孫穎　王慧　楊文娟　李楠　郝雨　周成東　楊盼

摘要：以茯茶多糖和山楂提取物為主要原料，采用壓片法制備茯茶山楂降脂含片.通過預(yù)實驗、體外降脂實驗和正交試驗篩選主輔料配比；以片劑外觀、口感、硬度和崩解時限作為綜合評分指標對配方進行綜合評價，篩選出茯茶山楂降脂含片的最佳配方為：主藥用量為15%（山楂∶茯茶=4∶1），填充劑用量為70%（可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3），粘合劑為5%PEG6000 和50%乙醇溶液，PVPP用量為10%，硬脂酸鎂用量為0.8%，矯味劑用量為3%（山梨糖醇∶檸檬酸=2∶1）.結(jié)果表明，產(chǎn)品的崩解時限均大于10 min，感官評價良好，茯茶山楂降脂含片對HepG2細胞的降脂和抗氧化作用良好，為降脂產(chǎn)品的開發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持.

關(guān)鍵詞：茯茶多糖； 山楂提取物； 含片配方； 降脂作用

中圖分類號：TS272文獻標志碼： A

Study on the technology of making fuzhuan tea fructus crataegi

tablet and its effects on lowering lipids

SUN Ying， WANG Hui*， YANG Wen-juan， LI Nan，

HAO Yu， ZHOU Cheng-dong， YANG Pan（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：With Fuzhuan Tea polysaccharide and Fructus Crataegi extract as the primary raw ingredients，tablet pressing was used to create a lipid-lowering buccal tablet of Fuzhuan Tea and Fructus Crataegi.Using a preliminary experiment，an in vitro lipid-lowering experiment，a single factor test，and an orthogonal test，the quantities of active and auxiliary substances were evaluated.The formulation was evaluated using the appearance，taste，hardness，and dissolution time of the tablets as comprehensive scoring indexes，and the optimal formulation was identified as follows：15% of the active ingredient （Fructus Crataegi∶Poria tea=4∶1），70% of the filler （soluble starch∶mannitol=1∶3），5% PEG6000 50% ethanol solution as the binder，10% PVPP，and 0.8% magnesium stearate.The concentration of flavoring ingredient was 3% （sorbitol∶citric acid=2∶1）.The results showed that the disintegration duration of the goods exceeded 10 minutes，and the sensory rating was favorable.Fuzhuan Tea Fructus Crataegi Lipid-lowering buccal tablets showed that they lowered lipids and acted as antioxidants in a good way on HepG2 cells.This gives a theoretical basis and real-world evidence for the development and mass production of lipid-lowering products.

Key words：fuzhuan tea polysaccharide; fructus crataegi extract; buccal tablet formulation; lipid-lowering effect

0引言

茯磚茶起源于明朝，在我國主要產(chǎn)自陜西和湖南［1，2］.研究表明，茯茶中富含茶多酚、茶氨酸和茶多糖等活性物質(zhì)，具有抗氧化、保肝護肝、抗炎、抗肥胖、降血脂、免疫刺激和抗腫瘤活性等功效.因此，其具有較高的醫(yī)藥開發(fā)和保健價值［3-7］.

山楂又名紅果，為藥食兩用薔薇科植物，是我國傳統(tǒng)中藥之一，味酸甜，性微溫，入脾胃肝經(jīng)［8-10］.研究表明，山楂中富含黃酮類、有機酸類、三萜類和糖類物質(zhì)，具有消食開胃、保護胃黏膜、降壓、降血脂、抗動脈粥硬化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗心肌缺血、抗癌和保護視網(wǎng)膜等作用［11-14］.

