陳代儒，羅香蓉，李 勝，喻遠(yuǎn)尤，張 斌，劉天云

（南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院，湖南 邵陽 422000）

結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在我國所有惡性腫瘤中居于第3 位，致死率居于第5 位（在城市地區(qū)僅次于肺癌居于第2 位）[1]。2015 年全國新發(fā)和死亡的結(jié)直腸癌患者分別占全部惡性腫瘤患者的9.87% 和8.01%[2]。內(nèi)鏡手術(shù)切除+術(shù)后輔助放化療是結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的治療方式。有研究指出，結(jié)直腸癌較容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，14% ～25% 的結(jié)直腸癌患者在原發(fā)腫瘤確診時(shí)就發(fā)生了轉(zhuǎn)移，高達(dá)50% 的患者在發(fā)病過程中會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，最終會有40% ～50% 的患者死于結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-4]。局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素，Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的五年生存率僅為58.4%、14.4%[5]。TNM 分期是目前預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的最佳指標(biāo)。近年來臨床上發(fā)現(xiàn)了一些預(yù)測指標(biāo)能夠協(xié)助判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。TBX15 是T-box家族中的一員，在人體生長發(fā)育中發(fā)揮著多種生理作用。TBX15 基因的突變?nèi)笔Э赡軐?dǎo)致人類及小鼠外耳形態(tài)發(fā)育異常[6]，TBX15 在人類前脂肪細(xì)胞中過表達(dá)會降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累量，抑制線粒體的呼吸作用、負(fù)向調(diào)節(jié)氧化作用。其能夠驅(qū)動(dòng)脂肪細(xì)胞中糖酵解代謝的增加。有研究指出，TBX15 在前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平與糖酵解代謝標(biāo)志物水平呈正相關(guān)，與肥胖程度呈負(fù)相關(guān)，其可能成為肥胖治療的靶點(diǎn)[7-8]；同時(shí)其在骨骼肌的糖酵解中發(fā)揮著重要作用，其缺失可能導(dǎo)致代謝綜合征表型的發(fā)展，包括肥胖、肝脂肪變性和葡萄糖耐受不良[9]。研究表明，TBX15 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，TBX15 過表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)染TBX15 48 小時(shí)后，甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力會顯著增強(qiáng)，其抗凋亡性也會得到增強(qiáng)[10]。有研究指出，TBX15 在腎透明細(xì)胞癌組織中的過表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]。TBX15 有可能成為腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。TBX15 與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前臨床上暫無報(bào)道。本研究主要是通過采用免疫組化法檢測TBX15 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)來探究其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及數(shù)據(jù)收集

收 集2016 年7 月1 日 至2017 年7 月31 日 在 南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本103 例及癌旁正常組織50 例。通過南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院住院電子病理系統(tǒng)收集患者臨床病理資料的相關(guān)信息（包括年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、組織學(xué)類型、分化程度、浸潤深度、最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)脈管浸潤、臨床分期等）。納入標(biāo)準(zhǔn):（1）術(shù)后病理提示結(jié)直腸癌，且術(shù)前未接受放化療及免疫靶向治療；（2）患者知情同意參與研究；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他惡性腫瘤病史；（2）合并其他臟器的嚴(yán)重病變及功能不全。本研究使用的標(biāo)本均為手術(shù)治療后采集標(biāo)本，標(biāo)本采集前均經(jīng)患者同意（已簽署同意書）。術(shù)后隨訪主要通過電話回訪、門診復(fù)查、術(shù)后化療追蹤等形式展開，隨訪截止時(shí)間為2022 年8 月31 日，隨訪時(shí)間為60 個(gè)月?；颊呖偵鏁r(shí)間為手術(shù)治療日期至末次隨訪日期或死亡日期（死亡原因均為結(jié)直腸癌及其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）。

1.2 主要試劑及相關(guān)儀器

兔 抗 人TBX15 多 克 隆 抗 體 購 于 上 海ABMART 公 司，DAB 染 色 液、PBS 緩 沖 液 及 二 抗〔MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）IHC Kit〕購 于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。手動(dòng)切片機(jī)購自德國Leica 公司，PT Link 抗原修復(fù)儀購于丹麥Dako 公司，光學(xué)顯微鏡購自日本OLPMPUS 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果判讀

