祝 慧，牟強強，徐會圃

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 濱州 256603）

心血管疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人們死亡的主要疾病，其中急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是冠心病最嚴重的類型，在所有心血管疾病中致死率最高[1]。雖然AMI 的治療策略在過去幾十年中已經(jīng)得到了很大改善，但仍存在很多局限性。中藥防治冠心病由來已久，麝香保心丸（SBP）是其中的代表性藥物[2]，具有改善血管內(nèi)皮功能、舒張血管、調(diào)節(jié)冠狀動脈血流量、增加心肌供血、抑制炎癥因子釋放、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)等作用[3]，但其具體機制仍不清楚。JAK2/STAT3 通路參與了包括細胞生長、分化、增殖、凋亡和炎癥等多個生理過程。以往的研究表明，JAK2/STAT3 信號通路可以調(diào)控細胞周期進展和血管生成相關(guān)基因的表達，參與心肌梗死后的血管新生[4]。但關(guān)于麝香保心丸對AMI 后血管再生的具體機制是否與JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)尚不清楚?；诖?，本研究就麝香保心丸通過JAK2/STAT3 信號通路對兔AMI血管再生的作用與機制進行探討與分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

純種雄性新西蘭大白兔，購于濟南西嶺角生物科技有限公司，體重2 ～2.5 kg，實驗動物許可證號：SCXK（魯）2020-0004。將白兔分籠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物實驗中心，溫度保持在20 ～25 ℃，濕度保持在50% ～70%。每天12 h 輪換照明，所有白兔均自由飲水，每天2 次按時按量喂養(yǎng)飼料。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：水合氯醛，購于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；AG490，購于美國AbMole 公司；VEGF 抗體，購自Proteintech 公司；Ang-1 抗體，購自AFFINITY 公司；JAK2 抗體，購于ZBNBIO 公司；STAT3 抗體，購于HUABOIO 公司。儀器：熒光定量PCR 儀、電泳槽、電轉(zhuǎn)裝置、電泳儀，購于Biorad 公司；臺式低溫離心機，購于德國Eppendorf 公司；Micro Gmbh 切片機，購于德國Microm International GmbH 公司；顯微鏡、Motic 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，購于日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模 術(shù)前所有實驗動物均禁食不禁水8 h，稱重。將兔置于兔箱內(nèi)，清理耳緣靜脈附近的兔毛，以10% 水合氯醛（3 mL/kg）耳緣靜脈麻醉。將兔固定于手術(shù)臺上，連接心電圖機記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。清理胸前區(qū)兔毛，碘伏消毒，找到心臟搏動最強點，在心臟搏動最強點處做一長約3 cm 的手術(shù)切口，逐層分離肌肉，闊開肋骨，暴露心臟，找到冠狀動脈左前降支，用6-0 手術(shù)縫線在冠狀動脈左前降支約1/2處結(jié)扎，CON 組只穿線不結(jié)扎。術(shù)后用4-0 手術(shù)縫線逐層關(guān)胸，記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高表示造模成功。腹腔注射80 萬單位青霉素預(yù)防感染。

1.3.2 分組及給藥 采用隨機數(shù)表法，將實驗動物分為5 組（n=10）。CON 組不結(jié)扎冠狀動脈左前降支，術(shù)后每天以3 mL 生理鹽水灌胃；其余4 組均結(jié)扎冠狀動脈左前降支，其中AMI 組每天以3 mL 生理鹽水灌胃，SBP 組每天以50 mg/kg 的劑量將麝香保心丸溶于3 mL 生理鹽水中灌胃，AG 組每天以0.4 mL/kg 的劑量皮下注射AG490 并給予3 mL 生理鹽水灌胃，S+A組每天以50 mg/kg 的劑量將麝香保心丸溶于3 mL生理鹽水中灌胃，并以0.4 mL/kg 的劑量皮下注射AG490。

