段彥亨 安家澤

摘要：肝細胞癌（HCC）的治療是以手術(shù)為主的綜合治療，肝切除術(shù)需要切除原發(fā)性腫瘤并最大限度地保留正常肝組織。然而，在臨床手術(shù)中，肉眼和觸診難以精確識別腫瘤組織及其邊界，往往導(dǎo)致切除不足或過度切除。近紅外熒光（NIRF）成像是一種實時、低成本、無創(chuàng)、高靈敏度的成像技術(shù)，在引導(dǎo)手術(shù)切除腫瘤的應(yīng)用中得到了廣泛的研究。隨著熒光成像系統(tǒng)和熒光探針的發(fā)展，可以實現(xiàn)術(shù)中腫瘤定位和邊界確定，使手術(shù)更加準確。本文回顧了用于HCC術(shù)中導(dǎo)航的各種NIRF探針的發(fā)展，并討論了這些探針的當(dāng)前挑戰(zhàn)和潛在機遇。

關(guān)鍵詞：譜學(xué)， 近紅外線； 熒光光度測定法； 癌， 肝細胞； 肝切除術(shù)

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81773177）

Application of near-infrared fluorescence imaging in hepatectomy of hepatocellular carcinoma

DUAN Yanheng， AN Jiaze. （Department of Hepatobiliary Surgery， The First Affiliated Hospital of Air Force Medical University， Xian 710032， China）

Corresponding author：

AN Jiaze， anjiaze68@163.com （ORCID：0000-0002-5839-4992）

Abstract：

Multimodality therapy based on surgery is the main treatment method for hepatocellular carcinoma （HCC）， and hepatectomy requires the removal of primary tumor and the preservation of normal liver tissue to the maximum extent. However in clinical surgery， it is difficult to accurately identify tumor tissue and its boundary with visual inspection and palpation， which often results in under-resection or over-resection. Near-infrared fluorescence （NIRF） imaging is a real-time noninvasive imaging technique with low costs and high sensitivity， and extensive studies have been conducted to investigate its application in guiding surgical resection of tumors. With the development of fluorescence imaging system and fluorescence probe， intraoperative tumor localization and boundary determination can be realized to make the surgery more accurate. This article reviews the development of various NIRF probes for intraoperative navigation in HCC and discusses current challenges and potential opportunities of these imaging probes.

Key words：

Spectroscopy， Near-Infrared； Fluorophotometry； Carcinoma， Hepatocellular； Hepatectomy

Research funding：

National Natural Science Foundation of China （General Program） （81773177）

原發(fā)性肝癌在我國的發(fā)病率位居常見惡性腫瘤的第4位，是腫瘤致死的第2病因，嚴重威脅人民的生命和健康。其中，肝細胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的大部分（＞80%）［1］。目前，臨床常用的治療方法為手術(shù)切除，在HCC的治療中療效確切。腫瘤外科治療的主要目標(biāo)是實現(xiàn)腫瘤的完全切除，但是有些患者出現(xiàn)原發(fā)灶切除不完全（陽性切緣），以及切除時未能切除肝臟中所有的病灶（隱匿性病灶），并且與較低的生存率和較高的復(fù)發(fā)率密切相關(guān)［2］。因此，需要利用術(shù)前或術(shù)中的成像技術(shù)來定位HCC，并保證完全切除。

以往?；诖殴舱癯上瘢∕RI）或電子計算機斷層掃描（CT）來幫助定位腫瘤，但這兩種技術(shù)沒有足夠的分辨率來確定切除邊緣。此外，在術(shù)中檢測手術(shù)切緣的常用技術(shù)是冰凍切片，但這是一個耗時并且昂貴的方法，并且由于取材的位置會造成此項檢測容易出現(xiàn)假陰性。另外，術(shù)中超聲雖能很好反映腫瘤周圍的結(jié)構(gòu)并確定切肝線，但這種技術(shù)需要專業(yè)的超聲科醫(yī)師，而且超聲探頭頻繁介入不僅影響手術(shù)連貫性，耽誤時間，而且無法真正做到全程實時成像指導(dǎo)手術(shù)。因此，迫切需要一種實時、安全和可靠的成像技術(shù)來實現(xiàn)HCC的準確定位和完整切除。

