張 斌, 馮曉慶, 鄭 芊, 陳 穩(wěn), 滕 杰

(湖南科技學(xué)院 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心,湖南 永州 425199)

多胺(polyamines,PA)是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿,廣泛存在于所有生物體中;它與RNA形成復(fù)合物可以增強(qiáng)mRNA的翻譯,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成,在細(xì)胞活性和增殖中起重要作用[1-2]。此外,PA還可以通過清除自由基來保護(hù)DNA免受活性氧(ROS)的傷害[3],作為細(xì)胞信號與激素相互作用[4];PA代謝與DNA甲基化之間存在密切關(guān)系[5]。PA參與植物器官和胚胎發(fā)生、花和果實(shí)發(fā)育,以及葉片衰老等過程[6],參與植物非生物和生物脅迫的響應(yīng)[7-9,4]。在植物生長發(fā)育和應(yīng)激條件下PA含量發(fā)生變化,為了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)PA穩(wěn)態(tài),植物會微調(diào)PA合成和降解[10-11]。研究表明,缺乏合成能力的細(xì)菌可以從培養(yǎng)基中吸收PA[12],在植物中也存在PA轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象,并發(fā)現(xiàn)亞精胺、精胺和腐胺可以抑制擬南芥(Arabidopsisthaliana)吸收百草枯(paraquat,PQ)[13-14]。

L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(L-type amino acid transporter,LAT)家族在介導(dǎo)氨基酸、PA和PQ的運(yùn)輸過程中發(fā)揮作用。5個擬南芥LAT成員(LAT3/AtPUT1、LAT4/AtPUT2、LAT1/AtPUT3、LAT2/AtPUT4和LAT5/AtPUT5)具有PA和PQ轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[15],屬于氨基酸多胺膽堿家族[16],隨后,被重新歸類為多胺-質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(polyamine H+-symporters,PHS)家族[17]。AtPUT2介導(dǎo)PQ在葉綠體中積累,在特定生理?xiàng)l件下,還具有調(diào)控亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性的功能[18],并在氧化應(yīng)激反應(yīng)和脫落酸(abscisic acid,ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[19]。AtPUT3定位在質(zhì)膜上,具有介導(dǎo)PQ和尸胺轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[13,20],還介導(dǎo)韌皮部維生素B的長距離運(yùn)輸[21],熱應(yīng)激條件下具有穩(wěn)定mRNA的功能[22]。AtPUT3和SOS1與蛋白激酶SOS2形成復(fù)合物響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng),并通過蛋白互作和磷酸化作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)活性[14],參與胞外精胺激活磷脂酶D(phospholipase D,PLD)和離子通量從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)磷脂酸快速反應(yīng)的過程[4]。AtPUT5基因突變后擬南芥提前開花,葉片中亞精胺和亞精胺結(jié)合物的含量顯著降低[23]。

關(guān)于OsPUT方面的研究報道并不多。OsPUT1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而OsPUT3則定位于葉綠體;擬南芥中導(dǎo)入OsPUT1或者OsPUT3基因,其蓮座葉、莖和開花時間出現(xiàn)變化[23]。Li等[24]認(rèn)為,水稻抗百草枯蛋白1(Oryzasativaparaquat resistant1, OsPAR1, Os03g0576900)定位高爾基體,介導(dǎo)PQ進(jìn)入葉綠體。但是,關(guān)于OsPUT在水稻抗低溫脅迫過程中的作用目前尚未見相關(guān)報道。本研究對OsPUT5基因進(jìn)行了分析,利用水稻OsPUT5基因的超表達(dá)(OE)株系、日本晴(Nip)株系和RNAi株系初步研究了OsPUT5基因在水稻生長發(fā)育和抗低溫脅迫過程中的作用,為進(jìn)一步認(rèn)識水稻對低溫的抗性提供參考,為后續(xù)水稻抗脅迫的遺傳改良提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

