趙金兵，王莫離，王鐵軍，石建州，姚倫廣

（1.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473061；2.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000）

趙金兵，王莫離，王鐵軍，等.非洲豬瘟病毒pS273R 蛋白的生物信息學(xué)分析［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：32-38.

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬和野豬引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。該病于1921 年首次報道在肯尼亞暴發(fā)，百年來一直在世界各地流行蔓延。2018 年在我國遼寧省沈陽市首次出現(xiàn)ASF 疫情，之后迅速席卷全國。ASFV 屬于核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA 病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）超家族［1］，是ASF 病毒科（Asfarviridae）ASF 病毒屬（Asfivirus）唯一成員。ASFV 病毒粒子的直徑260～300 nm，是線性雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）囊膜病毒，基因組大小為170～194 kbp［2］，含有150～167 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）［3］，成熟病毒粒子的基因組依次包裹著內(nèi)核芯殼 （core shell）、內(nèi)膜（inner envelope）、衣殼（caspid）和外囊膜（inner envelope）4 層蛋白殼［4］。

ASFV 結(jié)構(gòu)特征復(fù)雜、蛋白功能多樣，導(dǎo)致ASFV 逃逸適應(yīng)性免疫應(yīng)答和干擾宿主天然免疫系統(tǒng)，易于抑制和逃避宿主的免疫，便于增殖，使這種巨型病毒難以控制。ASFV 基因組編碼的蛋白參與病毒生命周期的調(diào)控以及免疫逃逸［5-6］。病毒蛋白是解析抗原結(jié)構(gòu)、認(rèn)識蛋白功能、尋找藥物靶點、制備抗體、建立檢測方法、研制疫苗的基礎(chǔ)和前提，因此，分析ASFV 抗原蛋白是ASFV 免疫學(xué)和疫苗學(xué)研究的關(guān)鍵。ASFV 內(nèi)核芯殼蛋白主要包括CP2475L 基因編碼的多聚蛋白前體pp220 和CP530R 基因編碼的多聚蛋白前體pp62，二者在蛋白酶pS273R 切割加工下，水解成多個成熟的病毒結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)物，分別為p150、p37、p34、p14、p5、p35、p15、p8［7］，均是ASFV 內(nèi)核芯殼的重要組分，影響蛋白核心包裝與成熟［6］。pS273R 具有重要的生物學(xué)功能，介導(dǎo)ASFV 的復(fù)制和宿主的炎癥反應(yīng)等過程，通過非典型切割Gasdermin-D （GSDMD）的途徑抑制細(xì)胞焦亡［8］。pS273R 蛋白主要的結(jié)構(gòu)域有核心結(jié)構(gòu)域與新穎的能夠維持酶活性的N-端手臂結(jié)構(gòu)域；C 端結(jié)構(gòu)域包含由催化三聯(lián)體Cys-His-Asn 組成的核心結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)相似度上，與半胱氨酸類蛋白酶高度相似［9］。pS273R 蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶家族，具有SUMO-1 樣蛋白酶保守的催化基序特征，合成于病毒感染早期，主要定位在胞質(zhì) “病毒工廠”。pS273R 蛋白是探究ASFV 內(nèi)核芯殼蛋白結(jié)構(gòu)組成、分布位置、作用功能的前提和基礎(chǔ)，在研制ASFV 抑制劑等抗病毒藥物方面具有潛在的應(yīng)用價值。

ASF 對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成重大威脅，是全球養(yǎng)豬業(yè)的災(zāi)難性疾病，防控形勢十分嚴(yán)峻。目前尚無商業(yè)化疫苗和治療藥物［10］，撲殺成為控制ASF 疫情的首選方法。2020 年我國出現(xiàn)了低致死率的ASF 基因Ⅱ型自然變異流行株，水平傳播能力強，潛伏期長，具有一定的隱蔽性，變異株和經(jīng)典株共存、共流行，使早期診斷難度增加，監(jiān)測和精準(zhǔn)清除更加困難，給ASF 的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)［11］。探索解析ASFV 感染、致病、免疫逃逸等機制是亟須闡明的科學(xué)問題，了解與ASFV 基因組復(fù)制、侵染、免疫逃逸等環(huán)節(jié)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，篩選抑制劑的有效靶標(biāo)，研發(fā)疫苗和藥物，對ASF 的防治具有重要意義。

廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域的生物信息學(xué)（bioinformatics）是一門新興于20 世紀(jì)末的交叉學(xué)科。生物信息學(xué)主要通過生命科學(xué)和計算機科學(xué)綜合處理并解析采集獲得的生物學(xué)信息大數(shù)據(jù)，是一種高效的預(yù)測分析手段。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和各類數(shù)據(jù)庫的不斷完善，生物信息學(xué)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要性越加凸顯，在促進生命科學(xué)發(fā)展方面是一種必不可少的研究工具。近年來，生物信息學(xué)在免疫學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也受到廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。利用生物信息學(xué)的分析結(jié)果能夠減少前期試驗的隨機性和盲目性，有助于有針對性地開展驗證性試驗，減少不必要的研究試驗，節(jié)省時間，加速試驗進程，提高試驗效率。

