張海溢，王宸怡，馬雯慧，劉雨倩，宋天悅，陳鳳鴻

（徐州醫(yī)科大學麻醉學院，江蘇 徐州 221004）

現(xiàn)階段，肝癌已經成為人們較為常見的死亡原因之一。全球范圍內，肝癌的惡性程度在所有惡性腫瘤中居于前列，其致死率在所有惡性腫瘤中居第四位[1]。肝癌的危險因素包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、脂肪肝、酒精性肝硬化、吸煙、肥胖、糖尿病、鐵負荷過多及各種不良飲食習慣等[2]。肝癌患者的預后很差，只有5% ～15% 的早期肝癌患者能通過手術將病灶切除。肝癌的早期診斷比較困難，導致多數(shù)患者病情進展至晚期才得以確診，治療效果不如人意[3]。肝細胞癌是原發(fā)性肝癌的一種。臨床上治療肝細胞癌的方法多為根治性手術（如肝移植術、肝切除術）或姑息治療（如分子靶向治療、免疫治療），但原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)生轉移和復發(fā)的概率極高，并最終導致患者預后不良[4-5]。目前，運用醫(yī)學生物信息學可以分析基因層面肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制，并為其治療提供重要的理論參考依據(jù)。因此，研究各種基因參與肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制，進而找到合適的免疫靶向治療藥物，對肝細胞癌的治療及改善患者的預后具有重要的意義。白細胞介素4 誘導蛋白1（interleukin-4 induced 1 protein，IL4I1）是一種L 型- 苯丙氨酸氧化酶，位于人類基因19q13.3 ～19q13.4 染色體上，因由白細胞介素4分泌誘導產生而得名[6]。IL4I1 主要由B 細胞、T 細胞、成熟樹突狀細胞以及巨噬細胞產生[7-9]。IL4I1 的五種亞型由人類基因編碼，1 型在淋巴組織，2 型在中樞神經系統(tǒng)和人類精子中，3、4、5 型未知[6]。IL4I1 主要負責抑制T 細胞的增殖、幼稚B 細胞的分化以及促進巨噬細胞向2 型轉化[9]。相關文獻報道，IL4I1 通過調節(jié)免疫細胞的功能從而促進腫瘤細胞免疫逃逸，導致淋巴瘤[10]、宮頸癌[11]、慢性淋巴細胞白血病[8]、乳腺癌[12]的發(fā)生與發(fā)展。目前，尚沒有關于IL4I1 在肝細胞癌中作用的文獻報道。本研究通過從TCGA 公共數(shù)據(jù)庫中下載有關肝細胞癌的相關數(shù)據(jù)，利用醫(yī)學生物信息學分析IL4I1 在肝細胞癌中的作用機制，并探討其能否成為肝細胞癌新的診斷與免疫治療靶點。

1 數(shù)據(jù)分析與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù) 據(jù)庫中下載肝癌轉錄組（the fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，F(xiàn)PKM），提取與肝細胞癌有關的基因表達量，分析424 個樣本（N=50，T=374）中IL4I1 的表達在正常組織與肝細胞癌組織中有無明顯差異，繪制差異分析圖；接著篩選出其中的配對樣本，分析肝癌組織與癌旁組織中的IL4I1 基因表達是否有明顯差異。

1.2 IL4I1 與臨床病理特征的分析

使用Perl 軟件合并IL4I1 基因的表達數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，利用R 軟件（4.2.1 版本）分析IL4I1 在正常組織和肝細胞癌組織中的差異表達量以及與臨床病理特征的相關性。采用單因素和多因素Cox 回歸分析IL4I1在正常組織和肝細胞癌組織中的差異表達量以及臨床病理特征對肝癌患者生存預后的影響。

1.3 GSEA

將肝細胞癌患者分為高低表達兩組，使用GSEA 富集軟件對富集結果進行分析注釋，對每個分析進行1000 次基因集排列，將P＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率（discovery rates，F(xiàn)DR）＜0.25 定義為顯著富集。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用R 軟件（4.0.2 版本）進行統(tǒng)計分析，使用Wilcoxon 秩和檢驗分析IL4I1 差異表達以及臨床因素與患者預后的關系，計量資料采用中位數(shù)（用四分位數(shù)間距）表示。臨床病理特征分析、Cox 回歸分析和GSEA 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL4I1 在肝細胞癌中的差異表達情況

本研究共選取TCGA 數(shù)據(jù)庫中肝細胞癌樣本424個，其中包括50 個肝細胞癌組織和374 個癌旁組織，進行IL4I1 基因表達檢測。從統(tǒng)計結果（見圖1）可以看到：在肝細胞癌組織中IL4I1 的表達水平﹝ 0.69（0.31，1.75）﹞明顯比正常肝組織﹝0.22（0.15，0.51）﹞高，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 肝細胞癌組織與正常組織中IL4I1 的表達差異

