吳 嬌,龔成宇,陳超群,陳紅旭,劉俊宏,唐文靜,初元琦,楊文龍,張 瑤,龔榮高

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,四川 成都 611130)

黃果柑(Citruscultivarcv. Huangguogan)屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus),具無核、優(yōu)質(zhì)、晚熟等特點,是我國大渡河流域中段干暖河谷區(qū)特有的天然雜交柑資源[1]。漢源地區(qū),黃果柑適宜栽培的海拔范圍為800～1 200 m,不同海拔因溫度、濕度和光照等生態(tài)因子的差異大幅度地影響著果實的品質(zhì)及生長代謝[2]。柑橘果實中含豐富內(nèi)含物,糖分、有機酸含量及二者比值是決定果實風(fēng)味的重要指標[3]。果實內(nèi)有機酸含量比糖含量的變化幅度大,因此有機酸對決定糖酸比大小而言更為重要[4]。已有柑橘有機酸代謝方面研究表明,檸檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、順-烏頭酸酶(ACO)和異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)是檸檬酸代謝的關(guān)鍵酶[5],上述酶通過三羧酸循環(huán)共同參與檸檬酸代謝;在不同砧木與黃果柑果實有機酸含量的影響研究中,NADP-IDH被認為是關(guān)鍵限制因子[6]。目前黃果柑產(chǎn)地因海拔不同造成果實品質(zhì)差異明顯,一定程度上制約了黃果柑產(chǎn)業(yè)的均衡發(fā)展。本試驗主要通過測定不同海拔間黃果柑果實中有機酸含量、檸檬酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達量之間的關(guān)聯(lián)性,掌握海拔對黃果柑有機酸代謝的影響,為因地制宜栽培黃果柑,提高果實品質(zhì),提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地位于四川省雅安市漢源縣小堡藏族彝族鄉(xiāng)(102°33′E,29°18′N),地處大渡河中游南岸,山地地形,海拔840～1 200 m,年均氣溫16.5 ℃,無霜期300 d左右,日照時數(shù)達1 475.8 h,年活動積溫>5 500 ℃,年均降水量650 mm,土壤類型為紅壤土。

1.2 試驗材料

本次試驗在同一山體海拔高度分別為875 m、1 014 m和1 174 m處選取3個黃果柑種植樣點作為本試驗的3個處理(3個點的環(huán)境情況如表1所示),各海拔3個小區(qū),每小區(qū)3株,共27株7年生黃果柑,砧木枳殼,株行距2.5 m × 4 m,所有黃果柑的栽植均為東西行向,樹勢、樹距、管理方式等一致。試驗材料從2018年4月開始統(tǒng)一管理,觀察記錄各樣點開花時期,于花后75 d開始,每隔15 d進行一次樣品采集(每株樹樹冠外圍中上部的東、南、西、北四個方向各3個),直至果實成熟,將采集的果實液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同海拔高度黃果柑園區(qū)的主要氣候因子差異Table 1 The difference of main climatic factors in Huangguogan gardens at different altitudes

1.3 黃果柑果實有機酸組分含量測定方法

參照肖玉明[7]的高效液相色譜(HPLC)法,檢測條件略作修改。流動相[甲醇∶磷酸二氫鉀(0.06 mol·L-1,pH值2.5)=4∶96(V/V)],上機前抽濾(有機相,0.22 μm)超聲(25 ℃、20 min);進樣量為10 μL。

1.4 黃果柑果實檸檬酸代謝相關(guān)酶活性測定方法

檸檬酸代謝相關(guān)酶液制備和酶活性測定參照龔榮高[8]的方法。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

果實RNA提取按照TreliefTMRNAprep Pure Plant Plus Kit (Polysaccharides &Polyphenolics-rich) RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進行。提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別進行質(zhì)量檢測和濃度分析,然后再按照GoldenstarM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver. 2反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,合成試驗所需cDNA。

1.6 果實有機酸代謝相關(guān)酶基因qPCR分析

參考曹淑燕[9]的黃果柑相關(guān)基因序列片段,運用Primer 6.0軟件進行引物設(shè)計,設(shè)計序列見表2,使用2×TsingKEMaster qPCR Mix (SYBR Green I)熒光定量試劑盒進行qPCR驗證。

表2 黃果柑果實有機酸代謝相關(guān)酶基因qPCR序列Table 2 qPCR sequence of organic acid metabolism-related enzymes in Huangguogan fruit

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel和SPSS 20.0軟件整理并分析,采用Origin85軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔對黃果柑果實發(fā)育過程中酸含量的影響

由圖1知,各海拔黃果柑果實蘋果酸和奎寧酸含量花后75～330 d呈下降趨勢,在果實發(fā)育后期趨于平穩(wěn),且含量占比較低;檸檬酸含量與有機酸含量變化趨勢一致,在果實發(fā)育前期增加中后期降低,含量占比高達48.48%～96.85%,說明黃果柑果實有機酸的積累以檸檬酸為主。在果實發(fā)育前期(檸檬酸大量合成時期),隨著海拔升高,檸檬酸含量越高,而成熟期檸檬酸含量與海拔高度呈反比,說明檸檬酸含量在后期降解是影響果實有機酸含量的主要原因,海拔越高,檸檬酸降解程度越大。