根癌農(nóng)桿菌GV3101、質(zhì)粒pFGC5941、大腸埃希菌DH5α、RNAi株系、OE株系和Nip株系種子由湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心提供;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、T載體pMD-19和草銨膦購自O(shè)MEGA公司;潮霉素購自Calbiochem公司;RNAiso Plus購自TaKaRa公司;DL5000 DNA Marker和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海Thermo Scientific公司;2×TaqPCR Master Mix、丙二醛和脯氨酸測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PUT蛋白親緣關(guān)系和結(jié)構(gòu)分析

在Ensembl數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、水稻和高粱的基因組數(shù)據(jù),用擬南芥AtPUT家族成員蛋白質(zhì)序列(表1)進(jìn)行BLASTP搜索,去掉不完整結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列。在MEGA 7.0軟件中打開Clustal X,對所有蛋白質(zhì)序列對進(jìn)行多重比較,用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap設(shè)置為1 000,其他均使用默認(rèn)參數(shù)。利用TMHMM v.2.0軟件和TMRPres2D軟件分別進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測和可視化;用NCBI-CDD搜索蛋白質(zhì)家族結(jié)構(gòu)域。

表1 基因信息Table 1 Gene information

1.2.2OsPUT5轉(zhuǎn)基因苗和純系植株鑒定

構(gòu)建超表達(dá)載體pCAM1390-OsPUT5和RNAi載體pFGC5941-OsPUT5-RNAi,借助農(nóng)桿菌對Nip株系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并獲得OE株系和RNAi株系[25-26]。RNAi株系和OE株系種子去殼后用次氯酸鈉消毒40 min,沖洗干凈,分別點(diǎn)播在含草銨膦(5 mg·L-1)或潮霉素(25 mg·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽,置于人工氣候箱培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度800 lx、濕度70%、14 h黑暗(25 ℃)、10 h光照(30 ℃)。采用SDS法提取葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定(OE株系在1390載體序列上設(shè)計引物:GCCTCGCTCCAGTCAATGAC,ATTCCGGAAGTGCTTGACAT;RNAi株系在pFGC5941載體序列上設(shè)計引物:CACTCCAAAGAAAGAGAAACTGACA,CTCAGGTTTTTTACAACGTGCACAA),PCR產(chǎn)物用l.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。收獲T1代種子后,將T1代種子點(diǎn)播在含草銨膦(5 mg·L-1)和潮霉素(25 mg·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基上篩選,置于人工氣候箱培養(yǎng),移栽后獲得T2種子。T2代種子繼續(xù)在含草銨膦(5 mg·L-1)或潮霉素(25 mg·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,鑒定純株系。

1.2.3 幼苗溫度耐性和生理生化指標(biāo)測定

OE株系、Nip株系和RNAi株系各取3個不同植株,種子去殼后用次氯酸鈉消毒40 min,無菌水沖洗干凈,接種于1/2 MS培養(yǎng)基上,置于人工氣候箱培養(yǎng)。發(fā)芽2周后,選取生長一致的幼苗于4 ℃處理30 h,觀察三者的表型差異,測定處理前后生理生化指標(biāo),3次重復(fù)。

幼苗洗凈吸干水分后用萬分之一電子天平測量鮮重,120 ℃烘干至質(zhì)量不變,稱量干重。

取0.5 g幼苗葉片,用ddH2O沖洗干凈,剪碎,置于20 mL ddH2O中,在室溫下浸泡30 min,檢測電導(dǎo)率(C1);然后沸水浴15 min,馬上冷卻搖勻,檢測電導(dǎo)率(C2),3次生物學(xué)重復(fù)。葉片相對電導(dǎo)率Ec=C1/C2×100%[27]。

幼苗根系洗凈后,用濾紙擦干,取0.5 g根系用液氮速凍并研磨成粉狀,按照脯氨酸和丙二醛檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提供的方法分別測定脯氨酸和丙二醛含量。

