鄧靈　蘆曉萍　翟平平　李睿

摘要：沙門菌耐藥性對人類健康造成巨大威脅。多黏菌素號稱人類對抗細菌感染的最后一道防線。本文對南昌市食品源沙門菌分離株進行藥敏測定。并將4株多黏菌素耐藥株進行三代全基因組測序。比較基因組分析結果表明，4株菌均不攜帶能導致多黏菌素耐藥的基因mcr，但eptC、micA都存在基因突變，PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB系統(tǒng)存在的SNP位點可能是導致其耐多黏菌素的原因之一。本文結果為沙門菌耐多黏菌素的機制提供了新的數(shù)據(jù)參考。

關鍵詞：沙門菌；全基因組測序；耐藥；多黏菌素；基因突變

中圖分類號：R978.1? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0145-05

The Mutations of Polymyxin Resistance Genes of Foodborne Salmonella

Deng Ling1， Lu Xiao-ping1， Zhai Ping-ping2， Li Rui1

（1 College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic Universitya， Wuhan? 430023;2 Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute， Nanchang? 330000）

Abstract： The antimicrobial resistance of Salmonella poses a threat to human health. Polymyxin B is considered as last-line drug for bacterial infection. In this paper， four Polymyxin B-resistant Salmonella strains isolated from food sources were performed third generation whole-genome sequencing. The comparative genome analysis showed that the test strains did not carry mcr gene which was associated with polymyxin B resistance. However， the mutations on eptC and micA were found in the strains. The SNP sites present in PmrA/PmrB and PhoP/PhoQ system may be responsible for polymyxin B resistance of Salmonella in this paper. The results obtained in this paper provided new data for polymyxin B resistance research.

Key words： Salmonella;? ?whole genome sequencing;? ?antimicrobial resistance;? ?polymyxin B;? ?gene mutation

1 引言

沙門菌屬（Salmonella spp.）是一種常見的食源性致病菌，革蘭陰性、兼性、胞內細菌。1885年Salmon和Smith在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門菌，故定名為沙門菌屬[1]。在全球，尤其是發(fā)展中國家，每年大約有1600 萬人感染沙門菌，導致大約60萬人死亡[2]。在我國，由沙門菌引起的食源性中毒事件在食源性致病菌中毒事件中屢占首位（70%～80%）[3]。沙門菌感染最常見的原因是食用了被污染的肉、蛋或飲用被污染的牛奶[4]。

隨著新一代基因組測序的發(fā)展，基于全基因組測序（Genome-wide sequencing， WGS）的分子分型技術在食源性疾病聚集性病例的識別和暴發(fā)溯源調查中顯示出極大的應用價值和發(fā)展?jié)摿5]?；谌蚪M測序有助于食源性微生物開展遺傳與變異、致病與耐藥機制及菌種進化等方面的基礎研究。通過全基因組測序的結果，可以快速的完成對特異性基因之間比對，了解基因中存在的差異，從而解析耐藥與致病機制。

沙門菌耐藥性根據(jù)來源可以分為天然耐藥性和獲得性耐藥性[6]。天然耐藥性是沙門菌在自然界中賴以生存的一種特有性質；獲得性耐藥則可能是由于人類長時間在疾病治療和預防等方面對抗生素的應用不當造成的。多黏菌素是20世紀50年代發(fā)現(xiàn)的一種環(huán)肽類抗生素，于1947年在多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）中發(fā)現(xiàn)，對絕大部分革蘭陰性細菌具有抗菌活性[7]。臨床上常用的有多黏菌素B（Polymyxin B）和多黏菌素E（Colistin）。目前，多黏菌素已經(jīng)成為了治療多重耐藥病原菌引起嚴重感染的最后一道防線。但隨著病原菌的耐藥性進一步的加強，世界范圍內不斷有新的報道稱檢測出耐多黏菌素的致病菌[8]。沙門菌常見的多黏菌素耐藥機制有脂多糖修飾、質粒介導的多黏菌素耐藥、細菌在不利條件下分泌的多糖物質屏障、外排泵等[9]。目前國內研究者開展食源性沙門菌耐藥性研究時很少測定多黏菌素抗性[10-11]。但沙門菌臨床株多黏菌素耐藥性較為常見。浙江大學分析了沙門菌臨床株多黏菌素耐藥性，其中腸炎沙門菌（S. enteritidis）和鼠傷寒沙門菌（S. typhimurium）多黏菌素耐藥率分別高達83.9% （125/149） 和15.3% （9/59）[12]。因此很有必要開展食源性致病菌多黏菌素耐藥性監(jiān)測。

