符 微，黃圣楷，孫 龍

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，海南 ?？?570102）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的重要公共衛(wèi)生問題［1］，呈世界性流行，全球約有2.57 億慢性HBV 感染者，全球每年約有88.7萬人死于HBV 感染相關(guān)疾病，是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），肝硬化（liver cirrhosis，LC）和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的主要病因［2］。肝癌是全世界第六大癌癥，在癌癥致死率中位居第三［3］。盡管目前對HBV 所致的肝炎及肝硬化有很好的療效，進(jìn)行抗乙肝病毒治療能夠阻止疾病繼續(xù)發(fā)展，甚至可以有很好的轉(zhuǎn)歸，但是肝癌在世界上發(fā)病率和死亡率仍然很高，因此肝癌的預(yù)后非常差，對肝癌的預(yù)防、預(yù)測及診斷是一個公共的衛(wèi)生問題及挑戰(zhàn)。

乙型肝炎病毒HBV 是環(huán)狀脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），因其逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）不具有校對或編輯活性，在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中會出現(xiàn)許多基因突變，本薈萃分析主要針對研究HBV 基因基本核心啟動子（basal core promoter，BCP）-A1762T/G1764A 和前核心區(qū)（precore，PC）-G1896A 的突變［4-6］。這兩種基因突變隨著病程進(jìn)展發(fā)生，阻止乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）的產(chǎn)生［7］，使機(jī)體自身免疫防御功能受限，另而可促進(jìn)乙肝病毒的脫氧核糖核酸（hepatitis B virus - deoxyribonucleic acid ，HBV-DNA）大量復(fù)制，導(dǎo)致肝功能惡性循環(huán)的損害，加重肝病病情，使肝癌發(fā)生風(fēng)險增加。另外HBV 一共有八種基因型，其中B 基因型和C 基因型在亞洲普遍存在，許多研究表明，HBV 感染的肝病進(jìn)展與基因型有密切關(guān)系，而且不同的基因型對臨床癥狀表現(xiàn)及預(yù)后均不同［8，9］。

在以往許多報道中顯示，慢性HBV 感染的臨床過程可能會被幾種特定的病毒突變所改變，這種突變在HBV 患者仍存在爭議。因此進(jìn)行了系統(tǒng)的薈萃分析，研究在HBV BCP/PC 產(chǎn)生基因突變時對肝臟疾病進(jìn)程的影響，對肝癌的發(fā)生發(fā)展風(fēng)險評估，對肝癌的預(yù)測及防治得到有用的信息。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 研究類型 病例對照研究。

1.1.2 研究對象 納入HBV 感染的的患者，并根據(jù)以下分組：HCC 和CHBC、CHB、LC，對于CHBC、CHB、LC 及HCC 的診斷根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》；以及HBV B 基因型及C 基因型分組。

1.1.3 結(jié)局指標(biāo) 關(guān)注各HBV 感染分組中BCP-A1762T/G1764A 以 及PC-G1896A 的 突 變情況。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并有肝外相關(guān)疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕類疾病、腎功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病、腫瘤類疾病、糖尿病等；（2）排除合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎、代謝性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病、藥物性肝損害、遺傳代謝性肝病以及轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤者等相關(guān)肝臟疾病。

1.2 文獻(xiàn)檢索策略

計算機(jī)檢索PubMed、SCI、CNKI、VIP 和 Wan-Fang Data 數(shù)據(jù)，收集突變在HBV 感染相關(guān)疾病進(jìn)程中作用的文獻(xiàn)，檢索時限均為建庫至2021 年7 月1 日。此外，追溯納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)，以補(bǔ)充獲取相關(guān)文獻(xiàn)。檢索采取主題詞和自由詞相結(jié)合的方式，中文檢索詞乙肝病毒、突變、基礎(chǔ)核心啟動子、前核心區(qū)、肝細(xì)胞癌等；英文檢索詞包括：hepatitis B virus、HBV、mutation、mutations、mutant、hepatocellular carcinoma、liver cancer、hepatoma 等。