2.2 單因素及多因素分析肝細胞癌組織中IL4I1表達量及臨床病理特征對患者預后的影響

單因素Cox 分析IL4I1 的基因表達與肝細胞癌患者預后相關性之間的關系（見表1），自變量為Parameter 對應的內容，因變量為風險比（hazard ratio，HR），關系為Parameter 每增加一個單位，相應地HR 會增加一定的數(shù)值。結果顯示：腫瘤分期﹝ HR=1.86，95% 可 信 區(qū) 間（confidence interval，CI）：1.46 ～2.39，P＜0.01 ﹞、T 分 期（HR=1.80，95%CI：1.43 ～2.27，P＜0.01）、M 分期（HR=3.85，95%CI：1.21 ～12.28，P＜0.05）與肝細胞癌患者的預后相關。多因素Cox 回歸分析顯示（見表2），IL4I1 表達水平的高低不能作為影響肝細胞癌患者預后的獨立危險因素（HR=1.00，95%CI：0.96 ～1.04，P＞0.05）。

表1 單因素分析肝細胞癌組織中IL4I1 表達量及臨床病理特征對患者預后的影響

表2 多因素分析肝細胞癌組織中IL4I1 表達量及臨床病理特征對患者預后的影響

2.3 IL4I1 表達量與肝細胞癌患者臨床病理特征相關性的分析

IL4I1 的 表 達 量 與TNM 分 期 中 的T 分 期﹝ T1、T2、T3、T4分別為0.66（0.30，1.52）、0.92（0.36，2.79）、0.64（0.26，1.92）、1.57（0.84，2.91），P＜0.05 ﹞（見圖2A）以及腫瘤組織學分級﹝ G1、G2、G3、G4分別為0.31（0.19，0.76）、0.75（0.32，1.78）、0.93（0.42，2.14）、0.86（0.46，2.07），P＜0.01 ﹞有 關（見 圖2B），與患者的年齡、性別、淋巴結浸潤程度及腫瘤遠處轉移無關（P＞0.05）（見圖2C、2D、2E、2F）。

圖2 不同臨床病理分類的肝細胞癌患者中IL4I1 基因表達的差異

2.4 GSEA

GSEA 提示，自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用、細胞因子信號通路、造血細胞譜系、抗原處理和提呈途徑、T 細胞受體信號通路等基因集在高表達組富集（ES 值 分 別 為0.813、0.772、0.744、0.706、0.702，P＜0.01）。見表3。

表3 GSEA

3 討論

在全球范圍內，原發(fā)性肝癌占所有癌癥的6%，占所有癌癥致死率的9%，它是全球第六種常見的癌癥，也是癌癥死亡的第四大原因[1]。原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌（約占75%）、膽管細胞癌（約占6%）等。慢性炎癥性肝損害是引起原發(fā)性肝癌最重要的危險因素，慢性炎癥過程可能源于病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等）、代謝性改變（酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎等）、長期接觸慢性致癌性毒素（黃曲霉毒素等）或寄生蟲感染（血吸蟲等）[13]。雖然接種疫苗和使用新型抗病毒藥物抑制了與乙型病毒性肝炎或與丙型病毒性肝炎相關肝癌的惡化過程，但患者的不良生活習慣（如長期飲酒、飲食習慣不良等）加劇了慢性炎癥的進展，從而提高了肝細胞癌的發(fā)生率[13]。由于肝癌在遺傳、代謝和炎癥方面的異質性，故治療方法極具挑戰(zhàn)性：化學藥物（如阿霉素）治療或激酶抑制劑（如一線藥物索拉非尼、二線藥物瑞格非尼等）治療僅能略微延長肝癌患者的總體生存時間；雖然手術切除腫瘤或肝臟移植都可以用于治療肝癌，但存在高復發(fā)率、低合格率等問題，導致肝癌的治療效果并不理想[14-16]。因此，對肝微環(huán)境的復雜細胞和免疫分子網絡的更好理解有利于發(fā)現(xiàn)新的治療措施。在腫瘤微環(huán)境中，免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞，通過免疫調節(jié)消滅腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，免疫療法已經成為一種很有前景的肝癌治療方法[17]。

