郭家敏，郭宵飛，孫詩藝，李靜靜，鄧曉曦，張 平

（中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102）

壞死性凋亡（necroptosis）又被稱為程序性壞死，當(dāng)發(fā)生細胞凋亡的條件缺少時，受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）及其下游的受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混合譜系激酶域樣蛋白（MLKL）將會激活壞死性凋亡的通路［1，2］。它不依賴于半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）活性，當(dāng)caspase-8 依賴的凋亡通路被阻斷時，腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、TOLL 樣受體（TLR）等的刺激作用可激活RIPK1，募集RIPK3 并發(fā)生磷酸化，活化的RIPK3調(diào)控MLKL 誘導(dǎo)其寡聚化，易位至質(zhì)膜內(nèi)葉破壞細胞膜的完整性，因此細胞表達RIPK3 以及caspase-8分子受到抑制是壞死性凋亡發(fā)生的必備條件［3-6］。

壞死性凋亡存在于腫瘤、自身免疫病等多種疾病的發(fā)生過程中，而研究壞死性凋亡干預(yù)制劑也逐漸成為新的研究熱點［7，8］。已有研究表明逍遙散、大黃蟄蟲丸等中藥復(fù)方通過調(diào)節(jié)壞死性凋亡治療疾?。?-11］，然而中藥在壞死性凋亡領(lǐng)域的研究仍較少，暫未系統(tǒng)地總結(jié)出中藥用藥規(guī)律，因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選壞死性凋亡相關(guān)靶點對應(yīng)的小分子化合物，通過化合物的橋接作用篩選相關(guān)中藥并挖掘其性味歸經(jīng)信息，總結(jié)中藥使用規(guī)律，為壞死性凋亡干預(yù)制劑的研發(fā)提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 獲取壞死性凋亡相關(guān)靶點

借 助GeneCards （http：//www.genecards.org）［12］、DrugBank （http：//go.drugbank.com/）［13］、TTD（https：//bidd.nus.edu.sg）［14］、DisGeNET （www.disgenet.org）［15］、OMIM （https：//omim.org）［16］數(shù) 據(jù)庫，以“necroptosis”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得壞死性凋亡相關(guān)靶點，利用UniProt （https：//www.uniprot.org）［17］數(shù)據(jù)庫查尋靶點全稱。

1.2 篩選候選化合物并構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選與壞死性凋亡靶點相關(guān)的化合物。候選化合物應(yīng)滿足ADME 標 準 及Lipinski 規(guī) 則［18］：口 服 生 物 利 用 度≥30%，類藥性［19］≥0.18，半衰期≥4，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)［20］≤10，拓撲極性表面積［21］＜140，分子量≤500 Da。將收集到的靶點、候選化合物導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)。

1.3 獲取中藥及性味歸經(jīng)信息并構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索與候選化合物相關(guān)的中草藥，合并去重后規(guī)范中藥名稱并匹配性味歸經(jīng)信 息，將《中 華 人 民 共 和 國 藥 典》［22］、《中 藥 學(xué)》［23］、《中華本草》［24］中無法查找到相關(guān)信息的中藥予以刪除。將化合物-中藥信息與“1.2”項得到的靶點-化合物信息一同導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建靶點-化合物-中藥相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape3.9.1軟件中Analyze Network 模塊功能分析該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲學(xué)屬性值［25，26］。為了更加直觀地展示壞死性凋亡及其對應(yīng)靶點、化合物、中藥之間的關(guān)系，本研究選取度值≥6 的中藥及其對應(yīng)靶點、化合物進一步構(gòu)建核心靶點-化合物-中藥相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，評估中藥及化合物干預(yù)壞死性凋亡的功效強度［27］。

1.4 主要靶點-化合物分子對接

分子對接能夠判斷靶點與候選化合物作用關(guān)系的可信度，因此選取核心網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的靶點（度值≥8）與度值排名前8 的化合物（度值≥10）進行分子對接，判斷核心網(wǎng)絡(luò)中靶點與化合物作用關(guān)系強度［28］。靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件利用PDB 數(shù)據(jù)庫進行下載并使用PyMOL 軟件去除晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，通過AutoDockTools-1.5.7 軟件（ADT）加全氫并設(shè)置為受體導(dǎo)出pdbqt 格式［29］。候選化合物的MOL2 結(jié)構(gòu)從TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行下載，通過ADT 軟件加全氫設(shè)置為配體導(dǎo)出pdbqt 格式。運用ADT 插件Autodock4 進行分子對接并使用PyMOL 軟件對其結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 壞死性凋亡相關(guān)靶點

