李朝云，唐平華，羅 平，付宇豪，曾祥衛(wèi)，佘露露*

(1.仁懷醬香白酒科研所，貴州遵義 564500；2.貴州茅臺鎮(zhèn)北街酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司，貴州遵義 564500)

醬香白酒是中國特有的一種高度蒸餾酒，生產(chǎn)過程中采用高溫制曲工藝，使其富集了大量的微生物和酶系[1]。在發(fā)酵前期積累和富集大量的香味物質(zhì)，在陳放過程中，大曲繼續(xù)網(wǎng)羅空氣和環(huán)境中的微生物使其微生物群落更加豐富，微生物菌群在整個發(fā)酵過程不斷演替，充分利用高粱和大曲中的各類物質(zhì)，形成醇厚豐滿的醬香型白酒基酒[2-4]。大曲作為釀酒糖化劑，主要是提供多樣的微生物用于產(chǎn)酒和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[5]，同時補充了生產(chǎn)過程中的淀粉含量，有利于提高白酒產(chǎn)量[6]。分析大曲微生物的多樣性，可以更好的了解大曲中的微生物種類和數(shù)量，為酒類風(fēng)味物質(zhì)的形成和微生物的選育提供理論依據(jù)[7]。

第二代高通量測序技術(shù)可以更加精確、快速的分析樣品中微生物結(jié)構(gòu)，成為白酒生產(chǎn)過程中微生物菌群研究的主要手段[8]。在制曲中，發(fā)酵初期曲塊處于常溫狀態(tài)，適宜酵母大量增殖，在發(fā)酵過程中，溫度逐漸升高，酵母菌生長被抑制，在發(fā)酵中后期僅能少量或不能檢出酵母，但是可檢出大量細(xì)菌和霉菌等[9]；在堆積過程中，初期主要是酵母的富集過程，在堆積前后酵母數(shù)量明顯增加，且增加幅度有1～3 個數(shù)量級，增加幅度因堆積輪次和車間不同而略有差異[10-12]。

仁懷產(chǎn)區(qū)現(xiàn)階段對醬香白酒生產(chǎn)工藝已經(jīng)建立較完整的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，但未從醬香白酒生產(chǎn)過程微生物菌落演替方面詮釋醬香白酒生產(chǎn)過程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。探明大曲中微生物的種類和數(shù)量，是探究醬香白酒風(fēng)味形成不可或缺的一部分。以陳放1 個月、4 個月、6 個月的大曲為研究對象，探究陳放不同時間大曲中的菌群結(jié)構(gòu)，為后續(xù)探究醬香白酒風(fēng)味形成夯實基礎(chǔ)，對仁懷醬香型白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義，并為地方產(chǎn)業(yè)的推進(jìn)及進(jìn)步提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：1 個月、4 個月、6 個月黃曲、黑曲、白曲分別命名為：XH、XK、XB、FH、FK、FB、SH、SK、SB，大曲樣品來自貴州茅臺鎮(zhèn)北街酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司曲房陳放大曲，將所得大曲粉碎后用四分法進(jìn)行縮分取樣、備用。

試劑：試劑盒Illmina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2(FC-402-4023 500 Cycle)等。

儀器設(shè)備：PCR 擴(kuò)增儀（2720），美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳儀（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（BG-gdsAUTO(130)），北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

醬香大曲樣品由四川帕諾米克生物科技有限公司測序，PE250 測序方式，采用Qiagen Powersoil pro 試劑盒提取黃曲、黑曲和白曲樣品中的DNA。在細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物Primer5'-3'：515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），PCR 擴(kuò)增用酶為TOYOBO KO EPlus-Neo DNA Polymerase（KOD-401B），擴(kuò)增體系為50μL：5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL 上游 引 物U515F，1.5 μL 下 游 引 物U806R，1 μL KOD-Plus-Neo(1U/μL)，2 μL DNA 模板，31 μL 超純水。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃1 min，1個循環(huán)；變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s，25～30 個循環(huán)；72 ℃5 min，1 個循環(huán)；4 ℃保溫。每個樣本進(jìn)行3 次PCR 技術(shù)重復(fù)，取線性期PCR 產(chǎn)物等量混合后用于后續(xù)建庫[13]。

擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用2%的瓊脂糖凝膠，每個樣本進(jìn)行3 次重復(fù)，取線性期PCR 產(chǎn)物等量混合后用NEW ENGLAND BioLabs 公司NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫。進(jìn)一步在Illumina HiSeq 2500測序平臺開展高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測序所得序列通過FLASH 拼接雙端序列、過濾去除低質(zhì)量序列，基于Uchime 算法和gold數(shù)據(jù)庫去除嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)Effiective Tag。基于Usearch 軟件，使用UPARSE 算法在97 %的一致性水平上進(jìn)行Operational Taxonomic Unit（OUT）聚類?；赨CLUST 分類法與SILVA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因序列比對和注釋分析。使用R 語言和ggplot2包作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過Usearch 算法在97 %的一致性水平上進(jìn)行OTU 聚類。計算Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)（以確定物種豐富度）、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)（以確定物種多樣性）及檢測到的物種數(shù)目，以描述樣品中的細(xì)菌菌群多樣性，分析測序指數(shù)結(jié)果見表1。

表1 大曲細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)

隨著樣本測序深度的增加，各大曲樣品的真菌測序Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)都呈現(xiàn)逐漸平緩的變化趨勢，說明測序數(shù)據(jù)結(jié)果已經(jīng)覆蓋絕大部分真菌，測序數(shù)據(jù)量合理、測序深度足夠?？梢钥闯鲭S著大曲陳放時間延長，大曲中真菌多樣性呈增長趨勢，各個樣品的Coverage 指數(shù)均達(dá)到了99.99 %以上，說明在此條件下的測序數(shù)據(jù)結(jié)果完全能夠反映所測樣本中真菌的真實情況，絕大部分的微生物種系類型都被檢測到，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)行后續(xù)的研究分析。

2.2 物種組成結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同分組在各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。根據(jù)群落柱形圖，可以直觀看出各樣本在某一分類學(xué)水平上主要包括的微生物和樣本中各微生物的相對豐度。

圖2 門水平上細(xì)菌物種豐度組成

群落柱形圖表明，樣品中共檢出10 個菌門，其中硬壁菌門（Firmicutes）是白曲中的第一優(yōu)勢菌門，在1 個月、4 個月和6 個月大曲中分別占總微生物93.61 %、92.05 %、92.61 %，F(xiàn)irmicutes 在XH 和FH 中含量分別為83.06 %、89.26 %，在SH 中含量降低到18.52 %，F(xiàn)irmicutes 在黑曲中含量分別為49.59 %、37.62 %、79.90 %；放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門(Proteobacteria)在XB、FB、SB 中含量無較大變化，在XH、FH、SH 中均呈現(xiàn)先減少后增大的情況，在FH 中Actinobacteria 和Proteobacteria分別占總微生物26.01 %，44.13 %；Actinobacteria在黑曲中含量先增加后減少，Proteobacteria 變化趨勢相反，但最終含量均保持在10 %以內(nèi)；Bacteroidetes 在SH 中占比超過1 %，其余菌門含量均低于0.5%。上述結(jié)果與已報道的醬香大曲微生物在門類結(jié)構(gòu)上具有相似性[14-15]，郭敏[16]對醬香大曲制曲中微生物多樣性檢測發(fā)現(xiàn)在大曲制作過程中優(yōu)勢菌門是Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria；Zhang 等[17]對清香型白酒釀造用大曲細(xì)菌組成及多樣性研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌主要為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Chloroplast(藍(lán)藻菌門)，其中Firmicutes 為優(yōu)勢菌門；樊建輝等[18]研究仰韶陶融型白酒釀造用大曲可培養(yǎng)微生物的多樣性，結(jié)果表明Firmicutes 和Proteobacteria 為優(yōu)勢菌門；王曉丹等[19]從醬香大曲樣品中共檢出細(xì)菌6個菌門，主要為Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等，并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)與機(jī)械大曲中所檢出的微生物，在門水平上兩種制曲所生產(chǎn)曲胚中細(xì)菌的生態(tài)多樣性變化規(guī)律相似。

