喻妙梅，王 偉，沈筠恬，沈 宓

（1 南通大學(xué)教育部·江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇 226001；2 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科）

周圍神經(jīng)損傷為臨床常見疾病,當(dāng)神經(jīng)缺損距離較大時,受神經(jīng)吻合口處張力的限制無法進行簡單的端對端縫合,開發(fā)有效的神經(jīng)替代物和修復(fù)方法以治療神經(jīng)缺損成為近年來的研究熱點。神經(jīng)移植物構(gòu)成神經(jīng)再生微環(huán)境的重要成分,通過篩選神經(jīng)支架和優(yōu)化內(nèi)部結(jié)構(gòu)、種子細(xì)胞和生長因子,可以使神經(jīng)移植物發(fā)揮最大化促神經(jīng)再生作用。皮膚源性前體細(xì)胞（SKPs）是一種從胚胎及成年真皮中提取的來自神經(jīng)嵴的多能干細(xì)胞[1],能分化成神經(jīng)元、成髓鞘施萬細(xì)胞[2-4]、中胚層譜系的成骨細(xì)胞[5]、造血細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等[6-8]。細(xì)胞外囊泡（Evs）是由活細(xì)胞分泌的直徑30～1 000 nm 的含膜囊泡,含有來自母體細(xì)胞多種特異性生物成分,可以在細(xì)胞間進行物質(zhì)和信息傳遞,從而改變受體細(xì)胞的功能[9]。

本課題組從新生SD 大鼠背部皮膚中分離純化SKPs 后,將其定向分化為施萬細(xì)胞（SKP-SCs）,體外擴培細(xì)胞后獲取SKP-SC-EVs,發(fā)現(xiàn)SKP-SC-EVs能夠促進神經(jīng)元生長[10-11]?；|(zhì)膠（Matrigel）是可溶性基底膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,采用Matrigel 裝載可維持EVs 在導(dǎo)管中的穩(wěn)定及可持續(xù)性釋放,有利于促進神經(jīng)損傷后的再生和功能恢復(fù)。Matrigel 裝載SKP-SC-EVs 至硅膠管中構(gòu)建神經(jīng)移植物能促進大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù),具有潛在臨床應(yīng)用前景[12]。神經(jīng)移植物需要在較長一段時間內(nèi)與人體接觸,嚴(yán)格評估其生物安全性極為重要。本研究旨在通過血液學(xué)檢查、病理組織學(xué)分析全面檢測含SKP-SCEVs 神經(jīng)移植物的生物安全性,使臨床風(fēng)險降到最小限度。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 Matrigel 生長因子減少型（GFR）基質(zhì)膠（貨號356231）,硅膠管2 mm×3 mm（貨號6-586-05）,exoEasy Maxi Kit 試劑盒（貨號76064）,納米顆粒跟蹤分析NTA（German Metrix 公司）全自動組織處理機ASP300S 型（LEICA）;病理組織漂烘儀PH60 型（派斯杰醫(yī)療）;組織包埋機BM450A 型（派斯杰醫(yī)療）,輪轉(zhuǎn)式切片機RM2235 型（LEICA）,全自動染色封片一體機Tissue-Tek Prisma Film-JC2型（SAKURA）,研究級顯微鏡ECLIPSE Ni 型（Nikon）。

1.2 神經(jīng)移植物制備 取新生SD 大鼠背部皮膚,分離培養(yǎng)SKPs,并誘導(dǎo)分化成SKP-SCs。大量擴增培養(yǎng)后收集上清,采用exoEasy Maxi Kit 試劑盒提取EVs,NTA 粒徑分析EVs 大小分布及濃度。將基質(zhì)膠與2×1010粒SKP-SC-EVs（EV-NG 組）注射于12 mm 硅膠管中,37 ℃孵育30 min,凝固后形成神經(jīng)移植物備用（圖1）。采用Matrigel 基質(zhì)膠+PBS 為對照（NG 組）。

圖1 基于SKP-SC-EVs 構(gòu)建的神經(jīng)移植物

1.3 動物實驗分組及處理 SPF 級雄性SD 大鼠20只,8 周齡,220～250 g,由南通大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物合格證編號：202130154,實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SYXK（蘇）2017-0046］。隨機分為4 組：假手術(shù)組,自體移植組,NG 組,EV-NG 組,每組5只。假手術(shù)組：右側(cè)坐骨神經(jīng)暴露后即縫合傷口。右側(cè)坐骨神經(jīng)暴露后,剪去一段神經(jīng)回縮后達10 mm缺損,自體移植組將剪下的神經(jīng)顛倒180 度橋接于缺損處近、遠殘端;NG 組采用NG 橋接缺損處縫合;EV-NG 組將EV-NG 與兩斷端的神經(jīng)外膜縫合,并使兩斷端套接入導(dǎo)管。動物手術(shù)在南通大學(xué)實驗動物中心內(nèi)操作,術(shù)后各組給予基礎(chǔ)飼料單籠喂養(yǎng),自由飲食,觀察大鼠飲食、活動情況。

1.4 主要臟器組織病理學(xué)觀察 術(shù)后12 周處死大鼠,對心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、腦等各主要臟器的病理改變進行大體觀察。將組織標(biāo)本浸入4%多聚甲醛固定,全自動組織處理機脫水處理,石蠟包埋制片,常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察。