分別從GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得636、19個壞死性凋亡相關(guān)靶點，其他數(shù)據(jù)庫未檢索出相關(guān)靶點。GeneCards 數(shù)據(jù)庫可根據(jù)布爾模型（Boolean）計算相關(guān)性值得出各靶點的Score 評分，Score評分越高表示該靶點與壞死性凋亡的相關(guān)程度越高。因此篩選出GeneCards 數(shù)據(jù)庫中Score 值前10%的靶點作為壞死性凋亡相關(guān)靶點，與OMIM 數(shù)據(jù)庫所得19 個靶點合并后去除重復(fù)值，一共得到79個靶點，其中有21 個靶點能夠匹配到小分子化合物，所匹配的小分子化合物能夠滿足ADME 及Lipinski 規(guī)則的靶點12 個，因此這12 個靶點可看作是與壞死性凋亡相關(guān)的潛在靶點，見表1。

表1 壞死性凋亡潛在靶點基本信息Tab 1 Basic information on potential targets of necroptosis

2.2 候選化合物結(jié)果及靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以各靶點的蛋白名稱作為檢索詞，檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫共得到與潛在靶點相關(guān)的化合物517個，其中滿足ADME 標準及Lipinski 規(guī)則的候選化合物191 個，根據(jù)檢索結(jié)果構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由204 個節(jié)點和351 條邊組成，圖中藍色六邊形表示候選化合物，粉色菱形表示潛在靶點，節(jié)點度值越高所示圖形越大，表示該靶點在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。網(wǎng)絡(luò)中度值前5 的靶點為GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53，分 別 對 應(yīng)162、122、16、15、12 個化合物；度值排名靠前的化合物主要有槲皮素（quercetin）、漢黃芩素（wogonin）、雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide）、甘草查爾酮（licochalcone a）、玫瑰樹堿（ellipticine）分別與7、5、4、4、3 個靶點相關(guān)。

圖1 壞死性凋亡靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Necroptosis apoptosis target-compound network

2.3 篩選中藥并構(gòu)建靶點-化合物-中藥作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出389 味與候選化合物相關(guān)的中藥，其中可匹配到性味歸經(jīng)者366 味，通過化合物的聯(lián)接作用構(gòu)建靶點-化合物-中藥作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由569 個節(jié)點以及1 397 條邊組成。其中度值排名前10 味的中藥分別是甘草、丹參、苦參、半枝蓮、桑葉、葛花、雞血藤、降香、菊花、山豆根，分別對應(yīng)48、10、10、10、10、9、9、9、9、9 個化合物，見圖2。利用化合物的聯(lián)接性統(tǒng)計中藥相關(guān)聯(lián)的靶點數(shù)目，連翹可作用11 個靶點，甘草、銀杏葉、敗醬草、半邊蓮等均可作用10 個靶點，見圖3。由于化合物度值的中位數(shù)是3，因此將網(wǎng)絡(luò)中度值＞6 的化合物視為核心化合物，其中度值居前5 位的化合物分別為β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素，見表2。為展示調(diào)節(jié)壞死性凋亡的核心中藥及相關(guān)靶點、化合物，從上述網(wǎng)絡(luò)中篩選出度值≥6的中藥及其對應(yīng)的化合物、靶點構(gòu)建核心靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含177 個節(jié)點、546 條邊，其中黃色箭頭表示靶點、粉色六邊形表示化合物、綠色菱形表示中藥，度值越高節(jié)點形狀越大，見圖4。對366 味中藥性味歸經(jīng)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示調(diào)節(jié)壞死性凋亡的中藥多為寒性、溫性，味多苦、辛，多歸肝經(jīng)、肺經(jīng)，見圖5。

表2 中藥干預(yù)壞死性凋亡潛在核心化合物（度值＞6）Tab 2 Potential core compounds of traditional Chinese medicine intervention in necroptosis（degree value＞6）

圖3 中藥靶點數(shù)（前20 位）Fig 3 Number of traditional Chinese medicine target points （Top 20）

圖4 核心靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Core target-compound-traditional Chinese medicine network

圖5 中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計圖Fig 5 Statistical chart of the meridian distribution of traditional Chinese medicine