在腫瘤微環(huán)境中，T 細胞可以識別腫瘤抗原，這些抗原由抗原提呈細胞（APC）遞呈給T 細胞受體。此外，T 細胞介導的免疫調節(jié)反應還受到一組被稱為免疫檢查點的細胞表面分子的微調。許多腫瘤細胞能夠逃避免疫系統(tǒng)，主要是通過過度表達抑制性配體與免疫檢查點結合，抑制T 細胞免疫功能的活化而實現(xiàn)的[17]。有研究表明，在肝細胞癌患者中發(fā)現(xiàn)了T 細胞數(shù)量的減少和免疫功能的抑制，從而促進了肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展[18]。越來越多的證據(jù)表明，用藥物阻斷免疫檢查點，減少腫瘤細胞表達的抑制性配體與免疫檢查點結合，是肝癌免疫治療中最有效的方法之一[19]。近年來，細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）、程序性細胞死亡蛋白-1（PD-1）和程序性細胞死亡配體1（PD-L1）等抑制性檢查點已被用來抑制實體瘤的抗腫瘤免疫反應[20-21]。T 細胞對激活狀態(tài)的高代謝需求，使得它們特別容易受到生化環(huán)境改變的影響。在腫瘤微環(huán)境中產生的免疫抑制酶通過分解必需或半必需氨基酸和產生有毒的分解代謝產物來改變營養(yǎng)物質的可利用性，從而抑制局部T 細胞的抗腫瘤免疫反應[9]。IL4I1 是一種苯丙氨酸氧化酶，有研究表明IL4I1通過促進色氨酸的降解產生吲哚代謝產物和犬尿酸來激活芳烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR），促進腫瘤細胞的運動，并抑制獲得性免疫，從而促進慢性淋巴細胞白血?。–LL）在小鼠體內的進展，證明了IL4I1 可以作為代謝免疫檢查點，阻斷IL4I1 有望成為腫瘤免疫治療的新靶點[22]。IL4I1 在肝細胞癌中的作用機制以及能否成為肝癌新的診斷與免疫治療靶點是本文所要研究的重點。

本研究通過醫(yī)學生物信息學方法分析TCGA 公共數(shù)據(jù)庫中肝癌的RNA 測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)肝細胞癌組織中的IL4I1 表達量顯著高于正常肝組織，與在其他癌癥中如B 細胞淋巴瘤[8]、腎癌[23]、卵巢癌[11]、皮膚黑色素瘤[24]中的研究結果一致。此外，本研究證實，在腫瘤分化程度越低和直徑越大患者的癌組織中，IL4I1 的表達水平越高。通過GSEA，進一步闡明IL4I1的促癌機制，結果顯示，自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用、細胞因子信號通路、造血細胞譜系、抗原處理和提呈途徑、T 細胞受體信號通路等基因集在高表達組富集。免疫細胞抑制和功能紊亂是腫瘤形成的重要原因。有研究表明，IL4I1 可以通過調節(jié)免疫細胞的分化，促進癌癥的進展[25]。Notch 激活與肝癌的發(fā)生密切相關。有研究表明，肝組織的干細胞（hepatic stem cells，HpSCs）是Alb-Cre 小鼠中最有可能致癌的候選細胞，Notch2 信號異?？烧T導具有HpSCs 特征的人類肝癌的形成[26]。JAK-STAT 激活與肝癌的發(fā)生密切相關，STAT 有多種受體。有研究表明，IL4I1可以通過激活STAT-3 和STAT-6 受體促進M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞的轉化，從而促進腫瘤逃逸[27]。結合上述分析，IL4I1 可能通過JAK-STAT 信號通路和Notch 信號通路促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展，再次證明了IL4I1 作為肝癌免疫治療潛在靶點的潛力。IL4I1 作為新型的免疫抑制酶，在免疫代謝調節(jié)和腫瘤免疫逃逸的過程中發(fā)揮了重要作用。在免疫代謝調節(jié)方面，IL4I1 參與了T 細胞[25]，B 細胞[24]的分化；在腫瘤免疫逃逸方面，IL4I1 主要通過直接限制細胞毒性T 細胞和Th1 細胞的生長，間接促進調節(jié)性T 細胞（Treg）的分化來抑制人類T 淋巴細胞的抗腫瘤作用[28]。當然，也有B 細胞及腫瘤特異性巨噬細胞的參與[24]。但IL4I1 介導的B 細胞在腫瘤發(fā)生過程中的作用尚不明確，有待進一步研究。已有研究表明，IL4I1作為免疫治療靶點在乳腺癌的治療中發(fā)揮了重要作用[12]?？傊琁L4I1 作為免疫抑制酶，在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮著越來越重要的作用，關于其詳細的生理作用，有待進一步研究。

本研究結果表明，基因IL4I1 在肝細胞癌組織中表達上調，IL4I1 可能通過JAK-STAT 信號通路和Notch 信號通路促進肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展，其具有作為肝細胞癌免疫治療靶點的潛力。