鄧紅梅，溫兆毅，柳鏡炬，王 春

（廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心，廣東茂名 525000）

龍眼是茂名等岒南地區(qū)特色的水果之一，其果肉營養(yǎng)豐富，有滋補強體、補益心脾、養(yǎng)血安神、益智寧心等多種功效。龍眼果肉含糖高達20 %，風味好，具有很高的營養(yǎng)價值，因此龍眼是釀造果酒的優(yōu)質(zhì)原料[1]。以龍眼為原料，低溫發(fā)酵，陳釀而成的發(fā)酵果酒，具有益氣補血、安神定志、降脂護心、延緩衰老等保健功能[2]。龍眼果酒中，富含維生素、有機酸及含氮物質(zhì)，其中有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成、消炎和抗癌等作用，是果酒中主要的呈味物質(zhì)。有機酸含量高低與果酒的品質(zhì)和藥用價值有著極其密切的關系[3-7]。本課題組之前研究了不同初始糖度條件下，龍眼酒發(fā)酵過程中有機酸成分和含量的變化規(guī)律[6]，本實驗利用高效液相色譜法分析不同初始酸堿度對龍眼酒發(fā)酵過程中有機酸動態(tài)變化規(guī)律的影響，找到口感最佳的發(fā)酵條件，為龍眼酒釀造過程中有機酸的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：龍眼品種為石硤，購于茂名農(nóng)貿(mào)市場；高活性干酵母，安琪酵母股分有限公司。

試劑及耗材：蔗糖、果膠酶、偏重亞硫酸鉀為食品級，磷酸二氫鉀、草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、草乙酸為標準品，甲醇為色譜純。

儀器設備：LC20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；BSP-250 恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BCD-246WTM(E) 美的冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2電動離心機，常州澳華儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JA1003 電子分析天平，上海上天精密儀器有限公司；WZ 系列手持折光糖度計，上海聚亮光學儀器有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度計，漳州市新奧光電儀器有限公司；UV5500PC 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍眼酒釀造工藝

龍眼→分選→清洗→去殼去核→攪碎→加果膠酶酶解→過濾除渣→成分調(diào)節(jié)→加活化后的果酒酵母→前發(fā)酵→澄清、換罐→后發(fā)酵→成品→檢測

1.2.2 操作要點

（1）挑選新鮮完整的龍眼去殼去核獲得石硤龍眼2500 g，加入偏重亞硫酸鉀1.25 g，防止果肉氧化。

（2）攪碎時按果肉∶超純水的體積比=3∶1 的比例加入超純水800 mL，按果肉∶檸檬酸的質(zhì)量比=5000∶1 的比例加入檸檬酸0.5 g，按果肉∶果膠酶的質(zhì)量比=1250∶1 的比例加入果膠酶2.0 g 處理3 h，攪碎完成后，將果汁過濾裝入5 L玻璃發(fā)酵罐中。

（3）添加檸檬酸調(diào)整pH 值分別為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五個初始酸堿度（pH）梯度，進行二組平行實驗。按果肉∶酵母的質(zhì)量比=50000∶7 的比例加入活化酵母菌0.35 g，22%蔗糖，在20 ℃下進行發(fā)酵。7 d后過濾除渣、換罐、封閉進行后發(fā)酵。

（4）在發(fā)酵前取果汁，第7 天龍眼酒的主發(fā)酵基本完成時取酒樣；第14 天、第21 天、第28 天以及第35 天龍眼酒發(fā)酵完成時取酒樣，研究8 種有機酸在發(fā)酵過程中的含量變化。

1.2.3 龍眼酒中有機酸含量的測定

樣品處理及色譜條件均與文獻[6]相同。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準曲線及色譜圖

以不同濃度的有機酸為橫坐標，以峰面積為縱坐標，做標準曲線，得出線性回歸方程和相關系數(shù)R2，如表1所示。

由表1 可知，8 種有機酸標準曲線相關系數(shù)R2＞0.999，表明高效液相色譜法（HPLC）可以用于果酒中有機酸的測定，測定結果準確度高。

表1 有機酸標準曲線回歸方程和相關系數(shù)