本文研究目的就是篩查44株沙門菌食源性菌株多黏菌素的耐藥性，再選取代表性耐藥菌株進行三代測序，采用比較基因組學技術分析多黏菌素耐藥相關的耐藥基因SNP突變，為多黏菌素耐藥機制研究提供新數(shù)據(jù)。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

樣本來源為2020年在江西南昌地區(qū)的多個菜市場的冷鮮、現(xiàn)殺或冰凍的雞肉與豬肉中分離到的44株沙門菌。沙門菌SAL-007（NCBI登錄號：CP071686.1）、SAL-020（CP071690.1）、SAL-045（CP071693.1）均分離自2020年食物中毒病人糞便樣本。

2.2 主要試劑

多黏菌素B（批號Y26A11H122615，武漢飛揚生物有限公司）、胰蛋白胨（批號20220303，青島海博生物公司）、氯化鈉（批號20161109，國藥集團化學試劑有限公司）、酵母提取物（批號4352785-02， OXOID）、MH肉湯（批號20220601，青島海博生物公司）、96孔細胞培養(yǎng)板（購自武漢華順生物有限公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 多黏菌素耐藥性測定

按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）方案[13]配制多黏菌素原液，用二倍稀釋法對多黏菌素進行梯度稀釋，稀釋范圍為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL。首先將44株沙門菌分批次進行37 ℃過夜培養(yǎng)。于超凈工作臺分別吸取4 mL實驗菌株到對應的10 mL EP管中。離心機8000 r/min離心5 min，去上清液，加入4 mL PBS溶液，移液槍吹打至沉淀完全重懸，重復操作2次。用濁度儀調節(jié)細菌菌懸液濃度到0.5麥氏單位（1×108 CFU/mL）并用MH溶液稀釋100倍待用。取96孔板按標記依次加入不同梯度的多黏菌素稀釋液50 μL、稀釋后菌液50 μL混合。陽性對照加入50 μL稀釋后菌液、MH溶液50 μL混合。陰性對照加入100 μL MH溶液。將96孔板置于生化培養(yǎng)箱，37 ℃，避光靜置18～24 h。以肉眼觀察到能抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度，記錄各菌株MIC濃度。大腸埃希菌ATCC25922作為質量控制菌。

2.3.2 全基因組測序數(shù)據(jù)分析與挖掘

以三代測序數(shù)據(jù)為主，采用二代測序進行補測及糾錯的策略進行全基因組測序。將多黏菌素耐藥菌株培養(yǎng)到OD0.6左右收集菌體，放置于EP管中，然后用干冰保存快遞到上海美吉生物公司進行Pacbio三代測序。利用SOAP denovo 2組裝測序原始序列得到完整的基因組序列。

使用PlasmidFinder軟件篩查質粒，通過在線工具PlasmidFinder 2.1、MobileElementFinder和PMLST預測質粒類型。使用快速注釋網(wǎng)站（RAST， Version2.0）對沙門菌的染色體以及質?；蜻M行注釋。利用Resfinder（Version4.1）和綜合抗生素研究數(shù)據(jù)庫（Comprehensive antibiotic resistance database， CARD）對耐藥基因進行預測注釋。以上海美吉生物公司與RAST預測的耐藥基因為準，用Resfinder和CARD進行校正。對于無法查證的基因則采用NCBI的BLAST進行比對確定。重點篩查mcr基因。然后將測序菌株的多黏菌素耐藥基因序列進行Blast分析，查找SNP位點，重點篩查PhoPQ系統(tǒng)和Pmr A/Pmr B系統(tǒng)相關基因的SNP突變。

2.3.3 基于CVTree構建進化樹

利用在線分析軟件CVTree 3（http：//tlife.fudan.edu.cn/cvtree/），將這四株菌全基因組序列導入系統(tǒng)一起做系統(tǒng)發(fā)育分析。

3 結果與分析

3.1 多黏菌素耐藥性測定

44株沙門菌中有3株對多黏菌素B中介（MIC≤2 μg/mL），有4株對多黏菌素B耐藥（MIC≥4 μg/mL），其余菌株為敏感型。菌株A7和A29-2的MIC為32 μg/mL，菌株A39的MIC值為8 μg/mL，菌株JXY0409-18的MIC值為4 μg/mL。

3.2 全基因組測序數(shù)據(jù)分析與挖掘

將4株多黏菌素耐藥株送至上海美吉生物公司進行測序處理。全基因組測序基本信息如測序深度、GC含量、耐藥基因種類等參見表1所示。由表1數(shù)據(jù)可知，4株菌都攜帶質粒和多種耐藥基因。