1.2.4OsPUT5基因相對表達(dá)量和農(nóng)藝性狀測定

OE株系、Nip株系和RNAi株系種子發(fā)芽后移栽到直徑30 cm的盆中,每個株系4株,常規(guī)盆栽管理。移栽后21 d,用Trizol法提取葉片RNA,按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific公司,上海)的方法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以ACTIN基因作為內(nèi)參(引物AGCTATCGTCCACAGGAA,ACCGGAGCTAATCAGAGT),通過qRT-PCR比較OsPUT5在RNAi株系、OE株系和Nip株系中的表達(dá)量(引物AAGTACAGCAGTGTCAATGAGGGCG,TGACACTATCCTCAATCCCAAACGG)。Nip株系生長至開花期,分別取水稻根、莖、葉片和穎花的總RNA,通過qRT-PCR測定OsPUT5基因的表達(dá)模式。qRT-PCR在美國伯樂CFX Connect上進(jìn)行,反應(yīng)體系為10 μL,分別包括1 μL cDNA,引物各0.4 μL,SYBRgreen Mix 5 μL,ddH2O 3.2 μL;反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,45個循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),采用2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。

成熟期測定水稻的主要農(nóng)藝性狀。株高:抽穗后測量土面至最高穗頂?shù)钠骄叨?分蘗數(shù):蠟熟期記錄總莖蘗數(shù)與有效穗數(shù);每穗粒數(shù):包括每穗總粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù),白穗和半枯穗不計在內(nèi);結(jié)實(shí)率=每穗實(shí)粒數(shù)/每穗總粒數(shù)×100%;千粒重為1 000粒曬干的飽滿谷粒的質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件(2019版)進(jìn)行統(tǒng)計分析,用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PUT蛋白親緣關(guān)系和結(jié)構(gòu)

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果將擬南芥、水稻和高粱多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為3大類:第Ⅰ類蛋白最多,包含4個擬南芥多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和2個水稻多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,分別為AtPUT1、AtPUT2、AtPUT3、AtPUT5、OsPUT1和OsPUT5;第Ⅱ類只有3個蛋白,水稻中有OsPUT6;第Ⅲ類中含有3個水稻多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPUT2、OsPUT3和OsPUT4(圖1-A)。OsPUT5是一種C端和N端都位于細(xì)胞膜外且含有10個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白(圖1-B),具有腐胺-鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PotE結(jié)構(gòu)域和氨基酸通透酶AA_permease_2結(jié)構(gòu)域(圖1-C)。

A,水稻和其他物種PUT家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹;B,OsPUT5蛋白含10個跨膜結(jié)構(gòu)域且N端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)側(cè);C,OsPUT5蛋白保守的結(jié)構(gòu)域,黑條顯示氨基酸序列的長度。A, Phylogenetic tree of PUT family protein in rice and other plants; B, A cartoon representation showing the 10 transmembrane domains in the OsPUT5 protein with both C-and N-termini in the cytoplasmic side; C, Domains conserved in the OsPUT5 protein. The black bar shows the length of the amino acid sequence.圖1 OsPUT5蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of OsPUT5 protein

2.2 OsPUT5基因表達(dá)模式、轉(zhuǎn)基因苗鑒定和基因表達(dá)水平

用特異性引物分別對RNAi株系和OE株系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別在500～600 bp(550 bp)和400～500 bp (440 bp)有特異條帶(圖2-A和圖2-B),表明目的基因已經(jīng)整合進(jìn)相應(yīng)水稻染色體上。RNAi株系和OE株系分別在含草銨膦或潮霉素的培養(yǎng)基上經(jīng)過兩代篩選,獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。qRT-PCR結(jié)果顯示:RNAi株系中OsPUT5基因表達(dá)水平顯著低于Nip株系,在OE株系中,OsPUT5基因表達(dá)水平顯著高于Nip株系(圖2-C)。qRT-PCR結(jié)果顯示,OsPUT5基因在Nip株系的根、莖和花中的表達(dá)量差異不顯著,葉片中OsPUT5表達(dá)量顯著高于根、莖和花(圖2-D)。