2.2 不同初始酸堿度（pH）龍眼酒發(fā)酵過程中8 種有機酸含量的變化

以有機酸含量為縱坐標，發(fā)酵時間（果汁定為0）為橫坐標，用Origin Pro 8 軟件做出龍眼酒發(fā)酵過程有機酸含量變化。

從圖1—圖5 可知，在不同初始酸堿度條件下，龍眼酒發(fā)酵過程中8 種有機酸的變化有相似性。在主發(fā)酵期間（前7 d），酒石酸、蘋果酸含量明顯下降，乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量明顯增加；發(fā)酵28～35 d，草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸最終含量均比果汁中含量低；草酸、α-酮戊二酸含量變化不大，一直保持緩慢下降趨勢，草乙酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸的最終含量比果汁中含量有所提高。

圖1 初始pH 3.0發(fā)酵過程有機酸含量變化

圖2 初始pH 3.3發(fā)酵過程有機酸含量變化

圖3 初始pH 3.6發(fā)酵過程有機酸含量變化

圖4 初始pH 3.9發(fā)酵過程有機酸含量變化

圖5 初始pH 4.2發(fā)酵過程有機酸含量變化

經(jīng)過35 d 的發(fā)酵與陳釀，不同初始酸堿度釀造的龍眼果酒中8 種有機酸與龍眼果汁中的有機酸比較可得出變化規(guī)律，見表2。

果汁和果酒中的有機酸是非常重要的一類化合物，有機酸的含量以及分布顯示了果汁和果酒的感官質(zhì)量(包括風味、顏色和香氣)、穩(wěn)定性和微生物活動狀況等[8]。有機酸在不同的果酒中，甚至是同種水果不同發(fā)酵工藝釀制的果酒，種類及含量均存在較大差異，導致不同果酒風味各異[6，7-9，10]。發(fā)酵過程酵母的代謝包括酒精發(fā)酵、乙酸或蘋果酸-乳酸發(fā)酵。酵母代謝離不開酶，酶活性又受pH 值的影響，pH 值過高或者過低都會使酶活性降低或失活，只有在最適pH 值，酶活性才能最高。酶活性高低會直接影響產(chǎn)物（包括有機酸）含量變化。

由表2 可知，經(jīng)過35 d 發(fā)酵與陳釀后，不同初始酸堿度對8 種有機酸的影響有差異。草酸在整個發(fā)酵過程含量（相對果汁）都是下降的，不同pH間含量變化不大，即受初始酸堿度的影響很??；初始酸堿度pH≤3.9 時酒石酸在各初始酸堿度間含量下降幅度變化不大，在21 %～23 %之間，當pH4.2時，降低幅度達41.07%，說明龍眼酒中可能存在酒石酸的解離平衡，初始酸堿度增加，有利于酒石酸解離，酒石酸根離子增加，與其中的陽離子結合形成酒石酸鹽；檸檬酸含量隨著初始酸堿度的增加而減少；乳酸和蘋果酸的含量隨著初始酸堿度的增加而增加。主要原因是由于不同pH 值對代謝途徑中酶活性的影響不同。

本實驗研究了pH 值為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五個初始酸堿度梯度，在20 ℃下低溫發(fā)酵釀造龍眼酒，通過對龍眼酒色澤、香氣、酒體、風味進行評價，一致認為初始pH3.6～3.9 發(fā)酵釀制的龍眼酒品質(zhì)最佳。