1.5 血液指標(biāo)測定 術(shù)后12 周從大鼠心臟采集血液,使用全自動血液分析儀進行血常規(guī)檢測（白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白等）,全自動生化分析儀測定轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、尿素氮和堿性磷酸酶等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示,組間差異性比較采用t 檢驗,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后損傷側(cè)后肢運動狀態(tài)觀察 術(shù)后各組大鼠飲食正常,均未出現(xiàn)死亡。術(shù)后假手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)后肢運動正常,而自體移植組、NG 組和EV-NG 組大鼠均出現(xiàn)術(shù)側(cè)足不能彎屈,趾甲缺失,站立不穩(wěn)等明顯神經(jīng)損傷表現(xiàn)。術(shù)后12 周3 個橋接組大鼠均能靈活行走,但損傷側(cè)后肢步態(tài)存在一定差異,自體移植組和EV-NG 組步態(tài)較為協(xié)調(diào),NG組足趾蜷縮、外翻較為明顯,行走時足趾占地面積更大。此外,3 個橋接組大鼠均出現(xiàn)不同程度咬足行為,EV-NG 大鼠術(shù)側(cè)足趾破損較輕,行走動作基本協(xié)調(diào),與假手術(shù)組較為接近。

2.2 各組大鼠臟器組織病理學(xué)觀察 術(shù)后12 周各組主要臟器組織顏色和大小均無顯著改變,未見變性出血及壞死等。組織切片病理HE 染色結(jié)果見圖2。心臟：心肌細(xì)胞呈短柱狀,形態(tài)正常,細(xì)胞連接處可見特征性閏盤。肝臟：肝小葉與結(jié)締組織構(gòu)成門管區(qū),肝細(xì)胞以中央靜脈為中心,周圍肝細(xì)胞索放射狀排列成網(wǎng),大小正常。脾臟：脾結(jié)構(gòu)完整,白髓和紅髓相間,脾竇內(nèi)見血細(xì)胞,結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰。肺臟：肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,未見炎性反應(yīng)及淤血。腎臟：腎小管、集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。腦：腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,可見神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常。

圖2 各組大鼠主要臟器病理切片HE 染色觀察

2.3 各組大鼠血常規(guī)及主要生化指標(biāo)分析 術(shù)后12 周各組大鼠血常規(guī)及主要生化指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi),EV-NG 組與假手術(shù)組和NG 組比較,各項指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1～2。

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)分析

3 討 論

對植入人體的醫(yī)用材料生物性能要求極高,在體內(nèi)應(yīng)保持相對穩(wěn)定,不發(fā)生排斥反應(yīng)。以往研究顯示,硅膠管和Matrigel 具有良好的親水性和生物相容性。硅膠管來源與自然生物成分相似,易獲取,因而廣泛用于醫(yī)用材料。Matrigel 通過增強的滲透效應(yīng)和滯留效應(yīng)實現(xiàn)體內(nèi)緩慢釋放,Matrigel 共培養(yǎng)細(xì)胞可明顯改善周圍神經(jīng)損傷模型[13]。本實驗中我們將以往研究中發(fā)現(xiàn)具有良好促神經(jīng)生長作用的SKPSC-EVs 通過Matrigel 裝載注入硅膠管中,制成神經(jīng)移植物,橋接修復(fù)大鼠10 mm 坐骨神經(jīng)缺損,檢測含EVs 神經(jīng)移植物體內(nèi)組織反應(yīng)、血常規(guī)及主要生化指標(biāo),驗證該移植物的生物安全性。

SKPs 作為一種成體干細(xì)胞容易獲得,可大量擴增培養(yǎng),體外誘導(dǎo)分化成施萬細(xì)胞（SCs）,具有一定成髓鞘能力,能顯著促進周圍神經(jīng)再生。然而,種子細(xì)胞治療需考慮免疫排斥、微循環(huán)阻塞等風(fēng)險。目前在再生醫(yī)學(xué)中,基于EVs 的無細(xì)胞治療方法被視為納米醫(yī)學(xué)中最具前景的候選者之一[14]。EVs 具有良好的生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等優(yōu)點,可大大降低植入細(xì)胞帶來的風(fēng)險[15]。EVs內(nèi)含有來自母體細(xì)胞特異性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA 和DNA 等多種生物成分,在多種臟器損傷中發(fā)揮促進修復(fù)再生的作用[16-17]。

本研究結(jié)果顯示,術(shù)后12 周EV-NG 組大鼠術(shù)側(cè)肢體運動狀態(tài)接近假手術(shù)組,足趾破損較輕,彎屈障礙得以恢復(fù);各組大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器均無病理性改變,提示EV-NG 組大鼠主要組織器官未發(fā)生明顯急慢性病理損傷變化;各組大鼠血常規(guī)及主要生化指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi),EV-NG 組與假手術(shù)組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此,Matrigel 裝載SKP-SCs 來源的EVs 注射至硅膠管中制備成的神經(jīng)移植物生物安全性較高,為臨床治療周圍神經(jīng)缺損提供安全性依據(jù)。