A 羧化至丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A 是脂肪酸合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是脂肪酸β 氧化的抑制劑。韓春春等(2006)研究證實(shí)，ACC1 主要調(diào)節(jié)脂肪酸的合成，在脂肪生成活躍的組織中表達(dá)，如肝臟、脂肪組織和乳腺。ACC2 主要調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化，WonKeun(2005)也證明了只有ACC2產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A水平的下降在脂肪酸氧化的下降中起關(guān)鍵作用。所以肝臟中ACC1 的特異性缺失能夠?qū)е轮旧珊透视腿シe累的減少，但不會(huì)影響脂肪酸的氧化。SCD1 是單一不飽和脂肪酸合成的限速酶，由SCD1 合成的單一不飽和脂肪酸是關(guān)于各種脂類(lèi)(如磷脂)、甘油三酯和膽固醇酯合成的主要底物。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組中甘油三酯的含量低于對(duì)照組中的原因可能是TBT對(duì)肝臟脂代謝中多種因子共同作用的結(jié)果。

通過(guò)比較各雌性斑馬魚(yú)組膽固醇含量，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)TBT 濃度為1 納克/升時(shí)，膽固醇含量明顯升高，其他各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比沒(méi)有太大變化，表明在相對(duì)較低濃度TBT的情況下，能使膽固醇含量增加得更明顯。膽固醇在體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當(dāng)其過(guò)量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，表明低濃度的TBT對(duì)于魚(yú)的生長(zhǎng)有著更大的潛在危害性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境水平TBT暴露魚(yú)體后，與對(duì)照組相比甘油三酯含量并沒(méi)有顯著增加，相反卻有所下降，而魚(yú)體總膽固醇含量卻顯著上升，特別是1 納克/升組的魚(yú)體。有研究表明TBT 是RXR/PPARγ 的異源二聚體受體的調(diào)節(jié)劑。RXR 有3種亞型，即RXRα、β、γ，在肝臟中富集的是RXRα 異構(gòu)體。RXRα是一種獨(dú)一無(wú)二的核受體，在多個(gè)細(xì)胞通路中與其他核受體組成異源二聚體，肝臟在脂肪代謝中具有至關(guān)重要的作用，因此對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)也發(fā)生重要的影響(Kanayama T，2005)。而肝臟又是脂肪代謝的主要器官，因此環(huán)境水平的TBT暴露造成了總脂質(zhì)含量的增加。肝臟中乙酰輔酶A羧化酶的特異性缺失能夠?qū)е轮旧珊透视腿シe累的減少，但不會(huì)影響脂肪酸的氧化，而脂肪酸是脂類(lèi)(如磷脂、甘油三酯和膽固醇酯)合成的主要底物，因此造成了膽固醇的增加。