2.3 pH3.9時龍眼酒有機酸含量動態(tài)變化規(guī)律

8種有機酸標準色譜圖見圖6，pH 3.9時龍眼酒發(fā)酵過程中8種有機酸的色譜圖見圖7—圖11。

圖6 標準溶液色譜圖

圖7 pH 3.9發(fā)酵第7天色譜圖

圖8 pH 3.9發(fā)酵第14天色譜圖

圖9 pH 3.9發(fā)酵第21天色譜圖

圖10 pH 3.9發(fā)酵第28天色譜圖

圖11 pH 3.9發(fā)酵第35天色譜圖

通過對各有機酸峰面積計算得到初始酸堿度pH3.9時石峽龍眼酒有機酸含量變化，見表3。

由表3 可知，不同發(fā)酵時期8 種有機酸的總量均比原果汁高，發(fā)酵前7 d有機酸變化最明顯，其余時期基本上是平穩(wěn)變化。表明發(fā)酵過程中有機酸的增加與發(fā)酵同步，這對果酒的風味及維持酸性環(huán)境抑制有害細菌達到長久儲存的目的是有益的，與之前研究不同初始糖度對龍眼酒釀造過程中有機酸變化規(guī)律相似[6]。在整個發(fā)酵與陳釀過程中，草酸、酒石酸和蘋果酸含量均比原果汁下降，草酸、酒石酸含量變化主要是由于形成了相應的草酸鹽和酒石酸鹽，同時，酒石酸也能被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸。酒石酸的含量先降后升，可能是伴隨發(fā)酵產(chǎn)生的各種代謝物會引起發(fā)酵液中pH 變化，影響酒石酸鹽的穩(wěn)定性，導致酒石酸含量的變化。乳酸是龍眼汁和龍眼酒中含量最大的有機酸，在發(fā)酵過程中，乳酸處于積累的過程，與此同時，蘋果酸則表現(xiàn)出消耗的過程，是由于發(fā)酵時一直存在著能生成乳酸的代謝途徑——蘋果酸-乳酸發(fā)酵[11]。草乙酸、琥珀酸和檸檬酸的含量在主發(fā)酵（7 d 前）均比原果汁明顯上升，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，含量變化趨于穩(wěn)定。琥珀酸主要來自糖分子的發(fā)酵作用，是酒精發(fā)酵的正常發(fā)酵產(chǎn)物，少量來自于果汁中谷氨酸的變化，谷氨酸存在時，琥珀酸積累增多[12-13]。由于蘋果酸、酒石酸含量的減少，乳酸、琥珀酸含量的增加，使龍眼酒的口感變得更加柔順細膩、潤滑和醇厚[6，14]。

表3 初始酸堿度pH 3.9時龍眼酒各時期有機酸的含量

酸類是形成酒香味的主要物質(zhì)之一，酒中缺乏酸會使酒顯得不柔和、不協(xié)調(diào)。酸類是形成酯類的前體物質(zhì)，還可以構成其他香味成分。適量的酸在酒中能起到緩沖作用，消除口味的不協(xié)調(diào)，促進酒的甜味感。初始酸堿度pH3.9 釀制的龍眼酒中主要的有機酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、蘋果酸（2611.7 mg/L）、檸檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），還有少量的草酸（125.1 mg/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L）。乳酸是一種略帶酸味的一元弱酸，能使果酒口感柔和、圓潤；琥珀酸具有酸味及輕微的咸味和苦味，易溶于酒，使酒味調(diào)和，最具有味覺特征，可使酒的味道濃重，增加醇厚感[15]。

3 結論

在不同初始酸堿度條件下，龍眼酒發(fā)酵過程中8 種有機酸的變化有相似性。在發(fā)酵前7 d，酒石酸、蘋果酸含量明顯下降，乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量明顯增加；發(fā)酵第28～35 d，草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸最終含量均比果汁中低；草酸、α-酮戊二酸含量變化不大，一直保持緩慢下降趨勢；草乙酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸的最終含量比果汁中含量高。經(jīng)過35 d 發(fā)酵與陳釀后，不同的初始酸堿度對8 種有機酸的影響是有差異的。草酸在整個發(fā)酵過程含量（相對果汁）都是下降的，不同pH間含量變化不大，即受初始酸堿度的影響很??；初始酸堿度pH≤3.9 時酒石酸在各初始酸堿間含量下降幅度變化不大，但在初始酸堿度pH4.2 時，降低的含量是其他初始酸堿度的近一倍；蘋果酸初始酸堿度pH≤3.6 時降低的含量相當于pH＞3.6 時的1倍；檸檬酸含量隨著初始pH 的增加而減少；乳酸含量隨著初始pH的增加而增加。

在pH 3.9 條件下，不同發(fā)酵時期8 種有機酸的總和均比原果汁高，其中發(fā)酵前7 d 有機酸變化最明顯，其余時期基本上平穩(wěn)變化。在整個發(fā)酵與陳釀過程中，草酸、酒石酸和蘋果酸含量均比原果汁明顯下降；草乙酸、琥珀酸和檸檬酸的含量在主發(fā)酵（7 d 前）時均比原果汁明顯上升，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，含量變化趨于穩(wěn)定。主要的有機酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、蘋果酸（2611.7 mg/L）、檸檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），還有少量的草酸（125.1m g/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L），各種有機酸相互調(diào)和使龍眼酒風味獨特。