王成俊，李玲珊，范 梅，劉 君，3*，袁思棋*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；3.釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol，簡稱4-EG；CAS No.2785-89-9)，化學(xué)名為4-乙基-2-甲氧基苯酚，呈木香、煙味、香辛料和甜香蘭素風(fēng)味，具有緩和咸味等作用[1]。4-EG 是醬香型白酒重要的微量香氣成分，茅臺酒中含0.025 mg/L 的4-EG 時(shí)，賦予茅臺悠香醇厚風(fēng)味，凸顯其醬香風(fēng)味[2]。此物質(zhì)因具有醬香特征成為醬油的重要香氣物質(zhì)，醬油中蛋氨酰與4-EG 的含量分別為3.99 mg/L 與0.3 mg/L 時(shí)，能讓醬油呈現(xiàn)最佳風(fēng)味[3]，在一定程度上減輕醬油的咸味，使味道呈現(xiàn)圓滑的效果[4]，還具有增香、防腐、殺菌等作用[1，5]。4-EG具有良好的活性氧消除功能，在抗氧化和預(yù)防心血管等多種疾病方面有一定作用[6-8]，是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)和健康因子之一[9-10]，被廣泛應(yīng)用于酒類、醬油、飲料、食品、煙草等行業(yè)[1，3-5，11]。

目前，生產(chǎn)4-EG 的方法有直接提取法[12]、人工合成法[13-14]、生物轉(zhuǎn)化法[15-16]。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)4-EG 是目前應(yīng)用較為廣泛的方法，具有反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)周期短，價(jià)格低廉，環(huán)境友好和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[15-17]，已引起各國研究者的高度關(guān)注。本研究擬從醬香型大曲中分離具有產(chǎn)4-EG能力的芽孢桿菌類微生物作為目的菌株并探索其耐受條件，旨在為后續(xù)研究4-EG 的生物合成及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

醬香型大曲：來自于某酒業(yè)有限公司制曲車間。

1.1.2 試劑

4-乙基愈創(chuàng)木酚（C9H12O2，色譜級，CAS No.2785-89-9）標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海源葉科技生物有限公司。其他試劑和藥品均購于國內(nèi)相關(guān)公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：TSQ8000（安捷倫公司，美國）；PCR 儀：5020（Thermo Fisher 公司，美國）；可見光分光光度計(jì)：UV-1800 型（翱藝儀器上海有限公司）等。

1.1.4 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖試驗(yàn)培基、蔗糖試驗(yàn)培養(yǎng)基、乳糖試驗(yàn)培養(yǎng)基、淀粉試驗(yàn)培養(yǎng)基、VP試驗(yàn)培養(yǎng)基等培養(yǎng)基（表1）。富集培養(yǎng)基用于目的菌株的分離培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基只添加麩皮作為發(fā)酵前體物質(zhì)進(jìn)行目的菌株的復(fù)篩，葡萄糖培養(yǎng)基用于生理生化試驗(yàn)，淀粉培養(yǎng)基用于檢驗(yàn)菌株是否能分解淀粉，VP 培養(yǎng)基用于生理生化鑒定。

表1 培養(yǎng)基

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離及篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng)

稱取10 g 大曲，粉碎后加入到50 mL 富集培養(yǎng)基中，185 r/min 振蕩培養(yǎng)4 h，取10 mL 于80 ℃水浴鍋中處理30 min，靜置，取1 mL 上清液加入到裝有50 mL 的富集培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過夜。

1.2.1.2 初篩

過夜培養(yǎng)的菌懸液按10 倍梯度稀釋到10-7，分別取10-5、10-6、10-7的稀釋液0.1 mL 涂布于分離培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落形態(tài)大小、顏色等挑取菌落劃線分離純化，將純化后的純菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。過濾發(fā)酵液，通過GC-MS 檢測4-EG 相對含量，選擇出產(chǎn)4-EG 較高的菌株進(jìn)行后續(xù)復(fù)篩。

1.2.1.3 復(fù)篩

初篩分離得到的菌株經(jīng)活化后，培養(yǎng)成種子菌懸液，按5 %的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)6 d，同時(shí)設(shè)置空白組。過濾發(fā)酵液，通過GC-MS檢測4-EG相對含量。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定