A,RNAi株系DNA水平檢測,1～6為抗性苗,7為pFGC5941-OsPUT5-RNAi質(zhì)粒;B,OE株系DNA水平檢測,1～4為抗性苗,5為pCAM1390-OsPUT5質(zhì)粒;C,OE株系和RNAi株系RNA水平檢測;D,OsPUT5基因表達(dá)模式。柱上無相同字母代表差異顯著(P<0.05),誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差,下同。A, DNA level detection of RNAi lines, 1-6 were resistant plantlets, 7 was pFGC5941-OsPUT5-RNAi plasmid; B, DNA level detection of OE lines, 1-4 were resistant plantlets, 5 was pCAM1390-OsPUT5 plasmid; C, RNA level detection in OE lines and RNAi lines; D, OsPUT5 expression pattern. Different lowercase letters indicated significant difference at P <0.05, the error bars represented the standard deviation. The same as below.圖2 轉(zhuǎn)基因苗鑒定和基因相對表達(dá)水平檢測Fig.2 Identification of transgenic seedlings and detection of gene expression level

2.3 OsPUT5基因抑制表達(dá)降低了水稻對低溫脅迫的抗性

低溫脅迫處理前,OE株系、Nip株系和RNAi株系幼苗表型差異不明顯(圖3-A)。4 ℃處理30 h后,OE株系與Nip株系的第一片葉片表現(xiàn)出一定程度的枯萎,但區(qū)別不大,RNAi株系整株枯萎,第1片葉、第2片葉、第3片葉和第4片葉失水嚴(yán)重(圖3-B)。RNAi株系鮮重顯著低于OE株系和Nip株系,OE株系和Nip株系鮮重?zé)o顯著差異,而3個株系的干重?zé)o顯著差異(圖3-C)。低溫處理前,OE株系、Nip株系和RNAi株系脯氨酸含量、相對電導(dǎo)率和丙二醛含量無明顯差異;低溫處理后,3個株系脯氨酸含量、相對電導(dǎo)率和丙二醛含量與處理前相比均顯著升高,RNAi株系的脯氨酸含量顯著低于OE株系和Nip株系,而相對電導(dǎo)率和丙二醛含量則顯著高于OE和Nip株系(圖3-D、圖3-E和圖3-F)。4 ℃處理30 h后,繼續(xù)正常溫度培養(yǎng)10 d,3個株系均表現(xiàn)出葉片發(fā)黃和葉尖枯萎的情況(圖3-G),但是,RNAi株系存活率顯著低于OE株系和Nip株系(圖3-H)。

G,植株低溫處理后繼續(xù)正常培養(yǎng)10 d后的表型;H,植株低溫處理后繼續(xù)正常培養(yǎng)10 d后的存活率。G, Phenotype of plant after 10 days of normal culture after low temperature treatment; H, The survival rate of plants after 10 days of normal culture after low temperature treatment.圖3 OE株系、Nip株系和RNAi株系幼苗耐低溫性比較Fig.3 Comparison of cold tolerance of seedlings of OE lines, Nip lines and RNAi lines

2.4 OsPUT5基因的表達(dá)水平不影響水稻成熟期相關(guān)農(nóng)藝性狀

我們跟蹤了3種株系的完整生命周期,在田間生長條件下沒有觀察到明顯的差異表型。在水稻成熟期,OE株系、Nip株系和RNAi株系植株的株高、穗長、每穗粒數(shù)、初級枝梗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等指標(biāo)均無顯著差異(表2),說明OsPUT5基因的表達(dá)水平不影響水稻成熟期相關(guān)農(nóng)藝性狀。

表2 OE株系、Nip株系和RNAi株系主要農(nóng)藝性狀的比較Table 2 Comparison of main agronomic characters of OE lines, Nip lines and RNAi lines

3 討論

本研究從水稻基因組中鑒定出6個OsPUT基因。擬南芥、水稻和高粱PUT蛋白分為3大類,其中AtPUT1、AtPUT2、AtPUT3、AtPUT5、OsPUT1和OsPUT5歸為同一類,說明OsPUT5與這些蛋白具有一定的同源性,可能具有類似PA轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。突變體atput3對0.1 μmol·L-1PQ具有一定的抗性,而OsPUT1基因在突變體atput3中異源表達(dá)后恢復(fù)了對PQ的敏感性[28]。AtPUT3基因沉默導(dǎo)致擬南芥韌皮部分泌物中維生素B和PA的缺失,破壞了這些化合物在器官中的穩(wěn)態(tài),從而影響擬南芥生長發(fā)育[21]。Li等[24]的研究表明,水稻OsPAR1定位在高爾基體,參與葉綠體中PQ的運(yùn)輸,基因超表達(dá)導(dǎo)致水稻對PQ敏感性增加,抑制表達(dá)提高水稻對PQ的抗性。Zhao等[29]將OsPUT5蛋白歸為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體PHS亞族,自然生長條件下30日齡、60日齡Nip株系中OsPUT5基因只在穗中特異性表達(dá),根、葉、莖中不表達(dá);而本研究中該基因在Nip株系開花時葉片中表達(dá)量最高,根、莖和花中無顯著差異,這種差異可能是取材方式、部位和時間不一致導(dǎo)致的。