2.2 海拔對檸檬酸合成酶類活性的影響

由圖2知,CS活性自花后135 d活性差異較小。與之類似,不同海拔間MDH的活性差異不大。說明CS、MDH活性與檸檬酸含量及海拔的關(guān)聯(lián)性不大,不同海拔間果實檸檬酸含量最終差異并非由CS和MDH活性差異造成。PEPC活性和檸檬酸含量在果實發(fā)育中后期都呈下降趨勢,且在成熟期都表現(xiàn)為海拔越高,活性和含量越低。由此可以得出,在試驗海拔范圍內(nèi),海拔越高,PEPC活性越低,檸檬酸合成量越少。

圖2 不同海拔黃果柑果實成熟期有機酸合成酶類活性的變化Fig.2 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.3 海拔對檸檬酸分解酶類活性的影響

由圖3知,各海拔間細胞質(zhì)ACO和NADP-IDH活性分別自花后105 d和195 d開始表現(xiàn)出與果實檸檬酸降解程度相一致的規(guī)律,即海拔1 174 m>1 014 m>875 m,NADP-IDH活性隨著果實成熟逐漸升高,特別是在255 d后劇烈增加,細胞質(zhì)ACO活性全程保持在較高水平。線粒體ACO活性在不同海拔間沒有表現(xiàn)出明顯規(guī)律,且自花后135 d開始其活性穩(wěn)定在較低水平。由此說明,NADP-IDH作用關(guān)鍵時期是在果實成熟后期,一定范圍內(nèi)海拔升高顯著提升了檸檬酸降解階段果實細胞質(zhì)ACO活性和成熟期NADP-IDH活性,從而促進了檸檬酸降解,造成黃果柑果實檸檬酸含量隨海拔升高而降低。

圖3 不同海拔黃果柑果實成熟期有機酸分解酶類活性的變化Fig.3 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.4 海拔對檸檬酸合成酶類基因表達的影響

由圖4知,MDH基因表達量呈下降-上升-下降的趨勢,與其酶活性變化趨勢有較大差異,CS和PEPC基因表達量與二者酶活性的變化趨勢雖大體一致,但CS自花后135 d開始,其基因表達豐度差異在不同海拔間的規(guī)律較為紊亂,PEPC基因在各海拔間的相對表達豐度差異也不大,表明海拔與檸檬酸合成酶類的基因表達沒有明顯關(guān)系。

圖4 不同海拔黃果柑果實成熟期有機酸合成酶類基因相對表達豐度的變化Fig.4 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme genes in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.5 海拔對檸檬酸分解酶類基因表達的影響

圖5顯示,各海拔間ACO和NADP-IDH基因相對表達豐度自花后165 d開始表現(xiàn)為海拔1 174 m>1 014 m>875 m,由高到低各海拔果實ACO基因相對表達量的峰值在果實發(fā)育前期出現(xiàn)在花后135 d,后期則分別出現(xiàn)在花后240 d、300 d和330 d,NADP-IDH的基因相對表達豐度和酶活性自花后195 d開始,都表現(xiàn)出隨海拔升高而上升的趨勢。由此判斷,海拔的升高可能會通過提前啟動ACO基因表達和增加NADP-IDH基因表達量來提升細胞質(zhì)ACO及NADP-IDH活性,以促進果實檸檬酸的降解。

圖5 不同海拔黃果柑果實成熟期有機酸分解酶類基因相對表達豐度的變化Fig.5 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme gengs in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

3 討論

黃果柑果實有機酸中檸檬酸占比最大,且在果實酸降解過程中降解最多,這與代琳等[10]研究一致,其在不同海拔之間的不同降解程度是導(dǎo)致黃果柑果實有機酸含量最終差異的決定性因素。

在本研究的海拔區(qū)段內(nèi),海拔主要通過影響檸檬酸降解程度來影響有機酸含量,海拔越高果實發(fā)育后期檸檬酸降解程度越大,這與曹永華等[11]和孫國超等[12]研究結(jié)果相近。毛如志等[13]研究也表明,美樂葡萄果實酸含量變化受到海拔區(qū)段影響。與之相反,羅顯揚等[14]對朋娜臍橙研究認為果實有機酸的含量與海拔呈正相關(guān),這可能是與不同果實種類有關(guān)。