復(fù)篩得到的目的菌株，將其菌懸液梯度稀釋后，涂布于平板上，37 ℃培養(yǎng)32 h，觀察菌落形態(tài)，挑單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，用光學(xué)顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)。

1.2.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

分子系統(tǒng)學(xué)鑒定：離心收集對數(shù)期的培養(yǎng)菌液，采用Bacterial DNA Kit 試劑盒提取總DNA，提取得到的總DNA 采用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。以目標(biāo)菌株的總DNA 為模板，采用16S rDNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增后產(chǎn)物送至上海生物生工公司進(jìn)行測序。測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行人工比對和校正，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 進(jìn)行比對和數(shù)據(jù)相似性分析，借助MEGA7.0 軟件[18]，將目的基因序列與相關(guān)序列用Clustal W 算法進(jìn)行序列比對，利用p-distance計(jì)算[19]并構(gòu)建N-J法系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.2.3 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)

菌株生理生化鑒定包括接觸酶試驗(yàn)、厭氧生長試驗(yàn)（澆筑法）、檸檬酸鹽試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)的操作流程按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。

1.2.4 菌種耐受性分析

1.2.4.1 耐酒精能力測定

分別制備初始酒精度為0、4 %vol、8 %vol、10 %vol 和12 %vol 的LB 液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的目的菌株按2%的接種量分別接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、185 r/min 培養(yǎng)24 h，600 nm 測其吸光度，每個(gè)樣品平行測3次取其平均值。

1.2.4.2 耐酸性能力測定

分別制備初始pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的LB 液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的目的菌株按2 %的接種量分別接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、185 r/min 培養(yǎng)24 h，600 nm 測其吸光度，每個(gè)樣品平行測3 次取其平均值。

1.2.4.3 耐糖性能力測定

分別制備初始葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 %、5 %、10 %、15 %、20 %、25 %的LB 液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的目的菌株按2 %的接種量分別接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、185 r/min 培養(yǎng)24 h，600 nm 測其吸光度，每個(gè)樣品平行測3次取其平均值。

1.2.5 4-EG的GC-MS分析

初篩發(fā)酵液前處理方式：各發(fā)酵液在8000 r/min下離心5 min，離心2 次，得到的上清液用0.22 μm過濾器過濾，將濾液和95%乙醇1∶1 均勻混合。通過GC-MS進(jìn)行檢測，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液前處理方式：將發(fā)酵液8000 r/min 離心5 min，離心2 次，取離心后的發(fā)酵液5 mL，加氯化鈉（約1.4 g）至飽和，振蕩搖勻，加入2 mL 二氯甲烷，振蕩搖勻后充分萃取1 min，8000 r/min離心5 min，取下層清液，進(jìn)行定量測定[20]。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，初始溫度250 ℃；分流模式；初始柱溫50 ℃，保持1 min，以30 ℃/min 的速度升溫至280 ℃，保持2 min，分析時(shí)間10 min。

質(zhì)譜條件：全掃描模式；離子源溫度280 ℃；掃描范圍40～500 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及形態(tài)學(xué)觀察

醬香型大曲樣品經(jīng)過多次稀釋和劃線分離，根據(jù)平板上菌落的形態(tài)、顏色、菌落邊緣隆起情況、菌落的透明度等菌落特征（表2），并聞香初步識別篩選分離獲得10 株目的菌株。從形態(tài)上判斷10 株菌株均為細(xì)菌，分別對這些菌株進(jìn)行產(chǎn)4-EG試驗(yàn)。

以上10 株篩選獲得的菌株，觀察菌落形態(tài)（表2），結(jié)果表明所有菌株的形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示在培養(yǎng)基上生長時(shí)一部分菌株菌落顏色為奶白色，另一部分為半透明，菌落扁平，除菌株wsp-3-3 邊緣不規(guī)則外，其余菌株的邊緣均表現(xiàn)出規(guī)則狀態(tài)，僅有菌株wsp-1-3菌落較小，其余菌落均較大。

對所有篩選的目的菌株進(jìn)行3 次革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)（表3），結(jié)果顯示，除wsp-2-2 和wsp-4-1 外，其余均為革蘭氏陽性菌（圖1、圖2）。菌株wsp-2-2菌株的3 次染色實(shí)驗(yàn)在顯微鏡下觀察為紅紫色，少量芽孢未染色成功，呈現(xiàn)藍(lán)色（圖2），判斷為革蘭氏陰性菌，同樣，菌株wsp-4-1 為革蘭氏陰性菌（圖2）。