目前，關(guān)于天然產(chǎn)物與膽酸鹽結(jié)合能力的研究主要集中于殼聚糖和膳食纖維，而對多糖及黃酮與膽酸鹽的體外結(jié)合能力研究較少，且市面上關(guān)于茯茶與山楂復(fù)合制備的口含片較少［15］.因此，本試驗以復(fù)配后的茯茶和山楂為材料，通過模擬體外胃腸道環(huán)境中其對膽酸鹽的吸附能力，篩選體外降血脂活性最優(yōu)的原料配比，制成茯茶山楂降脂口服含片，以期填補茯茶山楂降脂口服含片的研究空白，并促進山楂和茯茶在醫(yī)藥藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要材料

茯茶：咸陽涇渭有限公司；山楂：通化市三寶參茸商貿(mào)有限公司；檸檬酸、甘露醇、PEG 6000、山梨糖醇、硬脂酸鎂、蘆丁、可溶性淀粉、低取代羥甲基纖維素、甘胺膽酸鈉、牛黃膽酸鈉：上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、正丁醇、無水乙醇、氯仿：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：生工生物工程（上海）有限公司；油酸：美國Sigma公司；胎牛血清、胰酶-EDTA：美國 Gibco 公司；磷酸二氫鈉、硫酸、膽酸鈉：上海麥克林生化科技有限公司；甘油三酯（TG）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽（GSH-Px）檢測試劑盒、總膽固醇（TC）檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所.

1.1.2主要儀器

THDP-6壓片機：上海天闔機械設(shè)備有限公司；LB-2D型崩解時限測定儀：上海南海藥檢儀器廠；HC-150T2型高速多功能粉碎機：永康市綠可食品機械有限公司；HR150A 洛氏硬度計：北京吉泰科儀設(shè)備檢測有限公司；ZRS-8G智能溶出試驗儀：安徽鴻重醫(yī)療器械有限公司.

1.2試驗方法

1.2.1工藝流程圖

原料粉碎提取→加填充劑→加矯味劑→加崩解劑→均勻混合→加粘合劑→制軟材→14目篩網(wǎng)制?！稍铩?6目篩網(wǎng)整?！訚櫥瑒鷫浩?/p>

1.2.2茯茶多糖的提取和測定

（1）茯茶多糖的提取［16］

茶葉經(jīng)預(yù)處理后得到茯茶粗粉，水浴提取，Sevage法去除茯茶中的蛋白，醇沉濃縮，冷凍干燥，沉淀稱重、備用.

（2）茯茶多糖含量的測定

茯茶多糖的測定方法：將茯茶多糖配制成0.1 mg/mL溶液，分別取3份0.5 mL 0.1 mg/mL茶多糖溶液，各加水至1 mL，按戚向陽等［17］的多糖含量測定方法進行操作，根據(jù)回歸方程計算茯茶多糖中葡萄糖的含量.

1.2.3山楂總黃酮的提取和測定

（1）山楂總黃酮的提?。?8］

將山楂洗凈、晾干，粉碎得到山楂粉末.水浴條件下進行乙醇回流提取，過濾提取液，濃縮、凍干、定容、備用.

（2）山楂提取物中總黃酮的含量測定

山楂提取物總黃酮的測定方法：稱取山楂提取物1 g，蒸餾水溶解，過濾，用2.5 mL的甲醇溶解在25 mL的標準容量瓶中，加水定容至刻度，振蕩搖勻后吸取2 mL轉(zhuǎn)移至25 mL的標準容量瓶中，按劉賢賢等［19］的總黃酮含量測定方法進行操作，根據(jù)回歸方程計算山楂提取物中總黃酮的含量.

1.2.4體外結(jié)合膽酸鹽能力

人體胃腸道pH環(huán)境模擬及膽酸鹽結(jié)合：稱取適量樣品于具塞試管中，分別加入1 mL 0.01mol/L的鹽酸溶液，37 ℃恒溫震蕩消化2 h，調(diào)pH至7.6，加入4 mL膽酸鹽溶液，37 ℃恒溫震蕩2 h，4 000 r/min，離心20 min，取上清液.

樣品測定：分別取樣液2.5 mL，按胡凱等［20］的體外結(jié)合膽酸鹽能力測定方法進行操作，根據(jù)回歸方程計算樣液中膽酸鹽的濃度，重復(fù)3次.計算公式如下：

膽酸鹽結(jié)合率=（1-C₁/C₀）×100% （1）

式（1）中：C₁——樣品溶液的膽酸鹽濃度（mmol/L）；C₀——空白溶液的膽酸鹽濃度（mmol/L）.

1.2.5含片的綜合評價

對含片的外觀、口感、硬度和溶化性進行綜合評分.綜合評分＝外觀評分×2+口感評分×3+溶化性評分×2+硬度評分×3，評分標準如表1所示.

