徐文鑫,肖慧婷,曾淵君,翁開枝,王爾莉,張春斌

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院醫(yī)學技術系,福建 漳州 363000;2.福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院,福建 漳州 363000)

兒童ITP臨床診斷依據(jù)仍然是結合病史、體格檢查和排除血小板減少癥其他病因的臨床實驗室病理檢查[6]。臨床實驗室輔助診斷指標主要有血小板計數(shù)、骨髓巨核細胞檢查、血小板生存時間及血小板相關免疫球蛋白(PAIg)。但這些指標在臨床應用上都有不足。血小板計數(shù)特異性差;血小板生存時間檢測方法復雜;骨髓巨核細胞檢查需患兒承受骨穿痛苦;PAIg與ITP診斷的符合率不高。因此,對于兒童ITP,目前缺乏較好的臨床實驗室生物指標。本研究基于液相色譜-質譜串聯(lián)分析技術(LC-MS)進行非靶向代謝組學分析,揭示ITP患兒血漿樣本中的代謝物變化,希望能尋找到ITP患兒血漿中潛在可作為ITP診斷和鑒別診斷的臨床實驗室生物標記物,也為ITP發(fā)病機制提供進一步研究的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2020-01～2021-01從福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院兒科招募了未經任何治療的ITP患兒20例和健康兒童19例。ITP患兒平均年齡4.8歲,男10例,女10例;健康兒童平均年齡5.68歲,包括男7例和女12例。兩組在年齡和性別上的分布不存在顯著性差異(P>0.05)。對于ITP的診斷標準嚴格按照中國兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診斷與治療改編指南(2021版)[2]進行診斷,診斷標準如下:(1)至少2次血常規(guī)檢查示血小板計數(shù)減少(<100×109/L),外周血涂片血細胞形態(tài)無明顯異常;(2)脾臟一般不增大;(3)骨髓檢查示巨核細胞增多或正常伴成熟障礙;(4)排除其他繼發(fā)性血小板減少癥。

1.2 樣本采集與處理

使用真空采血管(無抗凝劑)采集清晨空腹患兒及健康兒童約5mL靜脈血,避免溶血。血液標本2500rpm離心10min,吸取上清液(血漿)至已標記的樣品管中,-80℃冰箱保存用于檢測分析前處理。

1.3 儀器與試劑

儀器主要有液相色譜儀(Thermo,UltiMate 3000)、質譜儀(Thermo,Q Exactive)、色譜柱(ACQUITY UPLC?HSS T3 1.8μm,2.1×150mm)、真空濃縮儀(eppendorf,5305)、冷凍離心機(湘儀,H1650-W)、混勻儀(Vortex Mixer,QL-866),試劑包括甲醇和乙腈(色譜純,Thermo)、甲酸(色譜純,TCL)、 2-氯苯丙氨酸(色譜純,Aladdin)、甲酸銨(色譜純,Sigma), 實驗用水為超純水(由Milli-Q 超純水機制備)。

1.4 樣本制備

從-80℃冰箱取出樣本,在4℃下融解。自每份樣本中吸取100μL放入2mL離心管,再取400μL甲醇加入各支離心管,60s振蕩混勻,離心5min(4℃,12000rpm);離心后將全部上清液移至2mL新離心管,真空濃縮干燥;用2-氯苯丙氨酸(4 ppm)80%甲醇溶液150μL復溶,上清液經0.22μm膜過濾,獲得待檢樣本;每份待檢樣本各取20 μL混合制備成QC樣本,余存待檢樣本用于LC-MS檢測。

1.5 色譜-質譜條件及分析

色譜條件:色譜分離在配備ACQUITY UPLC?HSS T3 (150×2.1mm, 1.8μm, Waters)柱的Thermo Ultimate 3000系統(tǒng)中完成,保持40℃柱溫。流動相采用正離子模式0.1%甲酸水(C)- 0.1%甲酸乙腈(D);負離子模式 5 mM 甲酸銨水(A)-乙腈(B)。自動進樣器溫度設為8℃,流速設為0.25mL/min,2μL進樣梯度洗脫,洗脫程序:2% B/D,0～1min;2%～50%B/D,1～9 min;50%～98% B/D,9～12min;98% B/D,12～13.5min;98%～2% B/D,13.5～14min;正模式-2% D,14～20min(負模式-2% B,14～17min)。

質譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)正負離子電離模式,正離子噴霧電壓3.50 kV,負離子噴霧電壓2.50 kV;鞘氣30arb,輔助氣10arb;毛細管溫度設為325℃,分辨率設為70 000,m/z 81～1 000范圍內全掃描;采用HCD模式以碰撞電壓30eV進行二級裂解,并通過動態(tài)排除去除無必要的 MS/MS信息。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Proteowizard軟件將檢測得到原始數(shù)據(jù)轉換成mzXML格式,通過R(v3.3.2)XCMS程序分析獲得質核比(mass to charge ratio, m/z)、保留時間(retention time,rt)、峰面積(intensity)等信息的數(shù)據(jù)矩陣;并進行峰面積的批次歸一化及標準化處理。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對各組數(shù)據(jù)進行歸類,去除重復性差的樣本和異常樣本,并得到VIP值。采用秩和檢驗得到P值,根據(jù)P值和VIP值篩選出具有統(tǒng)計學意義的差異代謝物。通過人類代謝組數(shù)據(jù)(human metabolome data base HMDB)等數(shù)據(jù)庫進行代謝物結構鑒定。經層次聚類(hierarchical clustering)分析形成熱圖,觀察兩組之間的差異代謝產物分類情況。經單變量受試者工作特征(ROC)曲線進一步評價并篩選潛在的生物標記物。采用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異性代謝物進行通路富集分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計分析和繪圖均采用R軟件進行。

2 結果

2.1 樣本檢測數(shù)據(jù)分析

使用LC-MS/MS在正負離子模式下檢測分析血漿樣本,通過Proteowizard軟件將獲取的原始數(shù)據(jù)轉換成mzXML格式,利用R(v3.3.2)的XCMS程序經峰識別、峰過濾、峰對齊及峰面積批次歸一化,獲得正離子模式下5334 個前體分子、9567 個前體分子,導出數(shù)據(jù)至excel進行后續(xù)分析。

2.2 主成分分析

通過對數(shù)據(jù)進行自適(UV) 換算處理,對標準化數(shù)據(jù)進行PCA,分別得到正負離子模式下PCA得分圖(圖1 A-B),圖中每個點代表一個樣本。其中QC組密集分布,說明方法穩(wěn)定性良好數(shù)據(jù)質量良好,得到的數(shù)據(jù)可靠。同時ITP患兒組和健康對照組明顯區(qū)分開,同組樣本聚類,表明ITP患兒和健康兒童樣本之間存在代謝差異。

圖1-A 正離子模式下的得分圖

圖1-B 負離子模式下的得分圖

2.3 差異代謝物篩選

應用秩和檢驗分析ITP患兒組和健康對照組的大量數(shù)據(jù),得到p值。通過OPLS-DA得到正負離子模式下具有很高模型解釋率的OPLS-DA區(qū)分模型(圖2 A-B),并得到VIP值。為了在兩組間找到差異顯著的代謝物,本研究設定P<0.05且VIP>1,在ITP患兒組和健康對照組之間,正離子模式下共找到1199個差異代謝物, 在負離子模式下共找到1453個差異代謝物。

圖2-A 正離子模式OPLS-DA的得分圖

圖2-B 負離子模式OPLS-DA的得分圖

2.4 重要差異代謝物鑒定及聚類分析

將篩選出的差異性代謝物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB等數(shù)據(jù)庫中進行匹配檢索。設定數(shù)據(jù)庫中的數(shù)值與檢測得到的mz差異小于0.01Da,共鑒定出了90個差異代謝物的結構。對90個差異代謝物進行層次聚類分析,見圖3,從結果可以看到,90個差異代謝物在ITP患兒組和健康對照組之間存在具有明顯差異。計算90個差異代謝物在ITP患兒組和健康對照組兩組之間的Fold change值,設定Fold change>6.00或<0.166,從中遴選出20種能很好區(qū)分ITP患兒組和健康對照組的重要差異代謝物,見表1。