1.3 文獻(xiàn)篩選與資料提取

兩人首先獨立選擇研究，最后整理歸納時出現(xiàn)意見分歧進(jìn)行討論。如果兩人在相互討論后還沒得到同意結(jié)果時，由第三人判定并給予決策。如果遇到同一作者相關(guān)文章中的研究時間及研究群體重疊率超過30%，綜合考量后選用研究時間最新或者納入群體最大文章。兩位研究員對納入的40 篇文章進(jìn)行閱讀全文，收集其作者、出版日期、研究國家、發(fā)生肝癌數(shù)、納入病例總數(shù)、HBV 基因型、BCP-A1762T/G1764A 以 及PC-G1896A 突 變 情 況。對所納入文章質(zhì)量的評估對照Wei 等［10］方法，使用改良紐卡斯?fàn)?渥太華量表（NOS）用于評價研究質(zhì)量。改進(jìn)后的NOS 是基于9 個項目的10 分評分系統(tǒng)。分?jǐn)?shù)越高，學(xué)習(xí)質(zhì)量越高。

1.4 納入研究的偏倚風(fēng)險評價

采用漏斗圖評價發(fā)表偏倚。

1.5 統(tǒng)計分析

使用優(yōu)勢比（OR）和相應(yīng)的95%置信區(qū)間（CI）進(jìn)行數(shù)據(jù)評估。納入研究結(jié)果間的異質(zhì)性檢驗水準(zhǔn)為α=0.1，同時結(jié)合I2定量判斷異質(zhì)性大小。若各研究結(jié)果間無統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析；若各研究結(jié)果間存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性，則進(jìn)一步分析異質(zhì)性來源，在排除明顯臨床異質(zhì)性的影響后，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。Review Manager 軟件版本5.4 用于數(shù)據(jù)分析。所有統(tǒng)計測試都是雙尾，P＜0.05 的差異被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

確定了2 170 篇潛在的相關(guān)文章，去除每個數(shù)據(jù)庫中重復(fù)文章836 篇，對余1 334 篇研究進(jìn)行初步標(biāo)題及摘要篩選，排除1 247 篇（例如基礎(chǔ)研究、合并丙型肝炎感染、病例報道、會議文章等情況）。其余87 篇文章進(jìn)行全文閱讀，確定有肝癌及病例對照組的40 篇文章最終納入本文薈萃分析（表1），總共病例數(shù)為12 423 例，肝癌數(shù)為3 710 例（圖1）。

表1 納入研究的基本特征Tab 1 Basic characteristics of included studies

圖1 Meta 分析中文章篩選的流程圖Fig 1 Flowchart for article screening in the meta-analysis

2.2 結(jié)果

2.2.1 BCP-A1762T/G1764A 與 PC-G1896A 在CHBC、CHB、LC、HCC 的 突 變 分 析 在 比 較BCP-A1762T/G1764A 在HBV 感染疾病進(jìn)程中突變情況時［11-48］，先在HCC 與non-HCC 間比較，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性是明顯的，所以在此使用了隨機(jī)效應(yīng)模型。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示突變在HCC 與non-HCC 對比中，由此可見突變增加了肝癌發(fā)生的風(fēng)險。在HCC 與CHBC 比較時（OR=3.90，95%CI=2.13～7.17，P＜0.000 1），與CHB 比 較 時（OR=2.77，95%CI=1.78～4.32，P＜0.000 01），與LC 比 較 時（OR=1.64，95%CI=0.95-2.84，P=0.005），結(jié) 合 以 上 對HBV 感染發(fā)生的CHBC、CHB、LC 與HCC 進(jìn)行亞組分析，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示三組均P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明BCP-A1762T/G1764A 基因突變與HBV 感染的疾病進(jìn)程相關(guān)，逐漸累及促進(jìn)肝癌的發(fā)生。見圖2。

圖2 HCC 與non-HCC、CHBC、CHB、LC 的BCP-A1762T/G1764A 基因突變分析Fig 2 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A gene in HCC and non-HCC，CHBC，CHB，and LC