1.3.3 標本采集 術(shù)后第7 d，將耳緣靜脈麻醉實驗用兔沿原手術(shù)切口取出心臟，用PBS 緩沖液沖洗干凈，留取梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)的心肌組織，用4% 的多聚甲醛對部分心肌組織進行固定，經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌梗死區(qū)的病理變化及炎癥反應(yīng)，經(jīng)免疫組化（IHC）觀察血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管緊張素Ⅰ（Ang-Ⅰ）及磷酸化酪氨酸激酶2（p-JAK2）、磷酸化信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3（p-STAT3）的表達以及CD31 陽性的微血管密度（Microvascular density，MVD）；部分液氮速凍用于檢測JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表達水平。

1.3.4 心肌組織病理變化 心肌組織經(jīng)多聚甲醛固定24 h 后取出，制備常規(guī)石蠟包埋切片，行HE 染色后在200 倍光鏡下觀察病理改變。

1.3.5 心肌組織中血管生成因子及p-JAK2、p-STAT3的表達 心肌組織切片后常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)及封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加稀釋好的一抗（稀釋比例：VEGF 1:250、Ang-1 1:400、p-JAK2 1:100、p-STAT3 1:100），4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫30 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復(fù)染等步驟后封片。顯微鏡下觀察, 胞漿出現(xiàn)棕黃色即為陽性。統(tǒng)一圖像采集條件，200 倍光鏡下，每張切片選取5 個不重疊視野進行觀察，并應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行分析。

1.3.6 心肌組織MVD 的測定 心肌組織脫水、包埋、切片后經(jīng)IHC 染色，CD31 工作濃度為1:300，DAB顯色，染色后血管內(nèi)皮細胞被染成棕黃色。400 倍光鏡下，每張切片隨機選取5 個視野進行觀察，MVD的計數(shù)方法參照Weidner 法[5]。

1.3.7 心肌梗死邊緣區(qū)JAK2 及STAT3 的蛋白表達

取凍存管內(nèi)的心肌組織，放在研缽中研磨裂解，于4 ℃離心機中離心10 min 后取上清液。100 ℃變性處理后取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGF 電泳分離, 轉(zhuǎn)移至NC膜上, 37 ℃下封閉1.5 h。加入1:1000 稀釋的JAK2、STAT3 及β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜，再加入二抗37 ℃孵育2 h。以ECL 發(fā)光顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。運用Image J 軟件分析條帶的灰度值，實驗重復(fù)三次，取平均值。

1.3.8 心肌組織中JAK2、STAT3 的mRNA 表達 取凍存管內(nèi)的心肌組織，按照RNA 提取試劑盒的說明書提取mRNA，隨后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR 等步驟，得到JAK2、STAT3 及內(nèi)參基因的Ct 值。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，以GAPDH 作為內(nèi)參，通過2-△△Ct 法比較各組心肌組織中JAK2、STAT3 的mRNA 相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 27.0 及GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS 法分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麝香保心丸對兔AMI 模型心肌組織病理狀態(tài)的影響

如圖1 所示，CON 組心肌細胞染色均勻，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核呈橢圓形，心肌纖維排列整齊，清晰可見，無中性粒細胞浸潤。AMI 組心肌細胞排列紊亂，細胞核顯示不清，心肌纖維溶解斷裂，間質(zhì)中可見中性粒細胞浸潤。SBP 組可見心肌細胞排列好于AMI 組，差于CON 組，細胞核多數(shù)可見，心肌纖維呈波浪樣變，未見明顯斷裂現(xiàn)象，且有纖維修復(fù)現(xiàn)象。AG 組心肌細胞排列差于AMI 組，細胞結(jié)構(gòu)破壞更加明顯，細胞核消失，心肌纖維明顯紊亂，中性粒細胞浸潤明顯。S+A組心肌細胞排列好于AG 組，差于SBP 組。