將4株沙門菌的質粒序列輸入相關軟件預測質粒類型，除了菌株JXY0409-18攜帶的一個小質粒無法進行分型外，其他質粒分類結果如表2所示。4株菌中僅有菌株A7和JXY0409_18攜帶耐藥質粒。其中菌株A7耐藥質粒只攜帶一種耐藥基因，即喹諾酮類耐藥基因qnrB。A7、A29-2、A39的耐藥基因主要位于染色體上。菌株JXY0409_18與此相反，染色體僅攜帶3種耐藥基因，如氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Iaa、aadA11和β-內酰胺類耐藥基因ampH，其余21種耐藥基因都位于質粒上。

3.3 基于CVTree的進化樹分析

將4株沙門菌測序株全基因組序列輸入到CVTree3，軟件將上傳的序列和系統(tǒng)內置的細菌序列信息比較后生成親緣關系樹，如圖1所示。4株菌分屬于不同分支，根據(jù)與它們親緣關系相近的菌株顯示的血清型信息，可知A7屬于S.give，A29-2屬于S.kentucky，A39屬于S.typhimurium，JXY0409-18屬于 S.schwarzengrund。

3.4 多黏菌素耐藥基因SNP突變分析

對多黏菌素相關耐藥基因進行分析。經(jīng)篩查4株菌均不攜帶導致多黏菌素耐藥的mcr基因。文獻報道PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)存在SNP位點也可導致多黏菌素耐藥[14]。沙門菌臨床株SAL-007、SAL-020、SAL-045 均是腸炎沙門菌，且都對多黏菌素敏感，將4株多黏菌素耐藥菌和這3株敏感菌一起對比，篩查PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)的基因突變，包括eptA、eptB、eptC、pmrA、pmrB、mgrB、 micA、phoP、phoQ、lpxA、lpxC和lpxD。最后發(fā)現(xiàn)和敏感菌相比，耐藥株在eptC、micA基因上均存在少量共同的SNP突變（表3），其他基因則沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的SNP突變。敏感菌在這些基因上未發(fā)現(xiàn)SNP突變。

4 討論與結論

本文發(fā)現(xiàn)江西省食品源沙門菌中有9%（4/44）耐多黏菌素，通過全基因組測序分析，可知4株沙門菌均不攜帶多黏菌素耐藥基因mcr，而mcr是導致沙門菌耐多黏菌素最主要的耐藥基因[15-16]。除此之外，PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)對多黏菌素耐藥有調控作用[17]。多黏菌素主要是通過破壞革蘭陰性菌細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的結構來發(fā)揮殺菌作用的。通過與LPS帶負電荷的脂質A成分相互作用，多黏菌素將帶正電的殘基（例如4-氨基-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）、磷酸乙醇胺（PEtn）添加到LPS中，減少細菌表面上的負電荷，從而降低LPS的穩(wěn)定性并破壞外膜的完整性，達到殺滅細菌的目的[18]。PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB系統(tǒng)可調控L-Ara4N、PEtn的合成，影響其添加到LPS中，因此PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB調控系統(tǒng)及其調節(jié)器的突變會阻礙多黏菌素與細菌的結合，減弱多黏菌素的殺菌作用[6]。文獻證實PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)上的基因突變可導致多黏菌素耐藥[19-20]，通過比較多黏菌素耐藥菌和敏感菌，發(fā)現(xiàn)4株多黏菌素耐藥菌株雖然血清型不同，親緣關系較遠，但在eptC、micA基因上均存在少量共同的SNP突變，這可能是導致多黏菌素耐藥的原因。本文在eptC、micA上發(fā)現(xiàn)的部分SNP突變位點目前未發(fā)現(xiàn)同類文獻報道，這些SNP位點導致的基因表達變化和多黏菌素耐藥效果還有待進一步實驗證實。

質粒介導的耐藥是獲得性耐藥的主要傳播方式。多黏菌素耐藥基因mcr主要位于耐藥質粒上[21]。本文測序的4株菌耐藥基因主要位于染色體上，僅僅一株菌JXY0409_18質粒上攜帶多種耐藥基因。但4株菌都不攜帶mcr基因。因此南昌市食品源沙門菌多黏菌素耐藥主要是固有耐藥。

多黏菌素耐藥機制較為復雜，近年來消毒劑和抗生素的過度頻繁使用可能誘導PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB系統(tǒng)產生更多的基因突變，導致更多多黏菌素耐藥菌的產生，因此對耐藥菌進行全基因組測序分析，有助于解析耐藥機制，跟蹤細菌耐藥基因突變狀況。

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收稿日期：2022-10-29

基金項目：江西省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（GSJK202104）。

作者簡介：鄧靈，研究生，主要從事食品微生物的研究工作。

*通訊作者：李睿，教授，主要從事食品微生物與食品安全的研究工作。