該研究采用生物信息學(xué)方法分析不同ASFV毒株的pS273R 基因序列同源性以及遺傳進化關(guān)系，預(yù)測pS273R 蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、糖基化修飾、亞細(xì)胞定位、三級結(jié)構(gòu)等，以期為pS273R 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入解析以及ASFV 抑制劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 pS273R 基因序列同源性及遺傳進化分析

從非洲豬瘟病毒數(shù)據(jù)庫 （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）中下載43 個不同毒株的pS273R 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 軟件分析其核苷酸序列同源性以及遺傳進化關(guān)系。

1.2 pS273R 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

利用ExPASy-ProtParam 在線軟件（http://web.expasy.org/protparam/）分析pS273R 基因編碼蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)。

1.3 pS273R 蛋白二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、糖基化修飾分析及亞細(xì)胞定位

利 用SOPMA （http://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）對pS273R 蛋白二級結(jié)構(gòu)進行在線分析。使用Net-Phos 3.1 軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分析磷酸化位點。應(yīng)用NetNGlyc 1.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc -1.0）在 線 軟 件 分 析pS273R 蛋白糖基化修飾。通過在線分析軟件PSORTII（https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）預(yù)測分析pS273R 蛋白亞細(xì)胞定位。

1.4 pS273R 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測分析pS273R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同毒株的pS273R 基因序列同源性及遺傳進化關(guān)系分析

分離自中國的5 個ASFV 毒株（China_HLJ_20 18、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pS2 73R 基因序列同源性為100%，與分離自其他國家的38 個不同ASFV 毒株的pS273R 基因序列同源性在93.60%～100%（見圖1）。

圖1 43 株ASFV 的pS273R 基因序列同源性比較

通過構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)，43 株ASFV 的pS273R基因序列總體分為2 類，即歐洲分支和非洲分支，中國的ASFV 毒株與歐洲分支的親緣關(guān)系較近，提示中國毒株可能來源于歐洲（見圖2）。

圖2 43 株ASFV 的pS273R 基因序列遺傳進化分析

2.2 pS273R 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

pS273R 蛋白由4 415 個原子組成，分子式為C1410H2196N386O407S16，相對分子質(zhì)量為31.58 kDa。由273 個氨基酸組成，賴氨酸（lysine）、蘇氨酸（threonine）、亮氨酸（leucine）所占比例較高，分別為8.4%、7.7%、7.3%。其中，帶正電荷的殘基（arginine+lysine）總數(shù)為38 個，帶負(fù)電荷的殘基（aspartic acid+glutamate）總數(shù)為30 個。理論等電點（pI）為8.96。在哺乳動物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期是30 h，脂肪系數(shù)為72.45，不穩(wěn)定系數(shù)為44.89，總平均親水性 （grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.447。

疏水性和親水性是蛋白質(zhì)的重要特性，這2項指標(biāo)對于預(yù)測分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有參考性。利用ExPASy（https://www.expasy.org/）網(wǎng)站中的ProScale 在線工具分析pS273R 蛋白，獲得pS273R 蛋白親疏水性序列分析圖譜。以0 為界，正值和負(fù)值分別指氨基酸的疏水性與親水性。正值越大疏水性越強；反之，負(fù)數(shù)絕對值越大，則其親水性越強。預(yù)測值在-0.5～0.5 時，推測氨基酸可能屬于兩性氨基酸。ASFV 的pS273R 蛋白分析結(jié)果表明，第172 位的異亮氨酸（isoleucine）疏水性最強，分值為1.311；位于第228 位的絲氨酸（serine）是親水性最強的氨基酸，分值為-2.411（見圖3）。分析結(jié)果顯示，pS273R 蛋白存在數(shù)量不少的親水域，該結(jié)果和理化性質(zhì)中總平均親水性（GRAVY）的結(jié)果是一致的，綜合分析數(shù)據(jù)表明pS273R 蛋白是一種親水性蛋白。

圖3 pS273R 蛋白的疏水性分析結(jié)果

2.3 pS273R 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析與亞細(xì)胞定位

多肽鏈的空間局部構(gòu)成與形狀是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的肽鏈依靠氫鍵按照一維的方向進行排列分布，從而形成了具有周期結(jié)構(gòu)特征的構(gòu)象［12］。二級結(jié)構(gòu)的主要類型包括4 種：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲。通過ExPASy 網(wǎng)站的SOPMA 在線工具對pS273R 蛋白的氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。結(jié)果表明，pS273R 蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋（Hh）、延伸鏈（Ee）、β-轉(zhuǎn)角（Tt）、無規(guī)卷曲（Cc）4 種形式為主。pS273R 蛋白的α-螺旋（Hh）有118 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的43.22%；延伸鏈（Ee）有43 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的15.75%；β-轉(zhuǎn)角（Tt）有11 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的4.03%；無規(guī)卷曲（Cc）有101 個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的37.00%，氨基酸的整條鏈貫穿了這4 種不同的結(jié)構(gòu)（見圖4）。