海拔主要是通過對光、熱、水、氣、土壤和生物等生態(tài)因子的影響而對果實品質(zhì)起間接的生態(tài)作用。光照是黃果柑光合作用的能量來源,有研究表明,在秋季陰雨低溫天氣中,隨著日照時數(shù)的增加,尾張溫州蜜柑酸度相應(yīng)增加[1],此外,在馬瑟蘭葡萄的研究中也有數(shù)據(jù)指出,葡萄果穗遮光后其可滴定酸含量增加,完全遮光后,可滴定酸含量顯著增加[2]。溫度主要通過影響光合作用的效率而影響果實碳水化合物的積累,我國甜橙在日均氣溫≥10 ℃的活動積溫低于8 000 ℃時,隨年積溫的增加,可滴定酸含量逐漸降低[3],大多數(shù)柑橘品種在炎熱潮濕的熱帶地區(qū)含酸量低于亞熱帶地區(qū)[4]。降雨量和空氣濕度也會在不同程度上影響果實的可滴定酸含量,有報道指出,生長期降雨量與蘋果果實中的有機酸含量呈顯著正相關(guān)[5],空氣相對濕度越低,柑橘果實的酸含量也越低[6]。在本研究中,黃果柑園區(qū)中主要氣候因子在不同海拔間均表現(xiàn)出了一定的差異,隨著海拔的升高,光照強度、年平均空氣相對濕度和年平均日溫差表現(xiàn)出了增大的趨勢,海拔1 174 m處的光照強度、年平均空氣相對濕度和年平均日溫差較海拔875 m處分別增加約8.2%、6.2%和59.7%,而年平均氣溫和≥10 ℃年積溫這兩個指標則隨著海拔的升高而降低,海拔1 174 m處的年平均氣溫和≥10 ℃年積溫較海拔875 m處分別降低約13.7%和6.2%。由此說明,不同海拔間的主要氣候因子差異較大,但哪個氣候因子是造成不同海拔間黃果柑糖品質(zhì)差異的關(guān)鍵還需要進一步分析。

不同海拔果實檸檬酸代謝相關(guān)酶活性測試結(jié)果表明,各海拔間CS活性僅在花后75～105 d表現(xiàn)出顯著差異,之后沒有表現(xiàn)出較強活性差異規(guī)律,這可能是造成果實有機酸積累階段在不同海拔間出現(xiàn)差異的原因。PEPC和MDH活性整體表現(xiàn)出下降趨勢,這可能是造成檸檬酸含量在花后120 d開始降低的重要原因。MDH在整個發(fā)育期沒有表現(xiàn)出較強活性差異規(guī)律,果實發(fā)育中后期PEPC活性與檸檬酸含量在不同海拔間表現(xiàn)出一致規(guī)律,說明不同海拔間PEPC活性差異對檸檬酸含量具有一定影響。細胞質(zhì)ACO活性在果實成熟期活性較高,NADP-IDH活性隨著果實成熟逐漸升高,且表現(xiàn)為海拔越高,果實檸檬酸降解程度越高,說明成熟期細胞質(zhì)ACO活性的增加有利于降低果實檸檬酸水平[21],NADP-IDH是果實發(fā)育后期檸檬酸降解的關(guān)鍵酶,這與龔榮高[8]在不同生境下臍橙果實酸代謝中所找到的主要酶一致?？偟膩碚f,一定范圍內(nèi)海拔升高顯著提升了果實檸檬酸降解階段細胞質(zhì)ACO活性和NADP-IDH活性,從而促進了檸檬酸降解,造成黃果柑果實檸檬酸含量隨海拔升高而降低。

各酶基因表達豐度的結(jié)果表明,由高到低各海拔果實ACO基因相對表達量峰值出現(xiàn)的時間有所提前,說明海拔升高可能是通過提前啟動ACO基因的表達來提升細胞質(zhì)ACO的活性。NADP-IDH基因表達量隨海拔上升的趨勢也說明,海拔升高有利于提升果實NADP-IDH基因的相對表達豐度,從而調(diào)控其酶活性,促進果實檸檬酸的降解,造成不同海拔間果實有機酸的含量差異,這與曹淑燕等[6]在不同砧木黃果柑果實酸代謝的研究中所找到的差異關(guān)鍵基因具有一致性。本研究中PEPC活性在不同海拔間差異顯著,但PEPC基因的表達在不同海拔間卻沒有顯著差異,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體原因還有待進一步研究。

4 結(jié)論

黃果柑果實有機酸的積累以檸檬酸為主,不同海拔間果實有機酸含量差異是由檸檬酸降解程度不同所引起的,一定范圍內(nèi)隨海拔升高果實檸檬酸含量反而下降。海拔的改變帶來的光照、溫度和濕度等氣象因子的改變可能是造成酸積累差異的重要因素。NADP-IDH、細胞質(zhì)ACO和PEPC是造成不同海拔間有機酸積累差異的主要酶。海拔的升高可能會通過提前啟動ACO基因表達和增加NADP-IDH基因表達量來增加細胞質(zhì)ACO及NADP-IDH活性,促進果實檸檬酸的降解,導(dǎo)致果實有機酸含量降低。因此,在生產(chǎn)中進行栽培時,應(yīng)注意海拔對黃果柑果實酸積累的影響。結(jié)合本文的研究結(jié)果而言,在四川地區(qū)種植黃果柑應(yīng)選擇高海拔內(nèi)較為適宜,此時果實有機酸含量最低。