1.2.6含片制備單因素實驗

基礎(chǔ)單因素條件為：PVPP 10%，山楂12%，茯茶3%，5% PEG6000 50%乙醇溶液，硬脂酸鎂0.8%，矯味劑3%（山梨糖醇∶檸檬酸為2∶1），填充劑70%（可溶性淀粉∶甘露醇為1∶3）.分別在可溶性淀粉∶甘露醇為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3；PVPP為7%、8%、9%、10%、11%；粘合劑乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%；硬脂酸鎂為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；山梨糖醇∶檸檬酸為1∶1、1.5∶1、2∶1、1∶1.5、1∶2條件下，考察填充劑的質(zhì)量比、崩解劑用量、粘合劑乙醇濃度、潤滑劑用量及矯味劑質(zhì)量比對茯茶山楂降脂含片綜合評價的影響.

1.2.7正交試驗分析優(yōu)化茯茶山楂降脂含片的制備工藝

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取可溶性淀粉與甘露醇比例、乙醇濃度、硬脂酸鎂用量、山梨糖醇與檸檬酸比例四個因素，設(shè)置四因素三水平正交試驗，如表2所示.

1.2.8驗證性試驗

結(jié)合正交試驗結(jié)果，制備3組茯茶山楂含片，對其進行綜合指標評分，驗證最優(yōu)制備工藝的重現(xiàn)性.

1.2.9茯茶山楂降脂含片的質(zhì)量評價

按《中國藥典》2020版第四部附錄的檢查方法對含片的外觀、片重差異、硬度、崩解時限、溶出度進行了檢查［21，22］.取茯茶山楂降脂含片2片，約1 g，用蒸餾水溶解，按照蘆丁和葡萄糖標準曲線的方法測定吸光度，分別代入蘆丁和葡萄糖的標準曲線回歸方程計算含片中總黃酮和多糖的含量.取含片5片，分別于1 min、3 min、5 min、10 min、20 min、30 min時，取溶液5 mL（并及時補液5 mL），過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，加溶出介質(zhì)稀釋至100 mL，搖勻，測定吸光度，計算溶出度.

1.2.10體外降脂活性評價方法

（1）HepG2細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和1%青鏈雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度達到80%時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗.

（2）口含片溶液的配置

取口含片研磨粉碎，用雙蒸水充分溶解，1 500 rpm離心5 min，取上清，0.22 μM無菌過濾器過濾，凍干備用，使用前用無血清培養(yǎng)基配制為所需濃度.

（3）細胞分組

取傳代次數(shù)較少且生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，將其接種于6孔板（1×105/孔）中，孵育過夜.當細胞密度達到80%～90%時，將其分為六組，分別為：對照組（NC）；400 μM油酸組（MC）；50 μg/mL口含片溶液組（LD）；100 μg/mL口含片溶液組（MD）；200 μg/mL口含片溶液組（HD）.對照組加入含2%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，而其他組加入含400 μM油酸和2%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h.

（4）細胞內(nèi)總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）測定［23］

按照（3）的方法完成細胞培養(yǎng)后胰酶消化，將細胞懸液離心（1 000 r/min ）10 min，向細胞沉淀中加入1 mL PBS混勻，冰水浴條件下超聲破碎細胞，當細胞破碎完全后，不進行離心，參照總膽固醇及甘油三酯說明書測定其含量.

（5）氧化應(yīng)激指標測定［24］

按照（4）的方法破碎細胞后，取上清按照試劑盒明書操作檢測SOD、GSH-Px、MDA.

2結(jié)果與討論

2.1茯茶提取物多糖和山楂提取物黃酮的含量測定2.1.1茯茶提取物多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，如圖1所示.得到的線性回歸方程為：y=30.39x + 0.007 6，R²=0.998 6.據(jù)此計算得出茯茶提取物多糖含量為8.80%.

2.1.2山楂提取物總黃酮含量測定

以蘆丁為標準溶液繪制標準曲線檢測山楂提取物總黃酮含量，如圖2所示.得到的線性回歸方程為：y=14.188x-0.014 7，R²=0.998 7.據(jù)此計算得出山楂提取物總黃酮含量為6.73%.

