樊馨竹，沈藝琳，許濤，羅馳恒，高羽亭（1.廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣東東莞 523808；2.東莞市環(huán)境醫(yī)學重點實驗室，廣東東莞 523808；3.東莞市環(huán)境與健康研究所，廣東東莞 523808）

癌癥是全球人口死亡的主要原因之一[1]，且尚未發(fā)現(xiàn)治愈的方法[2]。隨著生物信息學方法和一些公共數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展和改進，可以通過對基因進行泛癌分析來評估其與臨床預后和免疫細胞浸潤的相關性，以尋求新的治療靶點[3-4]。Wnt 蛋白家族能夠以旁分泌和自分泌方式激活細胞膜受體，是Wnt 信號通路的主要組成部分[5]。該信號通路參與細胞的生長、增殖等生物學過程，與腫瘤等多種人類疾病高度相關[6]。WNT2B 是刺激經(jīng)典Wnt 通路的Wnt 配體之一[7]，在許多生理和病理過程，特別是在腫瘤的發(fā)展中起著至關重要的作用[8-9]。在泛癌水平上對WNT2B 的功能和臨床重要性進行全面分析研究鮮見，據(jù)此，本文針對該基因進行了泛癌分析，以探討WNT2B 在癌癥進展中的作用。

1 材料和方法

1.1 WNT2B 基因表達分析

本文從UCSC 數(shù)據(jù)庫中下載癌癥基因組圖譜（TCGA）泛癌數(shù)據(jù)集，從中提取ENSG00000134245（WNT2B）基因在各個樣本中的表達數(shù)據(jù)，分析該基因在各個腫瘤樣本中瘤與瘤旁的差異?？紤]到TCGA中正常樣本較少，本研究從UCSC 數(shù)據(jù)庫中下載TCGA TARGET 基因型-組織表達（GTEx）泛癌數(shù)據(jù)集，整合GTEx 數(shù)據(jù)庫中的正常組織的數(shù)據(jù)和TCGA 中腫瘤組織的數(shù)據(jù)分析各種腫瘤的表達差異。

1.2 基因表達預后分析

本文從先前發(fā)表在《Cell》上的TCGA 預后研究[10]中獲得高質(zhì)量的TCGA 的預后數(shù)據(jù)集，從UCSC 的癌癥瀏覽器中獲取TARGET 隨訪數(shù)據(jù)作為補充，使用R軟件包survival 的coxph 函數(shù)建立Cox 比例風險回歸模型以分析基因表達與每個腫瘤中的預后關系得到森林圖，然后將患者分為高低兩組，用R 軟件包survival 的survfit 函數(shù)分析兩組的預后差異得到KM 生存曲線。

1.3 免疫浸潤分析

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析WNT2B 表達與癌癥相關成纖維細胞浸潤之間的相關性。從TIMER 數(shù)據(jù)庫下載了33 種癌癥的6 種免疫浸潤細胞的得分數(shù)據(jù)，分析基因表達與這些免疫細胞得分的相關性。利用R軟件包ESTIMATE[11]分析各個腫瘤樣本的基質(zhì)評分（Stromal score），免疫評分（Immune score）和綜合評分（ESTIMATE score）。

1.4 基因突變與表達分析

從GDC 上下載了經(jīng)GISTIC 軟件[12]處理的所有TCGA 樣本的拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)集，整合樣本的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)和基因表達數(shù)據(jù)，使用R 軟件計算每個腫瘤中基因在基因組變異和非變異樣本中的表達差異。

1.5 基因組異質(zhì)性與基因表達分析

從先前的研究[13]中獲取每個腫瘤的免疫新抗原數(shù)據(jù)，計算在各個腫瘤中新抗原和WNT2B 表達的相關性。從GDC 上下載經(jīng)MuTect2 軟件[14]處理的所有TCGA 樣本的單核苷酸變異數(shù)據(jù)集，利用R 軟件包maftools 的tmb 函數(shù)計算每個腫瘤的TMB，并整合樣本的TMB 評分和WNT2B 表達數(shù)據(jù)，計算他們之間的相關性。且從先前的研究[15]中獲取每個腫瘤的MSI 評分，整合樣本的MSI 評分和基因表達數(shù)據(jù)，在每種腫瘤中計算他們之間的相關性。

1.6 統(tǒng)計學處理

癌癥基因表達譜數(shù)據(jù)均通過log2（x+0.001）轉(zhuǎn)化進行標準化。使用非配對的秩和檢驗和秩和檢驗進行兩兩之間的差異顯著性分析，利用kruskal.test 進行多組樣本的差異檢驗。使用單因素Cox 回歸模型、卡普蘭—邁爾方法進行生存分析，并利用logrank test 方法評估不同組樣本之間的預后差異顯著性。使用斯皮爾曼或皮爾森相關系數(shù)來進行相關性分析。