利用高通量測序方法從9 例大曲中共檢出109個菌屬，由圖3 可知，枝芽胞桿菌屬（Virgibacillus）是在9 例大曲中含量均超過10 %的菌屬，在SB 中含量最高，達(dá)到總含量的35.74 %，但是在SH 中含量僅有3.42%；克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）新曲中含量均高于12 %，隨著陳放過程，從XB 中的12.03 %提高到SB 中30.86 %，但在黃曲中的含量變趨勢正好相反，從XH中的32.11%，到SH含量僅3.52 %，黑曲中含量無明顯線性關(guān)系；糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在白曲陳放過程中期含量基本保持不變，在FK 中含量高達(dá)52.44 %，是所有樣品中菌屬含量最高的；葡萄球菌屬（Staphylococcus）在FH 中含量達(dá)到13.45 %，Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）在XB 中含量達(dá)到21.90 %，其余各類菌屬含量均低于10 %；高溫放線菌屬(Thermoactionmyces)表現(xiàn)出分布廣泛、耐受溫度高、生長速度快的特點，具有重要的潛在應(yīng)用價值和意義，是現(xiàn)階段醬香大曲高溫制曲的重要研究菌種，有研究從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等應(yīng)用于大分子物質(zhì)的分解[20-23]。

圖3 屬水平上細(xì)菌物種豐度組成

根據(jù)大曲種類，在屬水平對其分析得到，在1個月、4 個月、6 個月大曲中分別檢出155 個、103個、225 個屬，其中共有的有71 個屬，分別單獨含有的有41 個、6 個、99 個屬，數(shù)據(jù)顯示，在屬水平上分析大曲在陳放過程中，屬水平上數(shù)量先減少后增加，6 個月陳曲中屬種類最多，這可能是大曲在陳放過程中網(wǎng)羅空氣和環(huán)境中的微生物以豐富自身微生物種類使得微生物菌群更加豐富[24-25]。

2.3 通過LEFse分析組間菌群差異

在醬香高溫制曲過程，通過LEfSe 分析探究不同陳放時間下大曲細(xì)菌微生態(tài)結(jié)構(gòu)中物種的差異性，可以揭示制曲過程微生物結(jié)構(gòu)特征和發(fā)酵、風(fēng)味動力關(guān)鍵調(diào)控因子，有利于調(diào)控曲胚發(fā)酵參數(shù)和提升曲胚發(fā)酵質(zhì)量。

圖4 大曲屬水平物種韋恩圖

由圖5 可以看出，在屬水平上新曲中新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）為顯著富集的差異物種，在發(fā)酵過程中可由碳水化合物氧化產(chǎn)酸但不能發(fā)酵產(chǎn)酸，現(xiàn)階段該菌株研究較少，是一種亟待開發(fā)的菌屬[26-27]；4 個月大曲中Staphylococcus是顯著富集的差異物種，Staphylococcus是革蘭氏陽性球菌且多數(shù)為非致病菌，Thermoactionmyces也是顯著富集的差異物種[28-29]，Thermoactionmyces大都適宜在高溫下生活，表現(xiàn)出分布廣泛、耐受溫度高、生長速度快的特點，具有重要的潛在應(yīng)用價值和意義[21]。從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等應(yīng)用于大分子物質(zhì)的分解[20]，也有研究表明高溫放線菌在醬香大曲細(xì)菌的相對含量占34.40%，運用PCR-DGGE 技術(shù)對醬香型和芝麻香型高溫大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析研究，均發(fā)現(xiàn)高溫放線菌的存在[30]，羅小葉等[21]以醬香型大曲為實驗原材料，從茅臺大曲中分離純化5 株具有高溫放線菌菌落形態(tài)特征的菌株，分別有3 株嗜溫高溫放線菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、1 株甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari)、1 株高溫放線糖萊斯菌（Laceyella sacchari），同時發(fā)現(xiàn)高溫放線菌產(chǎn)生的水解酶對釀酒原料的分解及促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)代謝產(chǎn)生具有一定的作用。在6 個月大曲中乳球菌屬(Lactococcus)為顯著富集的差異物種，這一類細(xì)菌為革蘭氏陽性屬化能自養(yǎng)型微生物，以碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸，L(+)-乳酸為主，不產(chǎn)氣，可能是白酒中乳酸的主要來源[31]。

圖5 大曲LEFse差異分析圖

2.4 PCA分析

PCA 是對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，以此提取數(shù)據(jù)中最主要的因素，發(fā)現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的規(guī)律。在PCA分析中，樣品的菌群越相似，則兩個樣品距離越近。