2.2體外結(jié)合膽酸鹽能力測定來確定主藥山楂和茯茶的比例2.2.1膽酸鹽標準曲線的建立

以膽酸鹽濃度為橫坐標，387 nm處所得吸光度值為縱坐標繪制膽酸鹽標準曲線，如圖3所示.其線性回歸方程為：y=17.311x+0.169 1，R²=0.995 1.

2.2.2山楂茯茶比例篩選結(jié)果

圖4（a）顯示了不同山楂、茯茶比例的膽汁酸結(jié)合能力.當山楂∶茯茶為4∶1時，膽汁酸結(jié)合能力達到最大值54.03%，說明該比例有很好的體外降脂活性，故處方中山楂∶茯茶為4∶1.

圖4（b）顯示了山楂、茯茶和山楂∶茯茶為4∶1時口含片的膽汁酸結(jié)合能力.山楂、茯茶和口含片與膽汁酸的結(jié)合能力分別為28.37%、43.12%和54.03%，說明山楂∶茯茶為4∶1時具有協(xié)同降脂作用.

2.3單因素實驗的結(jié)果

2.3.1填充劑質(zhì)量比的篩選結(jié)果

按照1.2.6節(jié)所述的方法制備茯茶山楂降脂含片，以綜合指標評分為考察指標進行篩選.

不同質(zhì)量比的填充劑制備的茯茶山楂降脂含片的綜合指標評分如圖5所示.由圖5可知，隨著甘露醇用量的增加，綜合指標評分增加.當可溶性淀粉∶甘露醇的質(zhì)量比為1∶3時達到最大值96.52.因此，可溶性淀粉與甘露醇最佳質(zhì)量比為1∶3.

2.3.2崩解劑用量的篩選結(jié)果

按照1.2.6節(jié)所述的方法制備茯茶山楂降脂含片，以綜合指標評分為考察指標進行篩選.

不同用量的崩解劑制備的茯茶山楂降脂含片的綜合指標評分如圖6所示.由圖6可知，隨著崩解劑用量的增加，綜合指標評分先上升后下降，當崩解劑用量為10%時達到最大值97.57.因此，崩解劑最佳用量為10%.

2.3.3粘合劑乙醇濃度的篩選結(jié)果

按照1.2.6節(jié)所述的方法制備茯茶山楂降脂含片，以綜合指標評分為考察指標進行篩選.

粘合劑不同濃度乙醇制備的茯茶山楂降脂含片的綜合指標評分如圖7所示.由圖7可知，隨著乙醇濃度的增加，綜合指標評分先上升后下降，當乙醇為50%時達到最大值93.51.因此，粘合劑乙醇最適濃度為50%.

2.3.4潤滑劑用量的篩選結(jié)果

按照1.2.6節(jié)所述的方法制備茯茶山楂降脂含片，以綜合指標評分為考察指標進行篩選.

不同用量的潤滑劑制備的茯茶山楂降脂含片的綜合指標評分如圖8所示.由圖8可知，隨著潤滑劑用量的增加，綜合指標評分先上升后下降，當潤滑劑用量0.8%時達到最大值73.因此，潤滑劑最佳用量為0.8%.

2.3.5矯味劑質(zhì)量比的篩選結(jié)果

按照1.2.6節(jié)所述的方法制備茯茶山楂降脂含片，以綜合指標評分為考察指標進行篩選.

不同質(zhì)量比的矯味劑制備的茯茶山楂降脂含片的綜合指標評分如圖9所示.由圖9可知，當山梨糖醇∶檸檬酸為2∶1時達到最大值96.53.因此，山梨糖醇與檸檬酸最佳質(zhì)量比為2∶1.

2.4正交試驗優(yōu)化實驗結(jié)果

由表3可知，4個因素對結(jié)果影響的大小為可溶性淀粉與甘露醇的比值（A）>粘合劑乙醇濃度（B）>硬脂酸鎂的添加量（C）>山梨糖醇與檸檬酸的比值（D），可溶性淀粉與甘露醇的比值對含片影響最大，山梨糖醇與檸檬酸的比值對含片影響最小.最優(yōu)組合為A₂B₂C₂D₂，最佳配方為：填充劑為可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3，粘合劑為5%PEG6000 50%乙醇溶液，PVPP用量為10%，脂酸鎂的用量為0.8%，矯味劑為山梨糖醇∶檸檬酸=2∶1.