2 結(jié)果

2.1 WNT2B 在泛癌中的表達水平

分析WNT2B 在TCGA 泛癌數(shù)據(jù)中的mRNA 表達水平，結(jié)果顯示，WNT2B 在頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、腎透明細胞癌（KIRC）、膽管癌（CHOL）、混合腎癌（KIPAN）、肝細胞肝癌（LIHC）和肺鱗癌（LUSC）這7 種腫瘤中高表達，在多形成性膠質(zhì)細胞瘤（GBM）、膠質(zhì)瘤（GBMLGG）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、腎嫌色細胞癌（KICH）、甲狀腺癌（THCA）、直腸腺癌（READ）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、乳腺浸潤癌（BRCA）、前列腺癌（PRAD）、結(jié)腸癌（COAD）及結(jié)直腸癌（COADREAD）這14 種腫瘤中低表達，見圖1A。

本文整合GTEx 數(shù)據(jù)庫中的正常組織的數(shù)據(jù)和TCGA 中腫瘤組織的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示W(wǎng)NT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、胰腺癌（PAAD）、睪丸癌（TGCT）、白血?。ˋLL）、急性髓細胞樣白血?。↙AML）和CHOL 這9 種腫瘤中高表達，而在25 種腫瘤中表達較低，除上述14 種腫瘤類型外，還有宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、腎母細胞瘤（WT）、黑色素瘤（SKCM）、卵巢漿液性囊腺癌（OV）、食管癌（ESCA）、子宮肉瘤（UCS）、腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、胃和食管癌（STES）、胃癌（STAD）、LUSC 和 LIHC，見圖1B。

圖1 WNT2B 在泛癌中的表達分析

2.2 WNT2B 在泛癌中的預后意義

Kaplan-Meier 分析顯示W(wǎng)NT2B 高表達的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA、TCGA-LAML 中總生存時間較短，在TCGA-LUSC、TARGET-ALL 中總生存時間較長（圖2A～F）。

圖2 WNT2B 表達與不同腫瘤患者總生存期的相關性

單變量Cox 回歸分析顯示，WNT2B 高表達是TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA 和TCGA-LAML 患者總生存期（OS）的危險因素，是TCGA-LUSC 和TARGET-ALL 患者的保護因素（圖3A）。此外，疾病特異性生存期（DSS）分析顯示，WNT2B 是TCGA-LGG，TCGA-BLCA 患者的危險因素，是TCGA-LUSC 患者的保護因素（圖3B）。無病生存期（DFI）分析顯示，WNT2B 是TCGA-ACC 患者的危險因素，是TCGA-UCEC 患者的保護因素（圖3C）。最后，無進展生存期（PFI）分析表明，WNT2B是TCGA-LGG、TCGA-BLCA、TCGA-ACC 患者的危險因素，是TCGA-THYM、TCGA-PAAD 患者的保護因素（圖3D）。

2.3 WNT2B 表達與免疫細胞浸潤水平的關系

結(jié)果顯示W(wǎng)NT2B 表達與LIHC、PRAD、STAD 和THYM 呈正相關（P<0.05）。WNT2B 表達與6 種常見的免疫細胞得分也具有一定的相關性，其中最顯著相關的3 個腫瘤是COAD、KIRC、LGG（圖4）。在分析腫瘤樣本中WNT2B 表達與Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的關系，圖中分別顯示了最顯著相關的3 個腫瘤（圖5）。

圖4 WNT2B 表達與免疫細胞浸潤水平的相關性分析

圖5 WNT2B 與Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的相關性分析

2.4 WNT2B 表達與基因突變有關

整合了樣本的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)和WNT2B 表達數(shù)據(jù)，以探索每個腫瘤中基因組變異和非變異樣品中基因表達的差異。結(jié)果顯示ESCA、STES、STAD、PRAD、LUSC、PAAD、OV、SKCM 和BLCA 這9 種腫瘤中差異有統(tǒng)計學意義，如圖6。

圖6 WNT2B 表達與基因突變的相關性（*P<0.05，**P<0.01）

2.5 WNT2B 表達與基因組異質(zhì)性的關系

結(jié)果顯示在3 種腫瘤中WNT2B 的表達與TMB顯著相關，其中在THCA 及ACC 中呈正相關，在ROADREAD 中呈負相關（圖7A）。在8 種腫瘤中發(fā)現(xiàn)WNT2B 與TMB 顯著的相關性。在KIPAN、ACC等2 種腫瘤中呈顯著正相關，在COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 與CHOL 等6 種腫瘤中呈顯著負相關（圖7B）。在13 種腫瘤中發(fā)現(xiàn)WNT2B 與MSI也存在顯著的相關性，其中在4 種腫瘤中呈顯著正相關，如GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC，在9 種腫瘤中顯著負相關，如COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 及DLBC（圖7C）。