OsPUT5是一種含有10個跨膜結(jié)構(gòu)且N端和C端都位于胞質(zhì)側(cè)的膜蛋白,同時還含有腐胺-鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PotE特有結(jié)構(gòu)域。PotE由12個跨膜片段組成且N末端和C末端位于細(xì)胞質(zhì)中,在中性pH下負(fù)責(zé)吸收腐胺;酸性pH下負(fù)責(zé)排出;鳥氨酸可誘導(dǎo)PotE的表達(dá),對細(xì)胞生長非常重要[30]。5個AtPUT都具有PotE非常保守的結(jié)構(gòu)域[18],在擬南芥氨基酸、PA和硫胺的運(yùn)輸中發(fā)揮作用[17-18]。

AtPUT5基因突變后導(dǎo)致擬南芥提早開花,葉片中亞精胺和亞精胺結(jié)合物含量顯著降低,Ahmed等[23]認(rèn)為,PA轉(zhuǎn)運(yùn)在調(diào)控細(xì)胞PA濃度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在田間生長條件下,OsPUT5轉(zhuǎn)基因株系在完整生命周期內(nèi)沒有觀察到明顯的表型差異,農(nóng)藝性狀與Nip株系相似,表明OsPUT5基因的超表達(dá)和抑制表達(dá)對水稻的正常生長發(fā)育沒有產(chǎn)生明顯影響,這與前人的研究結(jié)果一致[24]。在亞精胺誘導(dǎo)擬南芥PA反應(yīng)的研究中,四重突變體lat1/2/3/5和lat1/2/4/5表型與野生型類似[4]。這可能是PUT家族亞細(xì)胞定位不同、不同轉(zhuǎn)運(yùn)活性或者轉(zhuǎn)運(yùn)功能的冗余,也可能是所屬PHS家族中其他成員也發(fā)揮了作用。煙草亞細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,OsPUT3定位于葉綠體,將其基因?qū)霐M南芥后,引起蓮座葉、莖和開花時間出現(xiàn)一定程度的變化[23],原因可能是擬南芥和水稻的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制存在一定差異,而OsPUT3基因在擬南芥中屬于外源表達(dá)。

甜橙(Citrussinensis)愈傷組織冷處理后CsPUT基因表達(dá)發(fā)生變化,超表達(dá)CsPUT4提高了內(nèi)源性PA含量并導(dǎo)致愈傷組織抗寒能力增強(qiáng)[31]。Li等[32]研究表明,ABA和PA相互調(diào)節(jié)生物合成,可觸發(fā)抗氧化系統(tǒng)信號,提高甜瓜(CucumismeloL.)抗寒性。OE株系抗低溫能力沒有增強(qiáng)的原因可能是OsPUT家族基因存在功能冗余。RNAi株系經(jīng)過低溫處理后,抗寒能力下降,這可能是在低溫條件下,抑制OsPUT5基因表達(dá)影響水稻幼苗的PA含量,導(dǎo)致相關(guān)生理狀態(tài)發(fā)生改變,從而導(dǎo)致幼苗抗寒能力下降。缺少RNAi株系和OE株系成熟期抗寒性研究、突變體基礎(chǔ)上的功能互補(bǔ)研究,以及PA含量與激素之間的關(guān)系研究是本研究的不足之處。總之,本研究初步闡明了OsPUT5基因在水稻抗低溫脅迫過程中的作用,為后續(xù)該基因的功能研究提供了一定的啟示。