術(shù)中近紅外熒光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像技術(shù)是一種使用方便、安全、成本低的可視化成像技術(shù)，在指導(dǎo)外科手術(shù)中得到了廣泛的研究。NIRF成像技術(shù)主要基于近紅外一區(qū)（NIR-Ⅰ，700～900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000～1700 nm）光學(xué)波段［3-5］。與可見光相比，生物組織對近紅外波段內(nèi)光的吸收和散射較少，生物自發(fā)熒光較弱，這使得NIRF成像技術(shù)具有時空分辨率高、對生物組織損傷小、背景熒光干擾小等優(yōu)點，在提供生理和病理信息方面具有顯著的優(yōu)勢。本文總結(jié)了各種NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ熒光探針在HCC肝切除術(shù)中的臨床前研究和臨床應(yīng)用的最新進展，對這些探針在不久的將來在肝臟手術(shù)中的應(yīng)用進行展望。

1 NIR-Ⅰ熒光成像

1.1 用于臨床的NIR-Ⅰ熒光探針

1.1.1 吲哚菁綠（indocyanine green，ICG） ICG是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準臨床使用的NIRF染料。靜脈注射ICG進入體循環(huán)后，ICG與血漿中的白蛋白、脂蛋白等高分子蛋白結(jié)合，既不被代謝分解，也不會改變被結(jié)合蛋白的分子結(jié)構(gòu)，具有良好的血管內(nèi)穩(wěn)定性。ICG分子通過肝細胞活躍的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被肝細胞特異性攝取，隨后分泌至膽道系統(tǒng)最終通過腸道排出體外，不存在腸肝循環(huán)，使用較為安全［6］。實驗研究表明，熒光在穿透生物組織的過程中，絕大多數(shù)光線被血紅蛋白（波長＜700 nm）和水分（波長＞900 nm）吸收中和。ICG分子被波長750～810 nm的光線激發(fā)后，發(fā)射峰值波長為840 nm的熒光，該熒光波長位于深紅和近紅外線光譜的“窗口”界限（700～900 nm）內(nèi)，因而具有較大的組織穿透力。

正常肝組織可在12～24 h內(nèi)徹底清除ICG，由于腫瘤組織的“高滲透長滯留效應(yīng)”以及HCC組織中肝細胞的膽汁排泄功能受損，靜脈注射后ICG在腫瘤組織中殘留數(shù)周，在術(shù)中激發(fā)光照射下顯示腫瘤組織熒光［7］。ICG在HCC中聚集的現(xiàn)象在2007年被偶然發(fā)現(xiàn)，隨后Ishizawa等［8］開展的一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)ICG熒光成像識別了所有63例術(shù)后病理確診的HCC，其中，有8例術(shù)前被漏診而被ICG成功識別。除了肝內(nèi)HCC，Satou等［9］在2013年報道，利用ICG成功識別了包括腹膜、淋巴結(jié)、肺和腎上腺轉(zhuǎn)移的病理證實為HCC的肝外轉(zhuǎn)移灶。同年，Morita等［10］初步探討了ICG熒光成像能否改善HCC患者的預(yù)后。通過對58例接受術(shù)中ICG熒光引導(dǎo)切除術(shù)的HCC患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，這些患者術(shù)后12個月內(nèi)的短期復(fù)發(fā)率較對照組有降低的趨勢。Ishizawa等［7］在2014年的進一步研究顯示通過ICG熒光成像識別出276個HCC中的273個，靈敏度為99%。此外，研究［11］還發(fā)現(xiàn)ICG的顯像模式與HCC的分化程度密切相關(guān)。低分化的HCC呈環(huán)狀熒光模式，而高分化和中等分化的HCC分別具有完全和部分熒光模式。分化型HCC保留了攝取ICG的能力，但由于缺乏正常的膽管結(jié)構(gòu)，使得ICG在腫瘤組織內(nèi)積聚滯留，顯示出部分熒光。低分化或轉(zhuǎn)移性肝癌細胞雖不攝取ICG，但腫瘤的壓迫干擾癌旁肝臟組織ICG通過膽管分泌，在不同程度上影響癌旁肝組織ICG的正常清除，從而顯示環(huán)形熒光。最近，Zhang等［12］證明了術(shù)中ICG近紅外熒光檢測對于識別體積小且難以肉眼觀察到的HCC的巨大潛力，檢測到的最小HCC結(jié)節(jié)直徑約為2 mm。