圖1 菌株wsp-3-1革蘭氏染色和芽孢染色

圖2 菌株wsp-2-2和wsp-4-1革蘭氏染色和芽孢染色

表3 菌株革蘭氏染色結(jié)果

2.2 菌株產(chǎn)4-EG能力測定

產(chǎn)4-EG 試驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過前處理后利用GC-MS 檢測發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性組分，以揮發(fā)性組分中的4-EG 含量為基準(zhǔn)，篩選獲得4-EG 產(chǎn)量較高的菌株（圖3）。外標(biāo)法確定4-EG 的線性方程為y=2076576454.970x-135388350.970（R2=0.9927＞0.99），可計(jì)算出各單菌落發(fā)酵液中4-EG 的含量（圖3）。

根據(jù)測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖3），除空白組外，其余菌株全部檢測出4-EG，wsp-3-1 發(fā)酵液中4-EG含量最高為149.53 μg/L，菌株wsp-2-2 的發(fā)酵液中4-EG 含量為141.30 μg/L，其余菌株相對較低（130 μg/L左右）。

將以上產(chǎn)量較高的菌株wsp-2-1、wsp-2-2、wsp-3-1 和wsp-4-1 進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵液經(jīng)過改良的前處理后進(jìn)行GC-MS 檢測，復(fù)發(fā)酵后菌株wsp-2-2 中4-EG 產(chǎn)量為245.3 μg/L，明顯高于菌株wsp-3-1中4-EG含量（121.3 μg/L），其余菌株產(chǎn)量均低于120 μg/L。

2.3 部分生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

挑選產(chǎn)4-EG 較多的菌株wsp-2-1、wsp-2-2、wsp-3-1 和wsp-4-1 進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 生理生化結(jié)果

4株目的菌株革蘭氏染色、芽孢染色、接觸酶試驗(yàn)、運(yùn)動性試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、淀粉分解試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、明膠分解試驗(yàn)均為陽性，葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、乳糖分解試驗(yàn)為陰性。厭氧生長實(shí)驗(yàn)菌株wsp-3-1 為陽性，蔗糖分解試驗(yàn)菌株wsp-4-1 為陰性。

查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的描述，發(fā)現(xiàn)以上4 株菌株有芽孢桿菌屬或類似芽孢桿菌屬微生物的特征，需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定。

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

提取菌株wsp-2-1、wsp-2-2、wsp-3-1、wsp-4-1 的基因組DNA，以總DNA 為模板，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增獲得16S rDNA 序列，擴(kuò)增后的目標(biāo)片段約1500 bp（圖4）。

圖4 菌株DNA PCR產(chǎn)物電泳圖

根據(jù)擴(kuò)增片段測序結(jié)果，菌株wsp-2-1、wsp-3-1、wsp-4-1 經(jīng)過多次DNA 擴(kuò)增，測序結(jié)果均為雙峰，以上3 菌株暫時(shí)未進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用NCBI 提供的BLAST 程序?qū)⒕陊sp-2-2 的PCR 測序結(jié)果與GenBank 中已注冊的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示，該菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的幾個(gè)種之間同源性均達(dá)到98%以上。因此，初步判斷菌株wsp-2-2 屬于芽孢桿菌屬Bacillus物種。

下載同源性已知序列和本實(shí)驗(yàn)中的序列進(jìn)行MEGA7.0 比對和人工校正，采用基于p 距離（pdistance）的鄰近法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。除Bacillus mesophilusACCC03113（序列號MK881071.1）序列長度為956 bp 外，其余菌株的序列長度在1415 bp 左右；堿基T、C、A、G 平均比例分別為20.8、23.0、25.6、30.7，菌株wsp-2-2 與上述平均比例基本一致（表5）。

表5 序列簡介組成情況

根據(jù)序列的所有信息，選用p 距離（p-distance）和替換模型為轉(zhuǎn)換和顛換（substitutions to include d:Transitions +Transversions）進(jìn)行序列間遺傳距離計(jì)算，所有序列的遺傳距離為0.000～0.073 之間，平均遺傳距離為0.029。菌株wsp-2-2 遺傳距離與Bacillus circulansATCC4513（0.06）、Bacillus oleroniusATCC700005（0.072）和Bacillus mesophilusACCC03113（0.066）均大于平均遺傳距離，推測菌株wsp-2-2 直接的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)，與其余的物種距離較近（＜0.029）。