圖1 HE 染色×200 結(jié)果

2.2 麝香保心丸對兔AMI 模型心肌血管再生因子及p-JAK2、p-STAT3 表達的影響

如圖2 至圖5 所示，CON 組棕黃色染色分布稀疏，染色淺；與CON 組相比，AMI 組染色明顯加深；與AMI 組相比，SBP 組染色更深，而AG 組染色最淺；S+A 組染色較SBP 組淺，但較AG 組深。如圖6 所示，與CON 組相比，AMI 組VEGF、Ang- Ⅰ、p-JAK2、p-STAT3 蛋白的MOD 值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SBP 組上述4 種蛋白的平均光密度（MOD）值最高，AG 組最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；S+A 組上述4 種蛋白的MOD 值較SBP 組低，但較AG 組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 VEGF 蛋白的表達情況×200

圖3 Ang-1 蛋白的表達情況×200

圖4 p-JAK2 蛋白的表達情況×200

圖5 p-STAT3 蛋白的表達情況×200

圖6 VEGF、Ang Ⅰ及p-JAK2、p-STAT3 的MOD 值（mean±SD）

2.3麝香保心丸對兔AMI 模型心肌CD31 陽性MVD 的影響

如圖7 至圖8 所示，AMI 組左室梗死邊緣區(qū)的CD31 陽性MVD 大于CON 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與AMI 組相比，SBP 組左室梗死邊緣區(qū)的CD31 陽性MVD 明顯增大，而AG 組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與S+A 組相比，SBP組左室梗死邊緣區(qū)的CD31 陽性MVD 增大，而AG 組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖7 CD31 陽性血管的分布情況×400

圖8 CD31 陽性的MVD（mean±SD）

2.4 麝香保心丸對兔AMI 模型心肌JAK2、STAT3的mRNA 及蛋白表達的影響

如圖9 至圖11 所示，與CON 組相比，AMI 組中JAK2 的mRNA 及蛋白表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而STAT3 的mRNA 及蛋白表達雖較CON 組高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與AMI 組相比，SBP 組JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表達水平均明顯升高，而AG 組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與S+A 組相比，SBP 組JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表達水平均升高，而AG 組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖10 JAK2、STAT3 蛋白的表達情況

圖11 JAK2、STAT3 mRNA 的擴增情況

3 討論

AMI 是缺血性心臟?。↖HD）中最危重的一種類型。在我國，AMI 的發(fā)病率不斷攀升，并且有年輕化的趨勢[6]。近年來，隨著溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）及CAPG 技術(shù)的普及，心肌梗死患者急性期的死亡率正逐年下降[7]。然而，各種損傷因素常導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域的MVD 顯著降低，進一步加重心肌損傷。在此背景下，如何促進梗死區(qū)的血管再生已成為目前AMI 治療的重要研究方向。在AMI 的修復(fù)過程中，我們可以看到冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的形成[8]，然而，機體自身生成的新血管往往不足以代償。因此，刺激缺血區(qū)小血管生長，完成缺血區(qū)血管的自我搭橋便成為了重要的治療方法[9]。相關(guān)的研究表明，在缺血區(qū)血管生成的過程中，JAK2/STAT3 通路對于血管生長因子的激活起到關(guān)鍵作用。麝香保心丸是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的經(jīng)典復(fù)方制劑[10]，它可以通過調(diào)控Notch/Delta、Hippo-YAP 等血管新生相關(guān)的信號通路，發(fā)揮治療性血管新生的作用[11]。JAK2/STAT3通路對心肌細胞的存活、凋亡及心室重塑有重要影響[12]。研究表明，JAK2/STAT3 信號通路可以促進血管生成相關(guān)基因的表達，參與AMI 后血管新生[4]。因此我們推測，麝香保心丸促進血管再生的作用部分能通過激活JAK2/STAT3 信號通路實現(xiàn)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后的HE 染色病理切片用麝香保心丸干預(yù)后，心肌橫紋模糊不清但未見明顯斷裂，且可以看到纖維修復(fù)現(xiàn)象，表明心肌組織損傷壞死程度比AMI 組小，修復(fù)速度較AMI 組快。AG 組心肌細胞排列比AMI 組差，細胞結(jié)構(gòu)破壞更加明顯，細胞核消失，中性粒細胞浸潤較AMI 組更加明顯，表明AG490 可以阻斷JAK2/STAT3 通路介導(dǎo)的心肌保護作用。S+A組心肌細胞排列好于AG 組，差于SBP 組，表明麝香保心丸對心肌的保護作用部分可被AG490 抑制，也進一步說明麝香保心丸發(fā)揮心肌保護作用可能與JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)。此外，我們采用IHC 形象地顯現(xiàn)VEGF 及Ang-1 在心肌組織中的分布，結(jié)果顯示，AMI 組VEGF 的蛋白表達水平較CON 組升高（P＜0.05），表明AMI 可激發(fā)VEGF 的表達；與CON 組相比，SBP 組VEGF 及Ang-1 的蛋白表達水平均明顯增加（P＜0.05），表明麝香保心丸有促進血管新生的作用；AG 組則明顯下降（P＜0.05），表明AMI 后的血管新生與JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)；AG490 干預(yù)后，SBP 組上述因子的蛋白表達水平較前下降（P＜0.05），表明AG490 可以逆轉(zhuǎn)麝香保心丸的作用，提示麝香保心丸可通過JAK2/STAT3 信號通路發(fā)揮促進血管生成的作用。