所有組織均用10% 的中性甲醛固定，行石蠟包埋。由同一切片機(jī)以4 μm 厚行連續(xù)切片，65℃干烤1 h 或60℃烤箱過夜，常規(guī)脫蠟至水。以ETDA（pH 9.0）行98℃ 20 min 抗原修復(fù)，PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，3% 雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS 緩沖液沖洗3 min×3 次，滴加一抗后置入4℃冰箱孵育過夜（一抗?jié)舛葹?:150）。PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，滴加二抗孵育20 min。PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，DAB 顯色10 min，流水沖洗1 min，蘇木素染液復(fù)染5 min。流水沖洗1 min，1%鹽酸水溶液分化3 s，飽和碳酸鋰返藍(lán)30 s。流水沖洗5 min，濕封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師在盲法條件下獨(dú)立評估，結(jié)果不同則重新閱片確定最終結(jié)果。采用免疫組化積分法（總得分= 陽性腫瘤細(xì)胞百分比的得分× 染色強(qiáng)度的得分）進(jìn)行染色結(jié)果的判定。陽性細(xì)胞百分比小于25% 計(jì)為1 分,25% ～50%計(jì)為2 分, 大于50% 計(jì)為3 分；無色計(jì)為0 分, 淡黃色計(jì)為1 分, 棕黃色計(jì)為2 分, 棕褐色計(jì)為3 分?？偟梅中∮? 分定為低表達(dá)，大于或等于6 分定為高表達(dá)。

1.4 TCGA 數(shù)據(jù)分析

從癌癥基因圖譜TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov) 中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的TBX15 基因在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入R 軟件（Version 3.64）進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理確診為結(jié)直腸癌。（2）研究對象接受手術(shù)治療。最后納入結(jié)直腸癌患者380 例，癌旁正常組織樣本50 例，其中包含32 對配對樣本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 27.0 及R 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。TBX15 的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌臨床病理的關(guān)系選用χ2 檢驗(yàn)。TCGA 數(shù)據(jù)計(jì)量資料均以±s表示，非配對樣本差異性采用Wilcoxon Rank Sum Tests，配對樣本差異檢驗(yàn)使用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-ranks 法比較兩組生存曲線的差異性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TBX15 蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá)情況。

HE 染色如圖1 所示，結(jié)直腸癌組織呈篩狀并浸潤性生長，細(xì)胞有異形，核漿比高，染色質(zhì)粗染，可見病理性核分裂象，而正常結(jié)腸組織呈腺管狀，排列均勻，細(xì)胞質(zhì)紅染。

圖1 正常結(jié)腸組織和結(jié)直腸癌組織的HE 染色結(jié)果(10×10)

免疫組化結(jié)果如圖2 所示，在50 例正常結(jié)直腸組織中高表達(dá)6 例，低表達(dá)44 例。在103 例結(jié)直腸癌組織中36 例患者TBX15 蛋白高表達(dá)，67 例低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.903，P＜0.05）。

圖2 正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織的TBX15 免疫組化結(jié)果（10×20）

2.2 TBX15 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理的關(guān)系

進(jìn)行TBX15 蛋白表達(dá)情況與103 例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)聯(lián)性分析的結(jié)果顯示，TBX15 蛋白的表達(dá)與神經(jīng)侵犯、脈管浸潤相關(guān)，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.482，P=0.002；χ2=7.690，P=0.006）；與年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、組織學(xué)類型、分化程度、浸潤深度、最大直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征均無明顯的相關(guān)性。見表1。根據(jù)TBX15 蛋白表達(dá)情況繪制生存曲線，如圖3 所示。由圖3 可見，TBX15 高表達(dá)患者的生存時(shí)間短于低表達(dá)患者（χ2=8.337，P=0.004）。這表明，TBX15 蛋白低表達(dá)患者有著更好的預(yù)后。

圖3 不同TBX15 表達(dá)情況結(jié)直腸癌患者的生存曲線

表1 TBX15 蛋白表達(dá)情況與103 例結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析

2.3 TBX15mRNA 在正常結(jié)直腸組織及結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況的分析

2.3.1 TBX15 mRNA 在癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá) 用R 軟件(version 3.6.4) 分析50 例結(jié)直腸正常樣本和380 例腫瘤樣本TBX15 mRNA 表達(dá)的差異性，使用非配對的Wilcoxon Rank Sum Tests 進(jìn)行差異顯著性分析, 結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織的TBX15 mRNA 表達(dá)（-2.42±1.60）較正常結(jié)直腸組織（-5.13±1.41）顯著上調(diào)（P＜0.0001）。見圖4。

圖4 TBX15 mRNA 在結(jié)直腸組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

2.3.2 TBX15 mRNA 在配對癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的分析 用R 軟件分析32 例配對樣本中TBX15 mRNA 的差異性表達(dá)，差異檢驗(yàn)使用配對樣本的t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，TBX15 mRNA 在配對癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（-2.40±1.42 VS -4.92±1.44）相比，具有顯著差異（P＜0.0001）。見圖5。這表明，癌組織中的TBX15 mRNA 表達(dá)較配對正常組織樣本明顯升高。