圖4 ASFV 的pS273R 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

通過NetPhos 3.1 軟件分析發(fā)現(xiàn) （見圖5）：pS273R 蛋白存在28 個磷酸化位點，分別為12 個絲氨酸 （serine）（紅色）、12 個蘇氨酸（threonine）（綠色）和4 個酪氨酸（tyrosine）（藍色），包含PKA、PKC、unsp、cdk5、GSK3、SRC、CKI、CKII、DNAPK、INSR、cdc2 總共11 類蛋白質(zhì)激酶結(jié)合位點。

圖5 ASFV 的pS273R 蛋白磷酸化位點分析

利用NetNGlyc 1.0 Server 在線軟件分析pS273R 蛋白糖基化修飾，在第83 位和第246 位天冬酰胺殘基上各存在1 個潛在的N-糖基化修飾（見圖6）。

圖6 ASFV 的pS273R 蛋白糖基化位點分析

應(yīng)用PSORTII 軟件預(yù)測pS273R 蛋白的亞細(xì)胞定位，在ASFV 感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞內(nèi)可能存在的分布位置有以下幾種可能：首先存在可能性最高的是位于細(xì)胞的胞質(zhì)中（P=47.8%），其次是線粒體，可能性為26.1%，定位于細(xì)胞核的概率為13.0%，此外，存在于細(xì)胞骨架、空泡、過氧化物酶中的可能性均為4.3%。

2.4 pS273R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL 對pS273R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，pS273R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)是由二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊以及無規(guī)卷曲等經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、折疊與卷曲等生物過程而形成（見圖7），與6lj9.1.A（crystal structure of Se-Met ASFV pS273R protease）的同源性為97.07%。

圖7 ASFV 的pS273R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

利用生物信息學(xué)工具分析目的蛋白質(zhì)，預(yù)測蛋白質(zhì)的同源性系統(tǒng)進化、理化特性、物理結(jié)構(gòu)等重要信息，對探析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、功能與機制具有參考價值，能夠為將要開展的研究工作提供新的思路和線索［13-14］。該研究分析表明，pS273R基因相對保守，國內(nèi)流行的5 個ASFV 毒株的pS273R 基因序列相同，與國外其他38 個毒株的同源性在93.60%～100%；預(yù)測pS273R 蛋白有2個潛在的N-糖基化修飾位點，糖基化對真核生物蛋白質(zhì)的抗原表位和熱穩(wěn)定性具有一定程度的影響［15］。病毒蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與抗原決定簇的關(guān)系密切，線性B 細(xì)胞表位含有的親水性氨基酸數(shù)量越多，肽段區(qū)域的柔韌性能越高，更有利于抗原與抗體嵌合［16］。作為蛋白質(zhì)中心的“支架”β-折疊的化學(xué)鍵，其鍵能越高，越不利于實現(xiàn)嵌合抗體；而表面的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)易于識別并結(jié)合抗體，該位置成為抗原表位的潛力更大［17］。pS273R 蛋白是ASFV 復(fù)制、核成熟以及感染宿主不可缺少的酶，抑制pS273R 的酶活性，可影響水解多聚蛋白前體的加工過程，導(dǎo)致病毒滴度下降，抑制病毒增殖；而抑制多聚蛋白前體的表達，組裝形成的20面體空衣殼喪失感染性［18-19］。新的研究證實了pS273R 蛋白可切割GSDMD，從而阻礙了細(xì)胞焦亡的啟動，便于病毒的復(fù)制，明確了pS273R 蛋白在炎癥反應(yīng)和病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用，揭示了一種新的ASFV 抑制細(xì)胞焦亡的作用機制［8］。pS273R 蛋白存在大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，是具有較多潛在B 細(xì)胞抗原表位的親水性蛋白，可為抗ASFV 藥物的研發(fā)提供候選分子靶標(biāo)。

4 結(jié)論

對ASFV 的pS273R 基因和pS273R 蛋白進行了生物信息學(xué)分析，揭示了不同國家ASFV 流行毒株pS273R 基因的同源性及進化關(guān)系，預(yù)測了pS273R 蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、糖基化修飾、亞細(xì)胞定位、三級結(jié)構(gòu)等關(guān)鍵信息，研究結(jié)果可為進一步探究ASFV 的感染機制以及研制抗ASFV 藥物提供參考。