解剖性肝切除術(shù)能顯著降低HCC的術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后［13］。術(shù)中肝段解剖界限的確定是解剖性肝切除術(shù)的技術(shù)關(guān)鍵，既往常用的技術(shù)是根據(jù)肝蒂阻斷后肝表面缺血線，以及術(shù)中超聲引導(dǎo)下穿刺門靜脈分支內(nèi)注射亞甲藍使目標(biāo)肝段藍染來指導(dǎo)解剖性肝段切除術(shù)［14］。但這兩種方法精確性較差、難以確定肝段的立體界面，且標(biāo)記持續(xù)時間較為短暫。有研究［15-16］報道在解剖性肝切除術(shù)中比較經(jīng)門靜脈注射ICG熒光染料與亞甲藍界定肝段、指導(dǎo)解剖性肝切除的實際應(yīng)用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICG熒光染料能更清楚、方便和持久地顯示荷瘤肝段在肝實質(zhì)的三維界限，認為ICG熒光導(dǎo)航可安全、有效地應(yīng)用于解剖性肝切除術(shù)。ICG給藥途徑的不同，對目標(biāo)肝段的熒光標(biāo)志效果也相應(yīng)不同，因此將肝段熒光染色的方法分為“正染”和“負染”?！罢尽笔侵冈谀繕?biāo)肝段的門靜脈（或肝動脈）分支里注射ICG，ICG在該肝段肝實質(zhì)內(nèi)的近紅外線激發(fā)后發(fā)出熒光，目標(biāo)肝段的熒光染色可指導(dǎo)解剖性肝切除術(shù)；“負染”是指術(shù)中選擇性阻斷目標(biāo)肝段的肝蒂血流后，從外周靜脈內(nèi)注射ICG，使除目標(biāo)肝段外的有血供肝臟實質(zhì)內(nèi)ICG熒光顯影，而目標(biāo)肝段無熒光染色獲得反襯效果。近年來，越來越多的研究［17-20］報道了涉及使用ICG近紅外熒光成像的正染或負染方法開展的解剖性肝切除術(shù)。因此，ICG熒光染色確定肝段解剖界限，實現(xiàn)術(shù)中實時肝段可視化，可極大地輔助肝解剖性切除的順利實施。

目前，ICG熒光成像在HCC肝切除術(shù)中的應(yīng)用仍存在兩大局限。一是有限的組織穿透深度。據(jù)報道［21］，ICG被激發(fā)后發(fā)射的熒光在組織內(nèi)的穿透深度大約為10 mm，距肝表面10 mm以上的腫瘤很難被識別。另一個局限性是HCC結(jié)節(jié)的高假陽性檢出率。我國HCC患者大部分同時伴有肝硬化，而肝硬化的再生結(jié)節(jié)也可顯示較強的熒光導(dǎo)致40%～50%的假陽性率［22］。