MVD 是反映側(cè)支循環(huán)的最可靠指標。因此，本研究中我們檢測了CD31 陽性的MVD，結(jié)果顯示，AMI 組CD31 陽性的MVD 較CON 組減少（P＜0.05），表明AMI 并沒有使有功能的新生血管密度增加；SBP組CD31 陽性的MVD 較CON 組明顯增加（P＜0.05），表明麝香保心丸可以促進AMI 后有功能的血管新生，這種作用可被AG490 阻斷，進一步證實麝香保心丸對血管再生的促進作用是通過JAK2/STAT3 信號通路實現(xiàn)的。本研究中我們用qRT-PCR 及western blot 測定了JAK2、STAT3 mRNA 及蛋白的相對表達量，結(jié)果顯示，AMI 組JAK2 的mRNA 及蛋白表達量均高于CON 組（P＜0.05），表明AMI 可刺激損傷區(qū)域心肌細胞JAK2 的mRNA 及蛋白表達，AMI 組STAT3 的mRNA 及蛋白表達量雖然高于CON 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；SBP 組JAK2、STAT3 的mRNA及蛋白表達量均較AMI 組高（P＜0.05），意味著麝香保心丸可以增加JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表達量；S+A 組損傷區(qū)域心肌組織中JAK2、STAT3的mRNA 及蛋白表達量均較SBP 組低（P＜0.05），且均較AG 組高（P＜0.05），表明AG490 可部分阻斷麝香保心丸的作用，更加證實了麝香保心丸可通過激活JAK2/STAT3 信號通路增加其mRNA 及蛋白的表達量，發(fā)揮心臟保護作用。JAK2、STAT3 激活后以p-JAK2、p-STAT3 的性質(zhì)存在，我們通過IHC 形象地顯示p-JAK2、p-STAT3 在心肌組織的表達與分布，結(jié)果顯示，AMI 組的p-JAK2 染色較CON 組深，但p-STAT3 染色較對照組差異不明顯；與AMI 組相比，AG 組顏色最淺，SBP 組顏色最深，表明麝香保心丸不僅可以促進JAK2/STAT3 信號通路的表達，還可以促進JAK2、STAT3 的磷酸化；S+A 組染色較SBP 組淺，較AG 組深，表示麝香保心丸對JAK2、STAT3 的活化可被AG490 阻斷。同時，我們用MOD 值來定量計算蛋白表達量，也支持上述結(jié)論。

總之，由前面的實驗可以得出，麝香保心丸可保護新西蘭大白兔AMI 后損傷區(qū)域心肌組織解剖結(jié)構(gòu)的完整性，增加VEGF 及Ang- Ⅰ的表達，發(fā)揮促進血管新生的作用。這種作用與JAK2/STAT3 信號通路的激活及p-JAK2 和p-STAT3 表達的增加有關(guān)。這一研究為麝香保心丸促進AMI 后血管再生提供了基礎(chǔ)研究證據(jù)，為臨床治療AMI 提供了一條新的線索。