圖7 WNT2B 表達與基因組異質(zhì)性的關系

3 討論

Wnt 信號通路是重要的信號通路之一，WNT2B作為經(jīng)典通路分子，在癌癥進展中發(fā)揮重要的作用。已有研究證實，通過靶向WNT2B 可以抑制膽囊癌和膽管癌細胞的增殖，遷移和侵襲[16]，以及延緩膠質(zhì)母細胞瘤的癌變[17]。沉默WNT2B 能夠增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[18]。然而，目前尚無針對WNT2B 的泛癌研究。因此在本項研究中，本文整合GTEx 和TCGA 數(shù)據(jù)，詳細分析WNT2B 在泛癌中的表達水平、預后狀態(tài)、免疫浸潤和遺傳改變等特征，旨探討WNT2B 與腫瘤免疫浸潤的相關性及其在泛癌中潛在的預后價值，以尋求新的治療靶點。

本文發(fā)現(xiàn)WNT2B 在泛癌中的表達存在顯著差異。與正常組織相比，WNT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、PAAD、TGCT、ALL、LAML 和CHOL中是高表達的，而在GBM、GBMLGG、LGG、LUAD、COAD、COADREAD、BRCA、PRAD、UCEC、THCA、READ、PCPG、BLCA、KICH、CESC、ESCA、STES、STAD、LUSC、LIHC、WT、SKCM、OV、UCS 和ACC 中則表達較低。研究表明，在化療組中高表達Wnt2B 的AML 患者預后更差[19]。此外，Wnt2B 在人胰腺癌組織中的表達顯著高于正常胰腺組織，且與較低表達組相比，癌癥組織中Wnt2B 表達升高預示著總生存期更短，提示W(wǎng)nt2B 的高表達可能與癌癥患者預后不良有關[20]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，高表達的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGABLCA 和TCGA-LAML 中總生存時間較短，而在TCGA-LUSC，TARGET-ALL 中總生存時間較長，表明WNT2B 的表達會對不同癌癥患者的預后造成不同的影響，體現(xiàn)WNT2B 在泛癌中的預后價值，顯示其可作為一種預后生物標志物的潛力。

腫瘤微環(huán)境（TME）是規(guī)范和非規(guī)范Wnt 配體的來源，可以誘導癌細胞和免疫細胞中的信號通路發(fā)生異常[21]。在TME 中，CAFs 已被證實在腫瘤的發(fā)展中起著多種作用[22]。腫瘤免疫微環(huán)境與各種基因的表達水平有關。在本研究中發(fā)現(xiàn)WNT2B 的表達與多種腫瘤的CAFs 浸潤呈正相關，且在LIHC、PRAD、STAD和THYM 中尤為顯著。此外，WNT2B 的表達與COAD、KIRC 和LGG 中6 種類型的免疫細胞浸潤顯著相關，并與一些腫瘤的Immune Score、Stromal Score和ESTIMATE Score 相關。以上結(jié)果均顯示了在不同腫瘤中免疫細胞的浸潤狀態(tài)，提示W(wǎng)NT2B 的表達可以參與調(diào)節(jié)免疫細胞浸潤到腫瘤組織中這一過程，表明WNT2B 在調(diào)節(jié)癌癥腫瘤免疫學中發(fā)揮了一定的作用。

腫瘤新抗原是腫瘤免疫治療的新興方法之一，主要是由腫瘤細胞突變產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原，僅在腫瘤細胞中大量表達，具有很強的免疫原性和腫瘤異質(zhì)性[23]。用新抗原合成的疫苗具有多靶點，安全，廣譜等優(yōu)點，它不易引起中樞耐受和自身免疫反應，可用于為癌癥患者準備個性化疫苗[24]。利用腫瘤新抗原的免疫活性，可以根據(jù)腫瘤細胞突變的情況設計合成新抗原疫苗，對患者進行免疫注射，達到個體化治療的效果。TMB 是腫瘤標本中存在的突變總數(shù)，可作為一種生物標志物預測多種癌癥類型免疫治療后的生存 率[25]。MSI 是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。近年來的研究提示MSI 有可能成為評估腫瘤惡性程度，療效和預后的關鍵預測因子。在本研究結(jié)果中可看出WNT2B 的表達在THCA、ACC 和COADREAD 中與腫瘤新抗原相關，在KIPAN、ACC、COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 和CHOL 中與TMB 相關，在GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC、COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 和DLBC 中與MSI 有關，表明WNT2B 表達水平會影響癌癥的腫瘤新抗原，TMB 和MSI。

綜上所述，我們應用綜合生物信息學方法，表明WNT2B 表達可能介導免疫浸潤并影響泛癌患者的預后，展示其作為預后生物標志物的潛力，并為臨床癌癥治療提供新的靶點。