1.1.2 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA） 另一個臨床上用于腫瘤診斷的NIR-Ⅰ熒光染料是5-ALA，5-ALA是人體血紅素生物合成途徑中原卟啉的前體物質(zhì)。正常情況下，體內(nèi)5-ALA水平受到血紅素合成的負反饋調(diào)節(jié)，保持動態(tài)平衡的狀態(tài)，細胞內(nèi)不會蓄積過多的5-ALA。當(dāng)大量外源性5-ALA進入機體時，這種負反饋平衡會被打破，導(dǎo)致細胞中原卟啉的過度積累。而原卟啉在波長為405 nm的藍紫色光的激發(fā)下可在630 nm的可見光譜內(nèi)檢測到紅色熒光。原卟啉在腫瘤細胞和正常細胞中的分解速度不同，在正常細胞中，原卟啉在2～4 h可徹底降解，而在腫瘤細胞中則需要12～24 h。因此經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后，原卟啉過度累積的腫瘤細胞在視覺上就可與原卟啉含量較少的正常組織區(qū)分開［23］。2002年，Schneider等［24］首次報道了利用5-ALA發(fā)現(xiàn)了幾個肉眼觀察不到的HCC轉(zhuǎn)移灶。2016年，Kaibori等［25］比較了ICG和5-ALA兩種熒光染料在術(shù)中檢測淺表肝腫瘤的應(yīng)用。結(jié)果顯示5-ALA和ICG檢測術(shù)前確定的主要腫瘤的敏感度分別為57%和96%，特異度分別為100%和50%。據(jù)報道［26］低血壓和肝功能異常是口服5-ALA的潛在不良反應(yīng)，因此ICG與5-ALA相比的主要優(yōu)勢在于其安全性和商業(yè)可用性。

1.2 用于臨床前研究的NIR-Ⅰ熒光探針

由于靶向性不足，ICG在HCC成像應(yīng)用中存在一定的局限性。為了提高HCC的靶向性以及NIRF對腫瘤和背景信號的比值（T/B值），越來越多的研究通過對常規(guī)NIRF染料的結(jié)構(gòu)修飾、偶聯(lián)腫瘤的靶向配體以及納米修飾等策略，研發(fā)了一些具有HCC診斷優(yōu)勢的NIR-Ⅰ熒光探針。由于需要從有效性、安全性和倫理學(xué)角度進行評估，新開發(fā)的NIR-Ⅰ熒光探針進入臨床實踐需要很長時間。大多數(shù)用于HCC成像的NIR-Ⅰ熒光探針仍處于臨床前研究階段。

1.2.1 有機染料 由于腫瘤線粒體膜電位比正常細胞膜電位高，使得花青素類染料可以直接聚集于腫瘤部位，發(fā)揮腫瘤靶向作用［27］。Shi等［28］研究了IR-783在人肝癌細胞HepG2荷瘤小鼠中的成像應(yīng)用。結(jié)果顯示IR-783特異性聚集在腫瘤部位，能夠清晰地識別腫瘤邊緣，并且NIRF強度隨腫瘤體積的增大而增強。2018年，Shi等［29］又發(fā)現(xiàn)MHI-148染料可特異性集聚于體外培養(yǎng)的HCC細胞，肝癌皮下荷瘤鼠注射MHI-148染料24 h后T/B值逐漸增加，并在24 h達到峰值。但對于臨床應(yīng)用來說，腫瘤靶向NIRF染料的整體表現(xiàn)尚不理想，例如溶解性差，生物相容性等問題亟待解決。因此，研發(fā)水溶性好、毒性低和腫瘤特異性好的NIRF染料將是HCC非侵入性診斷的方向。

1.2.2 偶聯(lián)腫瘤靶向配體的熒光探針 熒光染料的腫瘤靶向性對于腫瘤檢測的特異性和敏感性至關(guān)重要。然而，大部分的NIRF探針并不具備或僅有極低的靶向能力，這就限制了NIRF染料在腫瘤顯像中的應(yīng)用。通常NIRF染料需要與腫瘤特異性配體的結(jié)合實現(xiàn)對腫瘤的主動靶向性。這些特異性配體包括化學(xué)分子、肽、蛋白質(zhì)、抗體和核酸適配體等，能夠特異性地識別腫瘤細胞相關(guān)的生物標(biāo)志物。2011年，Li等［30］首次證明精子蛋白17在HCC細胞系SMMC-7721中過表達，與ICG偶聯(lián)的抗精子蛋白17單克隆抗體可用于體內(nèi)HCC成像。已知CD24在包括HCC在內(nèi)的多種人類腫瘤中過表達，2015年He等［31］將CD24靶向抗體G7mAb和G7S偶聯(lián)NIRF染料，并在HCC異種移植組織中觀察到特異性NIRF成像。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC3）的表達在HCC中顯著升高，但在膽管癌或正常肝組織或血清中沒有顯著升高。Zhu等［32］和Qin等［33］將NIRF染料Cy5.5標(biāo)記的GPC3結(jié)合肽靜脈注射到HepG2荷瘤小鼠體內(nèi)后，成功區(qū)分HCC組織與正常肝組織。