2.4 分子對接結(jié)果

將核心靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)中高度值（≥8）靶點GSK3B（PDB ID：5K5N）、MAPK14（PDB ID：1WBS）、BCL2（PDBID：2W3L）、TNF（PDB ID：2AZ5）、TP53（PDB ID：5O1H）與高度值（≥10）化合物進行分子對接。根據(jù)結(jié)合能與氫鍵數(shù)綜合評估分子對接的結(jié)果，其中結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol 的靶點與化合物對接活性良好，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 則表示對接活性強烈，形成氫鍵數(shù)越多的靶點與化合物對接質(zhì)量越好［29］。結(jié)果顯示，對接結(jié)合能最高的為TP53-kaempferol（-9.89 kcal/mol），結(jié)合能最低的為BCL2-quercetin（-4.75 kcal/mol），40組對接結(jié)果平均結(jié)合能為-6.80 kal/mol；對接氫鍵數(shù)最多為8 個，最少者沒有對接氫鍵，平均氫鍵個數(shù)為4，提示所選核心靶點與化合物結(jié)合活性較強，對接質(zhì)量較好，見圖6、7。綜合考慮分子對接結(jié)合能和氫鍵個數(shù)，選擇對接情況較好的4 個組合進行三維結(jié)構(gòu)展示，見圖8。

圖7 核心靶點-化合物分子對接氫鍵數(shù)熱圖Fig 7 Thermal diagram of hydrogen bond numbers of core target-compound molecular docking

圖8 調(diào)節(jié)壞死性凋亡核心靶點與化合物分子對接結(jié)構(gòu)圖Fig 8 Structural diagram of the docking between the core target of regulating necroptosis and compound molecules

3 討論

作為細胞程序性死亡的一種方式，壞死性凋亡在多種疾病的病理過程發(fā)揮著雙重作用，一方面壞死性凋亡發(fā)生時釋放的胞內(nèi)物質(zhì)能夠參與固有免疫反應(yīng)，另一方面其釋放的炎性物質(zhì)又會加劇炎癥反應(yīng)［30］。因此單一的壞死性凋亡干預(yù)制劑無法解決其復(fù)雜的發(fā)病機理，而具有多種成分、靶點的中藥逐漸變成新藥研發(fā)的重要來源。

研究結(jié)果顯示，高度值靶點有GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53 等。其中GSK3B 基因編碼的蛋白GSK3β 失活可使RIPK1 抑制劑受到抑制，從而誘導(dǎo)壞死性凋亡［31］。BCL2 在細胞凋亡的調(diào)控中具有重要作用，BCL2 家族蛋白協(xié)調(diào)線粒體外膜（MOM）的透化，MOM 透化（MOMP）導(dǎo)致促凋亡分子的激活，而BCL2 蛋白家族調(diào)節(jié)壞死性凋亡的具體作用機制目前尚不清楚［32］。TNF 是一種炎癥相關(guān)細胞因子，MAPK14 及其底物MAPKAPK2（MK2）在TNF 誘導(dǎo)的炎癥細胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，RIP3 是TNF 引起的壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，RIP3 表達缺失可能會降低細胞對壞死性凋亡刺激的敏感性，從而促進細胞存活和腫瘤發(fā)生［33］。TP53 基因?qū)僖环N腫瘤抑制基因，它在活性氧（ROS）誘導(dǎo)的壞死性凋亡中起作用，它在線粒體基質(zhì)中積累并與親環(huán)蛋白-D（CypD）形成復(fù)合物，這是ROS 產(chǎn)生并導(dǎo)致線粒體PTP 開放進而誘導(dǎo)線粒體腫脹和壞死性凋亡所必需的［34，35］。

根據(jù)篩選結(jié)果，化合物度值較高的有槲皮素、漢黃芩素、雷公藤甲素、甘草查爾酮A 等，這些化合物與靶點連接較多，被認為是干預(yù)壞死性凋亡的主要活性成分。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，它具有多種生物學(xué)特性，能夠通過抑制大鼠脊髓損傷后M1 巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞極化來減輕少突膠質(zhì)細胞的壞死性凋亡［36］。壞死性凋亡是急性腎損傷發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵事件，而漢黃芩素被證明可以通過靶向RIPK1 介導(dǎo)的壞死性凋亡來抑制急性腎損傷中的炎癥反應(yīng)和腎小管細胞死亡［37］。RIPK1-RIPK3-MLKL 信號通路已被廣泛認為是壞死性凋亡的主要介導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇可通過該通路誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生壞死性凋亡從而發(fā)揮抗癌作用［38］。TLR 在壞死性凋亡的發(fā)生過程中有著重要作用，研究顯示甘草查爾酮 A 以劑量依賴 性 方 式 抑 制TLR4 表 達，MAPK 和NF-κB 活 化，而TLR4 的過表達能夠部分消除甘草查爾酮 A 對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥和TLR4 信號激活的抑制作用［39］。