圖3 差異代謝物聚類分析樹狀圖 (紅色)ITP患兒組 (藍色)健康對照組

表1 ITP患兒與健康兒童血樣中的重要差異代謝物鑒定

2.5 關鍵差異代謝物的發(fā)現(xiàn)

應用ROC曲線分析方法,得到20種重要差異代謝物的ROC曲線結果,見圖4。設定ROC曲線下面積值(AUC)>0.9,共選出13種潛在的關鍵差異代謝物,其中鑒定出5個內源性代謝物:間甲酚(m-Cresol)、腐胺(Putrescine)、5-羥色胺(Serotonin)、2-氧代精氨酸(2-Oxoarginine)、精氨基琥珀酸(Argininosuccinic acid)。繪制ITP患兒組和健康兒童組樣本中5種內源性潛在關鍵差異代謝物的均值柱形圖,見圖5,發(fā)現(xiàn)5種代謝物在ITP患兒組和健康兒童組差異非常顯著(P<0.001)。其中腐胺、2-氧代精氨酸、 精氨基琥珀酸在ITP患兒組是升高的,而5-羥色胺、間甲酚在ITP患兒組是降低的。結合上述統(tǒng)計學分析,最終選定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羥色胺、間甲酚這5種代謝物為ITP患兒的潛在生物標記物。

圖4 20個重要差異代謝物的ROC曲線圖

圖5 5種內源性潛在關鍵差異代謝物在ITP患兒和健康兒童血樣中的均值柱形圖注:藍色柱代表ITP患兒組,紅色柱代表健康兒童組 (***表示P<0.001)。

經KEGG數(shù)據(jù)庫對ITP患兒差異性代謝物的代謝通路進行分析。結果表明,ITP患兒差異代謝物富集于10條代謝途徑:精氨酸和蛋氨酸代謝、亞油酸代謝、ABC轉運蛋白、癌癥中的中樞碳代謝、精氨酸生物合作、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、蛋白質消化吸收、泛酸和輔酶A的生物合成等。

3 討論

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以血小板破壞增加和血小板生成障礙導致的單純血小板減少為特征的獲得性自身免疫性疾病。目前針對ITP尚無明確的診斷方法,仍采用排除性診斷,在排除了血小板減少的其它病因后進行診斷[7]。尋找一種可靠的診斷方法將有助于ITP的診斷、鑒別診斷和藥物治療。代謝組學是通過對生物樣本中代謝組分的定性和定量分析,研究代謝過程,確定具有代謝特征的關鍵生物標志物和揭示代謝機制的有力工具。如Wei Zhong等[8]應用LC-MS技術尋找急性冠脈綜合征的血漿標志物,發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺溶酶16:0與LPC(20:4)聯(lián)合檢測的AUC值達到0.905,有助于ACS的有效診斷;Fan Yang等[9]通過對多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis MS)的代謝物變化與炎癥因子的相關性分析,發(fā)現(xiàn)MS代謝組的改變可能通過調節(jié)外周的免疫炎癥反應參與了MS的發(fā)病和病程;Liu等[10]用LC-MS技術方法進行梅毒代謝組學研究,發(fā)現(xiàn)三甲胺N -氧化物、L -精氨酸、溶菌素、甜菜堿和乙酰肉堿5種代謝物具有顯著差異,并通過這些代謝產物的變化提示梅毒螺旋體影響宿主細胞的正常代謝活動。本研究基于LC-MS技術對ITP患兒和健康兒童血液樣本進行非靶向代謝組學分析,對檢測的原始數(shù)據(jù)進行濾噪、峰對齊、歸一化、標準化等預處理后,采用主成分分析、正交-偏最小二乘判別分析、層次聚類分析等,發(fā)現(xiàn)ITP患兒與健康對照明顯分離。并經HMDB, Metlin 等數(shù)據(jù)庫進行代謝物結構鑒定,獲取90種差異代謝物。然后根據(jù)Fold change值及ROC曲線結果選取了13種潛在關鍵差異代謝物,最終確定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羥色胺、間甲酚等5種內源性代謝物作為ITP的潛在生物標記物。5種生物標記物組成的生物標記物組對區(qū)分ITP患兒和健康兒童具有較高的準確性(ACU>0.9)。