1.2.3 納米探針 隨著納米技術(shù)的進展，基于納米材料的NIRF分子探針可以通過增強腫瘤微血管系統(tǒng)的通透和滯留作用，或通過與腫瘤相關(guān)配體的特異性結(jié)合靶向到腫瘤［34］。2016年，Zeng等［35］合成了一種精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸共軛介孔二氧化硅納米顆粒，其高度負載ICG，可以準確描繪肝癌邊緣并在術(shù)中提供精確的腫瘤與正常組織熒光強度對比。增加的ICG負載能力和腫瘤特異性使得能夠識別活體小鼠中＜1 mm的殘留微腫瘤和衛(wèi)星病變。雖然納米顆粒是用于腫瘤特異性成像的較好方式，但由于其潛在的系統(tǒng)性毒性以及穩(wěn)定性限制了其廣泛應(yīng)用，目前納米NIRF染料的應(yīng)用僅限于細胞水平和實驗動物。因此，開發(fā)具有可生物降解或表面包裹的納米顆粒材料，如磷酸鈣、低密度脂蛋白和聚合物等納米粒子的NIRF將成為未來研究的方向。

2 NIR-Ⅱ熒光成像

2.1 用于臨床的NIR-Ⅱ熒光探針 與傳統(tǒng)的近紅外窗口（NIR-Ⅰ，750～900 nm）相比，NIR-Ⅱ熒光利用其長波長的優(yōu)勢，減少了光子散射，減少了自發(fā)熒光，使光子能夠穿透更深的生物組織，提高空間分辨率，可明顯提高腫瘤成像的效果［36］。然而，由于缺乏合適的成像儀器和光學(xué)探針，NIR-Ⅱ熒光成像尚未在臨床實踐中得到應(yīng)用。最近研究［37］發(fā)現(xiàn)ICG在NIR-Ⅱ范圍內(nèi)也可顯示熒光，并已被證明適用于小動物模型中的NIR-Ⅱ成像。Hu等［38］開發(fā)了一種集成的可見光和NIR-Ⅰ/Ⅱ多光譜成像儀器，并表征了不同紅外窗口下人類和動物研究的成像性能。此外，在ICG注射后的23例肝腫瘤患者中進行了可見光、NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ多光譜成像的首次人體研究。對于所有HCC患者（n=11），NIR-Ⅱ成像比NIR-Ⅰ成像顯著提高了腫瘤與正常組織熒光強度的比值以及更高的靈敏度和陽性預(yù)測值。值得注意的是，NIR-Ⅰ成像需要避光，而NIR-Ⅱ成像則不需要。NIR-Ⅱ成像與手術(shù)室照明環(huán)境兼容，為臨床應(yīng)用提供了便利性和可行性。