中藥方面，甘草、連翹、銀杏葉、杜仲等可干預(yù)壞死性凋亡的靶點較多，是調(diào)節(jié)壞死性凋亡的重要中藥。研究發(fā)現(xiàn)甘草主要成分異甘草素、連翹主要成分連翹苷均可通過抑制NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用，而NF-κB 信號通路是壞死性凋亡誘發(fā)炎癥反應(yīng)的常見機制，因此推測甘草、連翹均可抑制壞死性凋亡所致的炎癥反應(yīng)［40-42］。動物實驗顯示，銀杏葉提取物761（EGb761）可以通過減弱RIP1 介導(dǎo)的線粒體功能障礙抑制細胞壞死性凋亡，因此推測該途徑可能為銀杏葉調(diào)節(jié)壞死性凋亡的機制；杜仲主要成分杜仲苷則可通過抑制壞死蛋白MLKL 和RIP1 進而抑制壞死性凋亡發(fā)揮對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的神經(jīng)保護作用［43，44］。分子對接結(jié)果顯示，多數(shù)化合物與靶點之間對接活性良好，其中化合物luteolin 與isorhamnetin 表現(xiàn)突出。luteolin、isorhamnetin均可通過抑制NF-κB 通路控制炎癥，這與壞死性凋亡誘導(dǎo)炎癥通路相類似，推測luteolin、isorhamnetin可通過該途徑調(diào)節(jié)壞死性凋亡［45，46］。

中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計結(jié)果表明，調(diào)節(jié)壞死性凋亡潛在中藥多苦寒、辛溫，苦味“能瀉，能燥，能堅”，多有燥濕瀉熱的功效；《內(nèi)經(jīng)》云“治熱以寒”“熱者寒之”，寒性藥多可清熱瀉火，因此苦寒藥用于治療濕熱互結(jié)證。辛味藥多有調(diào)達氣機、通行血脈的功效；溫性藥可溫里散寒，辛溫藥臨床多用于治療表證。潛在中藥多歸肝、肺二經(jīng)，《素問》曰：“肝生于左，肺藏于右”“肝者，將軍之官，謀慮出焉”“肺者，相傅之官，治節(jié)出焉”，肝臟以升發(fā)為宜，肺臟以肅降為順，二者一升一降共同調(diào)理全身氣機?，F(xiàn)代研究也顯示壞死性凋亡的終末效應(yīng)物MLKL 的缺失可減少小鼠肝損傷以及肝臟纖維化，這表明壞死性凋亡常造成不同程度的肝損傷，故調(diào)節(jié)壞死性凋亡的潛在中藥多歸屬肝經(jīng)［47］。綜上推測，壞死性凋亡中醫(yī)病機多為肝郁化火，木火刑金；病性多屬熱證、表證、實證；病位多在肝，與肺密切相關(guān)；治療上以清熱瀉火、解表散邪為治則。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘初步探討了中藥調(diào)節(jié)壞死性凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)及用藥規(guī)律，為從中醫(yī)層面解讀壞死性凋亡等細胞程序性死亡的機制提供思路，為中西醫(yī)結(jié)合治療壞死性凋亡相關(guān)疾病提供借鑒。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于數(shù)據(jù)庫的定量分析，因此本研究僅從理論層面闡述了壞死性凋亡相關(guān)靶點、化合物、中藥之間的關(guān)系，存在一定的局限性，結(jié)果有待更深入的實驗性研究予以證實。

作者貢獻度說明：

郭家敏、郭宵飛、李靜靜、鄧曉曦：論文選題與研究設(shè)計；孫詩藝：數(shù)據(jù)的核驗與統(tǒng)計；郭家敏：數(shù)據(jù)分析，論文起草；郭宵飛、孫詩藝：論文修訂；張平：對論文的指導(dǎo)與審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。