在比較PC-G1896A 突變在HBV 感染疾病進(jìn)程關(guān) 系 時［11，13，15，17，19，21-23，25-29，31，32，34-38，43，45-49］，發(fā) 現(xiàn)HCC與non-HCC 有異質(zhì)性，在統(tǒng)計學(xué)上使用隨機(jī)效應(yīng)模型。PC-G1896A 突變在HCC 與non-HCC 對比中，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PC-G1896A 突變對肝癌的產(chǎn)生有影響意義。同時進(jìn)行亞組分析，在比較HCC 與LC 分組的時候，所得出P=0.4，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，分別在HCC 組中為122/240，LC 組中為80/193，不排除為樣本量的影響，需要在更大樣本量中再次進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于CHBC、CHB 亞組中，與HCC 比較時PC-G1896A 突變，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3。

圖3 HCC 與non-HCC、CHBC、CHB、LC 的PC-G1896A 基因突變分析Fig 3 Mutation analysis of PC-G1896A gene in HCC and non-HCC，CHBC，CHB，and LC

2.2.2 BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 在B 基因型、C 基因型的突變分析 通過分析BCP-A1762T/G1764A 突變在B 基因型與C 基因型的 關(guān) 系［12，16，19，24，27，35，39，40，50］，根 據(jù) 所 得 出 的 數(shù) 據(jù) 表，異質(zhì)性是顯著的。在兩組基因型中，C 基因型在突變更為顯著。但是在本薈萃分析中關(guān)于在HCC 分組中研究BCP-A1762T/G1764A 突變情況中差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與Ito 以及Liu 等［27，45］研究結(jié)果不一致，有待于進(jìn)一步收集更多數(shù)據(jù)再觀察。見圖4。

圖4 B 基因型、C 基因型的BCP-A1762T/G1764A 基因突變分析Fig 4 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A in genotype B and C

研究B 基因型、C 基因型在PC-G1896A 突變中［27，35，40，45，50］，所 得 的 結(jié) 果 顯 示 差 異 沒 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意義。見圖5。

圖5 B 基因型、C 基因型的PC-G1896A 基因突變分析Fig 5 Mutation analysis of PC-G1896A in genotype B and C

最后分析在C 基因型中，HCC 與non-HCC 中BCP-A1762T/G1764A/PC突變的意義時［11-14，24，31，39，49］，發(fā)現(xiàn)兩者均有明顯的異質(zhì)性，由此可得出在C 基因型中，BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 基因突變對增加肝癌的發(fā)生有著明顯的影響。見圖6。

圖6 C 基因型中BCP-A1762T/G1764A 與PC-G1896A 基因突變分析Fig 6 Mutation analysis of BCP-A1762T/G1764A and PC-G1896A genes in genotype C

2.3 敏感性分析

分別依次對最高突變數(shù)量以及最低突變數(shù)量的文章進(jìn)行剔除，所得結(jié)果與最終結(jié)果差異不大，所以不給予剔除。

2.4 偏倚風(fēng)險評價結(jié)果

粗略對漏斗圖進(jìn)行觀察（圖7、8）。

圖7 BCP-A1762T/G1764A 基因突變的漏斗圖Fig 7 Funnel plot of the BCP-A1762T/G1764A gene mutation

3 討論

對于肝癌的發(fā)生，有證據(jù)表明與特殊性BCP/PC 基因變異和HBV 表達(dá)的基因型相關(guān)。因此這些在HBV 感染中可能是一些目前未發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)標(biāo)志，對此研究可對HCC 的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防提供有效的信息。