2.2 用于臨床前研究的NIR-Ⅱ熒光探針 盡管NIR-Ⅱ熒光探針具有其顯著優(yōu)勢，同時還豐富了在NIR-Ⅱ生物成像領(lǐng)域的探索和應(yīng)用，但目前的研究主要集中在基礎(chǔ)研究上。Ding等［39］開發(fā)了一種自組裝的NIR-Ⅱ熒光探針（SCH1～SCH4），SCH4在小鼠HCC模型中顯示出快速的腫瘤攝取和較高的腫瘤/正常組織的信號比 （＞7），能夠促進精確的圖像引導(dǎo)腫瘤手術(shù)，并且還首次展示了在NIR-Ⅱ窗口中檢測肝纖維化。此外，Ren等［40］報道了一種稀土摻雜的NIR-Ⅱ熒光探針（Gd-REs@Lips）。對HCC的人源腫瘤異種移植小鼠模型成像研究表明，Gd-REs@Lips在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的T2對比效果，NIR-Ⅱ熒光成像在肝表面檢測到最小病灶直徑為2 mm的衛(wèi)星病灶。最近，Zhang課題組［41］合成了一種腫瘤微環(huán)境中過氧亞硝酸鹽（ONOO-）響應(yīng)的NIR-Ⅱ染料MY-1057，它可以通過基于熒光壽命成像準確檢測單個和多個HCC。NIR-Ⅱ熒光成像的研究仍處于起步階段，有必要進一步開發(fā)發(fā)射波長可調(diào)、量子產(chǎn)率高、生物毒性低的新型NIR-Ⅱ熒光探針。然而，由于未見報道臨床批準的 NIR-Ⅱ熒光染料，因此尚無新的探針用于NIR-Ⅱ臨床手術(shù)導(dǎo)航。

3 當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來展望

ICG和亞甲藍是美國FDA批準的唯一可用的NIR熒光團［42］。亞甲藍由于其非特異性和有限的量子產(chǎn)率，尚未于常規(guī)手術(shù)應(yīng)用。雖然有報道ICG可以實現(xiàn)HCC的NIR-Ⅰ/Ⅱ熒光成像，但作為非靶向探針，ICG腫瘤顯像的高假陽性率限制了其應(yīng)用發(fā)展。目前限制其進一步臨床應(yīng)用的問題為NIRF染料不具有靶向性以及水溶性差。靶向NIRF探針需要NIR熒光團和靶向分子穩(wěn)定結(jié)合，才能實現(xiàn)靶向腫瘤細胞的熒光成像。目前還缺乏針對HCC的NIRF成像的臨床試驗；更重要的是，對于HCC的最佳生物標(biāo)志物尚無明確共識。HCC的早期檢測和新型靶向NIRF探針的開發(fā)迫切需要分子靶標(biāo)。

與NIR-Ⅰ成像相比，NIR-Ⅱ熒光成像具有更深的成像深度，并且具有較少的自發(fā)熒光的干擾。然而，在臨床環(huán)境中實施NIR-Ⅱ成像之前，仍有一些障礙需要克服。首先，目前的NIR-Ⅱ熒光分子大部分生理穩(wěn)定性差且具有疏水性，此外，其中一些分子是無機熒光團，毒性大，代謝緩慢，不針對特定組織；其次，各種分子相互作用導(dǎo)致猝滅，導(dǎo)致熒光分子發(fā)出的光減少；第三，目前只有少數(shù)NIR-Ⅱ成像系統(tǒng)可用，這些系統(tǒng)的開發(fā)成本非常高。最重要的是，目前只有臨床前NIR-Ⅱ熒光探針可用，將臨床前研究轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境是一個漫長的過程。因此，臨床應(yīng)用可能還很遙遠。

在肝切除術(shù)中，減少正常結(jié)構(gòu)損傷和去除所有腫瘤組織對HCC患者至關(guān)重要。迄今為止，NIRF成像已顯示出其應(yīng)用于外科手術(shù)的巨大潛力以及改善臨床預(yù)后的可行性。NIR-Ⅰ熒光成像在HCC肝切除術(shù)中進展迅速，但仍缺乏靶向探針的臨床試驗。隨著臨床前研究的不斷增加，NIR-Ⅱ成像已經(jīng)到了一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折點。伴隨新的成像技術(shù)以及成像設(shè)備的不斷發(fā)展，NIRF成像的研究范圍將不斷擴大，未來可能真正實現(xiàn)手術(shù)導(dǎo)航，幫助外科醫(yī)生進行術(shù)中決策，為HCC的診療提供一種嶄新的方法。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：段彥亨負責(zé)收集文獻，資料分析，撰寫論文；安家澤負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2022-06-09；錄用日期：2022-07-27

本文編輯：王瑩