2.5驗證性試驗結(jié)果

由表4可知，三次重復(fù)實驗，綜合評分與正交試驗所得結(jié)果相近，即A₂B₂C₂D₂為最佳處方.

2.6茯茶山楂降脂含片的質(zhì)量評價結(jié)果

茯茶山楂降脂含片如圖10所示，產(chǎn)品為淺黃棕色，表面有光澤；酸甜適中，無異味；凈含量允差在（500.0±50） mg，符合2020年版《中國藥典》的標準［21］；崩解時限均大于10 min.含片中多糖含量和黃酮含量如表5所示，測得含片中多糖平均含量為3.17 mg，百分含量為0.32%，黃酮平均含量為14.23 mg，百分含量為1.42%.除此之外，含片中多糖及黃酮在30 min平均溶出度達到68.62%和76.12%，溶出速率和程度都符合藥典要求，表明含片中主要活性物質(zhì)能夠在規(guī)定時間內(nèi)溶出釋放出來，進而發(fā)揮藥理作用（如表6和表7所示）.

2.7茯茶山楂降脂含片對細胞中總膽固醇和甘油三酯含量的影響

肝臟脂質(zhì)積累是NAFLD（非酒精性脂肪性肝?。┑年P(guān)鍵組成部分，因此檢測了HepG2細胞中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平，確定茯茶山楂降脂含片對細胞中脂質(zhì)的影響.

由圖11（a）可知，MC組中TC含量是NC組的1.67倍，但經(jīng)過口含片處理后，細胞內(nèi)脂質(zhì)累積呈劑量依賴性地減少.與MC組比，MD組可使TC降低24.55%，HD組降低26.94%.測量細胞內(nèi)TG含量（如圖11（b）所示）.與NC組相比，MC組TG含量升高1.98倍，但經(jīng)過口含片處理后，LD組使TC降低6.98%，MD組降低20.96%，HD組降低29.03%.結(jié)果表明，茯茶山楂降脂含片對HepG2細胞的NAFLD具有明顯的降脂作用.

2.8茯茶山楂降脂含片對細胞中氧化應(yīng)激指標的影響超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是氧化應(yīng)激的重要生物標志物，SOD和GSH-Px可保護細胞免受氧化損傷.從圖12（a）、（b）可以看到，MC組SOD、GSH-Px水平比NC組顯著降低，分別降低41.66%和57.96% （***P<0.001）.與MC組比，經(jīng)過口含片處理后，細胞內(nèi)SOD與GPX活力呈劑量依賴性增加.MD、HD組與MC組間有明顯差異（***P<0.001）.

油酸導(dǎo)致MC組中MDA濃度顯著增加，是NC組的2.09 倍 （***P<0.001，如圖12（c）所示）.HD組使細胞中的MDA濃度顯著降低 （***P<0.001）.因此，口含片可以降低MDA水平，改善脂代謝異常，減輕肝臟脂肪變性.因此，茯茶山楂降脂含片具有良好的抗氧化能力，有效地改善抗氧化狀態(tài).

3結(jié)論

本研究通過單因素實驗和三水平四因素正交試驗，得到最佳配方：主藥用量為15%（山楂∶茯茶=4∶1），填充劑用量為70%（可溶性淀粉∶甘露醇=1∶3），粘合劑為5%PEG6000 50%乙醇溶液，PVPP用量為10%，硬脂酸鎂的用量為0.8%，矯味劑用量為3%（山梨糖醇∶檸檬酸=2∶1）為降脂產(chǎn)品的研究提供一種有效的配方.此外，對茯茶山楂降脂含片的降脂作用進行研究，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞TC、TG、MDA含量降低，SOD、GSH-Px水平增強，口含片為200 μg/mL時降脂和抗氧化效果明顯（***P<0.001）.本試驗采用科學(xué)有效的方法為進一步探究其有效成分和作用機制提供理論依據(jù)，為今后降脂產(chǎn)品的研發(fā)方向提供參考.

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【責(zé)任編輯：陳佳】