圖8 PC-G1896A 基因突變的漏斗圖Fig 8 Funnel plot of the PC-G1896A gene mutation

乙型肝炎病毒HBV 是一個環(huán)狀部分雙鏈DNA病毒，也是一種包膜病毒，其生物學(xué)功能是通過核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）中間物使用其自身編碼的RT 進(jìn)行復(fù)制［51-53］，但是由于其HBV RT 不具有校對或編輯活性，伴隨著每天大量的病毒粒子生成，復(fù)制過程中不可避免地會出現(xiàn)錯誤，導(dǎo)致出現(xiàn)大量突變基因，加速肝臟疾病進(jìn)程，觸發(fā)肝癌發(fā)生。在正常運作的DNA 校對機(jī)制下發(fā)生的突變，如果對生物體不利，則會被糾正或自然選擇出來，從而維持基因組并產(chǎn)生保守序列。BCP 是調(diào)控PC和HBV 前基因組RNA 轉(zhuǎn)錄，主要的突變位點的是A1762T、G1764A。BCP 突變時可能通過去除受體結(jié)合基因序列而增加基因組前RNA 的轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒DNA 的復(fù)制能力，同時創(chuàng)造干細(xì)胞抗因子結(jié)合受體的結(jié)合位點，導(dǎo)致前核心信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid ，mRNA）發(fā)生抑制和前基因組核糖核酸（pregenomic ribonucleic acid ，pgRNA）轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，因此病毒復(fù)制的總體增強(qiáng)［54，55］。一般來說，核心啟動子BCP 區(qū)域的突變通常會導(dǎo)致可能導(dǎo)致惡性腫瘤的基因下調(diào)或上調(diào)，可能是觸發(fā)HCC 發(fā)生的機(jī)制。在該meta 分析中，主要研究BCP-A1762T/G1764A 在HBV 感染疾病進(jìn)程中的關(guān)系，結(jié)果表明突變中HCC 與non-HCC、CHBC、CBC、LC 的OR 值為4.05、3.90、2.77、1.64，與大多數(shù)研究結(jié)果一致，表明突變可促進(jìn)HBV 感染疾病進(jìn)展，對HCC 發(fā)生有重大作用。PC 是編碼HBeAg 的起始區(qū)域，主要的突變位點指G1896A。PC 突變時產(chǎn)生終止密碼子，阻止PC 蛋白的翻譯，消除HBeAg 的產(chǎn)生，因此可產(chǎn)生HBV 病毒逃逸，促使這些患者持續(xù)合成高水平的HBV-DNA［56，57］。血清HBeAg，既是HBV 感染的診斷指標(biāo)之一，也參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。因此，PC 基因的突變不僅可影響甚至誤導(dǎo)HBV 感染的診斷，也為HBV 持續(xù)性感染提供有利條件，導(dǎo)致肝病的持續(xù)進(jìn)展。比較HCC 與non-HCC 在PC-G1896A 基因突變的關(guān)系時，其異質(zhì)性是顯著的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，突變對肝癌的產(chǎn)生有影響意義，也同樣證實了突變對肝病發(fā)展有促進(jìn)作用。這兩種基因突變隨著病程進(jìn)展發(fā)生，使肝癌發(fā)生風(fēng)險增加。

又因為不同的HBV 基因型與肝臟疾病進(jìn)展、抗病毒療效、患者預(yù)后關(guān)系密切，與A 型或D 型HBV 比 較，B 型、C 型 基 因 的HBeAg 血 清 學(xué) 轉(zhuǎn) 換 率低、轉(zhuǎn)換時間晚，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的清除率低，肝組織病變嚴(yán)重，肝硬化或HCC 的發(fā)生率高，對干擾素治療的應(yīng)答率低，基因突變率更高［58-60］。我國HBV 以B 型、C型基因為主，C 型基因更為常見，療效不佳，基因突變可能是主要原因之一［61，62］。在研究HBV 的B、C基因型與BCP/PC 突變之間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)PC-G1896A 突變與基因型的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與大多研究表明的這個突變可促進(jìn)HBV 疾病進(jìn)程，繼發(fā)HCC 的產(chǎn)生結(jié)果不一致，這可能是本研究所選取的在突變上B、C 基因型樣本量小，需要在更大樣本上進(jìn)行再次評估。

本研究的局限性：（1）本研究只收集B、C 基因型，應(yīng)完善其他HBV 感染基因型與基因突變的關(guān)系，為HCC 的發(fā)病機(jī)制提供更有效的解讀。（2）納入研究質(zhì)量參差不齊，部分研究存在選擇性偏移、實施偏移及測量性偏移。受樣本量及研究設(shè)計局限性影響，本薈萃分析結(jié)果尚需大樣本、多中心、高質(zhì)量的研究予以證實。

此薈萃分析結(jié)果顯示，在HBV 感染的肝臟疾病中，BCP-A1762T/G1764A 以及PC-G1896A 突變對疾病發(fā)展過程具有明顯生物學(xué)效應(yīng)，這些突變使發(fā)生肝癌的風(fēng)險獨立預(yù)測因素之一，并且HBV 基因型可以增加患有HCC 的風(fēng)險。

所有作者聲明無任何利益沖突關(guān)系。