圖5 TBX15 mRNA 在結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的差異性

2.3.3 分析TBX15 mRNA 表達(dá)與總生存時(shí)間的相關(guān)性根據(jù)380 例結(jié)直腸癌患者TBX15 mRNA 的表達(dá)高低百分位數(shù)（50%）將患者分成高低兩組，進(jìn)一步使用R 軟件包survival 的survfit 函數(shù)分析兩組的預(yù)后差異，并繪制K-M 曲線。利用logrank test 方法評估兩組樣本之間預(yù)后差異的顯著性。結(jié)果顯示，兩組間存在顯著的預(yù)后差異(P=0.03)。TBX15 mRNA 低表達(dá)患者的生存時(shí)間較長，TBX15 mRNA 高表達(dá)患者的預(yù)后較差。見圖6。

圖6 TBX15 mRNA 的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

box 基因家族是一個(gè)古老的基因家族，在所有后生動(dòng)物體內(nèi)均能夠檢測到（在其整個(gè)生物發(fā)育過程中具有重要意義）。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)至少存在17 個(gè)T-box 基因，包括5 個(gè)亞科（T、Tbx1、Tbx2、Tbx6和Tbr1）。在人類發(fā)育過程中，T-box 基因在控制胚胎發(fā)育，參與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移及在癌癥轉(zhuǎn)移治療的抗性中都發(fā)揮著重要的作用。T-box 基因的上調(diào)或下調(diào)與多種不同類型癌癥相關(guān)，并有可能是促進(jìn)腫瘤形成的因素[12-13]。Tbx2 亞科中Tbx2、3 水平的升高與多種癌癥相關(guān)，如黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌等；其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞存活和耐藥性來促進(jìn)腫瘤發(fā)展[14-15]。T 亞科中Brachyury的過表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)及對化療和放療的抵抗有關(guān)[16]。Tbr 亞科中的Tbx21 能夠間接影響腫瘤的轉(zhuǎn)移，通過影響NK 細(xì)胞的正常發(fā)育來影響機(jī)體適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而使機(jī)體對轉(zhuǎn)移性癌癥的易感性大大增加[17]。TBX15 是T-box 基因家族中Tbx2 亞科中的一員。TBX15 的表達(dá)與甲狀腺癌和腎細(xì)胞癌相關(guān)。有研究指出，TBX15 在前列腺癌組織中的高表達(dá)與其不良預(yù)后顯著相關(guān)，此指標(biāo)已被推薦作為前列腺癌的標(biāo)志物[18]。Wu TI 等[19]在研究中指出，TBX15 作為多種表觀遺傳生物標(biāo)志物之一, 可用于診斷卵巢癌，其在聯(lián)合AMPD3、NRN1 時(shí)具有較高的靈敏度，有望成為宮頸癌篩查的指標(biāo)。GOZZI 等[20]在研究中發(fā)現(xiàn), 有82% 的卵巢癌病例存在TBX15 基因高甲基化、TBX15 蛋白表達(dá)水平較低的情況，而在所有甲基化水平低的卵巢腫瘤樣本的幾乎所有腫瘤細(xì)胞中都可觀察到TBX15 蛋白的表達(dá)。GOZZI 認(rèn)為，TBX15 可作為卵巢癌的生物標(biāo)志物，用于相關(guān)早期檢測、治療及進(jìn)展監(jiān)測等各方面。對于TBX15 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其與結(jié)直腸癌臨床病理及預(yù)后等的關(guān)系目前臨床上暫未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法檢測TBX15 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TBX15 蛋白在103 例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中高表達(dá)36 例，低表達(dá)67 例；在50 例癌旁正常結(jié)腸組織中高表達(dá)6 例，低表達(dá)44 例；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TBX15 表達(dá)與神經(jīng)侵犯和脈管浸潤有關(guān)。與其他臨床病理特征無明顯關(guān)聯(lián)。這表明，TBX15 蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展存在密切關(guān)系。結(jié)合K-M 曲線可知，TBX15 高表達(dá)患者的生存率更低，生存時(shí)間更短。這些結(jié)果表明，TBX15 可作為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。TCGA 數(shù)據(jù)庫為臨床基礎(chǔ)研究特別是腫瘤的研究提供了大量、充足的基因組及臨床數(shù)據(jù)，為研究腫瘤的臨床病理特征及腫瘤發(fā)生發(fā)展與相關(guān)基因的關(guān)系提供了大量的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在本研究中，我們通過對TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TBX15 mRNA 在同一個(gè)體結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較正常組織高，TBX15 低表達(dá)患者的總生存期更長。

綜上所述，TBX15 與多種癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，其可成為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，未來更可能成為治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。在此之前，我們需要更多的臨床及病理數(shù)據(jù)支持，需要進(jìn)行更多的臨床前實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。而TBX15 影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究探討。