基于以上序列信息，采用p 距離（p-distance）和替換模型為轉(zhuǎn)換和顛換（substitutions to include d:Transitions+Transversions）構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），可以看出：（1）Bacillus circulansATCC4513、Bacillus oleroniusATCC700005 和Bacillus mesophilusACCC03113 聚為一個(gè)單系，其余物種全部聚為一個(gè)單系；（2）菌株wsp-2-2 的序列與蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusATCC14579 聚為一支（自展值為85），表現(xiàn)出很近的親緣關(guān)系。上述結(jié)果與遺傳距離的結(jié)果基本一致。

圖5 基于p距離的菌株wsp-2-2構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹

表6 基于p距離的序列間遺傳距離(替換模型為轉(zhuǎn)換和顛換)

因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，菌株wsp-2-2 確認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus，命名為Bacillus cereuswsp-2-2。

2.5 耐受性分析

根據(jù)單菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)4-EG 的能力，選取菌株wsp-2-2進(jìn)行耐受性分析。

2.5.1 耐酒精能力的測定

對篩選得到的蠟樣芽孢桿菌wsp-2-2 進(jìn)行耐酒精能力的測定，從圖6 可以看出，隨著培養(yǎng)基中酒精濃度增加，在吸光度為600 nm 時(shí)的OD 值呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，當(dāng)酒精濃度達(dá)到8%vol 時(shí)，菌株wsp-2-2 表現(xiàn)出基本上不生長，OD 值接近0，即在酒精濃度超過8 %vol 時(shí)菌株的生長受到明顯抑制。

圖6 菌株wsp-2-2耐酒精能力

2.5.2 耐糖能力的測定

對篩選得到的菌株wsp-2-2 進(jìn)行耐糖能力的測定（圖7），結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中糖度增加，在吸光度為600 nm 時(shí)的OD 值呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢?？赡苁请S著糖度的不斷增加，當(dāng)糖度為10%時(shí)，菌株能夠充分利用糖進(jìn)行生長，提供生長充足的碳源和良好的生長環(huán)境；當(dāng)糖度小于10 %時(shí)，提供的碳源相對不足，造成生長速度相對緩慢；當(dāng)糖度大于10 %時(shí)（特別是超過15 %時(shí)），糖度較高形成了高滲透壓的環(huán)境，生長曲線急劇下降，使菌的生長受到了顯著的限制。

2.5.3 耐酸能力的測定

對篩選得到的菌株wsp-2-2 進(jìn)行耐酸能力的測定（圖8），結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中pH 值不斷上升，OD600nm呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，當(dāng)pH 值小于5時(shí)，OD600nm基本接近0，菌株的生長明顯受到抑制，當(dāng)pH 值為5.5 時(shí)，菌株基本上可以正常生長，說明該菌株在偏酸性的培養(yǎng)基或者培養(yǎng)環(huán)境中生長。

圖8 菌株wsp-2-2耐酸能力

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以醬香型大曲為原料，進(jìn)行80 ℃高溫處理，經(jīng)過富集、初篩和復(fù)篩，以及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得4-EG 含量最高的菌株為wsp-2-2（245.3 μg/L）。生理生化試驗(yàn)顯示，菌株wsp-2-2 革蘭氏染色鏡檢陰性，葡萄糖試驗(yàn)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能分解蔗糖和淀粉，不能分解乳糖，接觸酶試驗(yàn)呈陽性，明膠分解試驗(yàn)呈陽性，運(yùn)動性試驗(yàn)呈陽性，VP 試驗(yàn)呈陽性，都符合芽孢桿菌屬的描述，初步判定為芽孢桿菌屬物種。通過16S rDNA 測序，在NCBI 上Blast 比對后可以確定其種屬，菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示菌株wsp-2-2 為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。菌株wsp-2-2 耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明菌株wsp-2-2 耐4 %vol 酒精度、15 %的糖度和pH5.5 的酸堿度，為白酒生產(chǎn)中控制4-EG 的含量提供了一定的參考，也為生產(chǎn)健康保健功效的醬香型白酒打下了基礎(chǔ)。