5-羥色胺存在于所有的生物體中,在哺乳類動物中是一種抑制性神經遞質,由L-色氨酸合成,主要參與色氨酸代謝。在調控毛細血管壁功能方面具有一定作用,也具有強收縮血管和收縮平滑肌的功能[11]。外周血的5-羥色胺大部分貯存在血小板中與,參與血小板止血或血栓形成的功能作用。因此,5-羥色胺含量與血小板的功能密切相關。5-羥色胺還具有免疫調節(jié)功能,與ITP 的發(fā)病機制可能存在共同通路。祁爍等[12]針對 ITP 模型小鼠血管活性物質調節(jié)作用的研究,顯示ITP 模型組的5-羥色胺水平顯著減低,與本研究結果一致。腐胺是一種最簡單的多胺,由機體內氨基酸脫羧反應產生,大劑量即有毒性,被歐洲尿毒癥毒素工作組確定為一種尿毒癥毒素。腐胺已被證明在一些生態(tài)失調有關的疾病中起著重要作用。腐胺也存在于外周血血小板中,提示血小板溶解破壞有可能導致腐胺大量釋放到外周血中,引起血中腐胺升高。精氨基琥珀酸是一種堿性氨基酸,在機體代謝途徑中可作為精氨酸的前體。2-氧代精氨酸是精氨酸分解代謝的胍基化合物代謝物,在機體內大量蓄積可引起中樞神經系統(tǒng)損害。本研究中,精氨基琥珀酸、2-氧代精氨酸和精氨酸相對于健康對照都有顯著性升高,提示ITP患兒體內精氨酸代謝增強,2-氧代精氨酸的生成增多可能對中樞神經系統(tǒng)存在損害。

臨床上的自身免疫性疾病大多數(shù)病因不明,可能與遺傳、免疫、激素和環(huán)境因素有關。ITP的發(fā)生也可能與藥物和化學物質接觸有關[13]。目前,研究最廣泛的是由奎寧與血小板膜糖蛋白的特異性殘基相互作用引起的藥物性免疫性血小板減少癥(DIT)[14]。1例病例報告[15]顯示,1例患者被診斷為異煙肼誘導的免疫性血小板減少癥,異煙肼停藥后血小板計數(shù)恢復正常。本研究中,也篩選出一些具有差異性的外源性代謝物,如魯比前列酮、異惡苯、L-組氨醇等。

本研究存在一些局限性。首先,研究對象數(shù)量相對較少。只有通過研究更多種族人群的更大規(guī)模試驗,才能更好檢驗分析內源性或外源性代謝物與ITP之間的關聯(lián)。其次,研究缺乏更多的臨床相關指標,如治療后相關患者數(shù)據(jù)信息。Zhang等[1]基于GC-MS對98例ITP患者和30例健康對照進行檢測分析,識別出6個差異代謝物和5個富集通路,預測出慢性ITP患者對糖皮質激素耐藥,揭示了ITP患者的代謝紊亂。LC-MS方法可能可以鑒定出更多的差異代謝物,從而更有可能鑒定出具有診斷和預后價值的代謝物,但需要更大的樣本量來獲得更準確的結果,而本研究僅納入20例ITP患者,數(shù)量偏少。

綜上所述,本研究基于LC-MS的代謝組學方法,發(fā)現(xiàn)ITP患兒與健康兒童存在較多的差異性代謝物,并篩選出5種內源性潛在關鍵差異代謝物,可能可以作為鑒別ITP患兒和健康兒童的臨床實驗室生物標記物。這些結果也有助于深入理解ITP的病理生理過程,并為ITP提供新的診斷和治療策略。