在圖6 中，橫坐標(biāo)對差異影響貢獻(xiàn)率為70.05 %，縱坐標(biāo)對差異影響的貢獻(xiàn)率為22.77 %。部分1 個月、4 個月、6 個月大曲距離很近，菌群相似，但是還是明顯看出各類大曲樣品并沒有聚集在一起，這說明1個月、4個月、6個月大曲微生物構(gòu)成差異較大。

圖6 大曲PCA分析圖

2.5 PCoA分析

PCoA 是根據(jù)特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出主要的元素和結(jié)構(gòu)，選取貢獻(xiàn)量最大的主坐標(biāo)組合作圖。兩個樣品的菌群組成越相似，兩個樣品距離越近。

在圖7 中，PCoA 的橫坐標(biāo)對差異影響貢獻(xiàn)率為48.82 %，縱坐標(biāo)對差異影響的貢獻(xiàn)率為16.66 %。通過基于Unweighted Unifrac 距離計算的PCoA，可以發(fā)現(xiàn)除4 個月大曲明顯聚集在一起外，新曲和6 個月大曲樣品距離較遠(yuǎn)，沒有明顯聚集的表現(xiàn)。

圖7 大曲PCoA分析圖

2.6 UPGMA聚類樹

在微生物生態(tài)研究當(dāng)中，UPGMA 分類樹可以用于研究樣本間的相似性，越相似的樣本擁有越短的共同分支。如圖8 所示，各個大曲樣本除XK 和FK、XB 和SK 菌群組成相似外，其余大曲樣本均無明顯相似性，UPGMA 聚類樹和樣本屬水平上的物種豐度聚類圖結(jié)果與PCoA分析結(jié)果相似。

圖8 樣本間Beta多樣指數(shù)UPGMA聚類圖

3 結(jié)論

對北街酒廠陳放不同時間的9 例大曲細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，分別鑒定出10 個菌門和109 個菌屬，通過對不同陳放時間大曲細(xì)菌多樣性研究分析，明確Firmicutes 在白曲中為第一優(yōu)勢菌門，Actinobacteria、Proteobacteria 是僅次于Firmicutes 的兩個菌門；Virgibacillus是大曲中的重要菌屬，占微生物比例均超過10 %，Kroppenstedtia、Saccharopolyspora都屬于大曲中優(yōu)勢菌屬；對不同陳放時間的大曲差異性分析發(fā)現(xiàn)，在1個月、4個月、6個月大曲分別檢出155 個、103 個、225 個屬，其中共有的有71個屬，分別單獨含有的有41 個、6 個、99 個屬，表明大曲在陳放過程中網(wǎng)羅了環(huán)境中的微生物使得大曲微生物菌群更加豐富，側(cè)面印證了環(huán)境微生態(tài)會通過影響大曲微生物多樣性進(jìn)而影響醬香白酒的釀造，環(huán)境微生物是醬香白酒釀造不可或缺的微生物組成部分，大曲通過品溫上升的篩選，最終實現(xiàn)環(huán)境、原料等外界中的有益菌向大曲遷移和富集；發(fā)現(xiàn)新曲中Novosphingobium為顯著富集的差異物種，4個月大曲中Staphylococcus和Thermoactionmyces為顯著富集的差異物種，6個月大曲中Lactococcus為顯著富集的差異物種。這是大曲在開放式發(fā)酵條件下形成的具有標(biāo)志性的菌群結(jié)構(gòu)，或可成為大曲陳放時間鑒別的主要依據(jù)，對大曲PCA 和PCoA分析發(fā)現(xiàn)1個月、4個月、6個月大曲微生物構(gòu)成差異較大。UPGMA 聚類樹分析和大曲屬水平上的物種豐度聚類圖分析結(jié)果再一次印證不同存放時間大曲樣本均無明顯相似性。大曲提供了醬香白酒釀造過程主要的酶、氨基酸、糖等發(fā)酵前體物質(zhì)，是醬香型白酒生產(chǎn)的“骨架”。所以，探究不同陳放時間大曲的微生物結(jié)構(gòu)特征為醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生提供了理論依據(jù)，同時為大曲中特征微生物的分離篩選培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支撐，從微生物角度詮釋了高溫大曲陳放過程是醬香白酒不可分割的釀造工藝。

圖9 樣本屬水平上的物種豐度聚類圖