譚英劍 陳志明 莫 然 黃 昕 楊 勇

中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院遺傳病中心、江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室,江蘇南京,210042

Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome, WS)是一種具有較強遺傳和臨床異質(zhì)性的綜合征疾病,以皮膚、毛發(fā)等色素異常,虹膜異色和先天性感音神經(jīng)性耳聾為主要臨床特征。1951年,荷蘭眼科醫(yī)師Waardenburg首次報道該病并正式命名為Waardenburg綜合征[1]。目前已發(fā)現(xiàn)WS的主要致病基因有MITF、PAX3、SOX10、EDN3、EDNRB和SNAI2[2]。WS可分為4型,I型WS的特征性表現(xiàn)為內(nèi)眥外移,II型WS與WS1型類似但不伴有內(nèi)眥外移,3型WS為在WS1型基礎(chǔ)上合并肌肉、骨骼系統(tǒng)畸形,4型WS常伴有先天性巨結(jié)腸等腸道病變。WS患者主要因先天性耳聾就診于耳鼻喉科,皮膚科醫(yī)師對此病的認識較少。本研究對一例WS患兒進行了外顯子組測序分析,為明確WS診斷提供了分子遺傳學證據(jù),有利于患者及早進行聽力檢查、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者,男,10歲。因面部皮疹7年于2022年8月就診于我院?；純?歲起出現(xiàn)彌漫分布的雀斑樣褐色色素沉著,間雜色素脫失斑點,邊界清楚,無隆起,隨年齡增長逐漸增多,上肢和臀部也散在色素沉著斑。年幼時頭發(fā)色素減退,顏色偏黃,后逐漸呈棕黃色。出生時雙眼虹膜色素減退,呈天藍色,后期顏色無明顯變化,眼距正常(圖1)。出生時聽力障礙,2歲行人工耳蝸植入。無生長發(fā)育障礙?；純焊改负?個姐姐均正常,父母否認近親結(jié)婚。

圖1 Waardenburg綜合征先證者主要臨床表現(xiàn) 1a:面部褐色色素沉著伴色素脫失斑;1b:眼虹膜呈天藍色;1c:上肢散在色素沉著斑 圖2 Waardenburg綜合征患者家系及Sanger測序圖 2a:家系圖;2b:先證者MITF基因7號外顯子存在一雜合突變c.649_651delAGA,其父母未檢出突變

體格檢查:一般情況良好,身高146 cm,體重32 kg,體質(zhì)指數(shù)15.0,智力和體格發(fā)育無明顯異常。聽力檢查:佩戴人工耳蝸,聽力正常。皮膚科檢查:面部彌漫分布黃豆大褐色色素沉著斑,間雜色素脫失斑點,上肢和臀部散在分布類似褐色斑點。頭發(fā)色素減退,呈棕黃色。眼科檢查:雙眼虹膜色素減退,呈天藍色,眼距和視力正常。

1.2 方法

1.2.1 遺傳性皮膚病目標基因外顯子組測序 本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[(2019)臨審第(005)號],選取先證者及其父母作為基因突變檢測對象,三人均簽署知情同意書后,抽取外周血各2 mL置于真空EDTA抗凝管內(nèi),提取基因組DNA,送至北京邁基諾基因科技股份有限公司行遺傳性皮膚病目標基因外顯子組測序,目標區(qū)域長度為2.46 Mb,含已知致病基因726個。數(shù)據(jù)下機后,從該患者DNA中總共檢測出5188個SNP變異位點,對其進行分析篩選:第一步篩選位于外顯子區(qū)或剪切區(qū)的位點,得到1545個位點;第二步選擇最高人群頻率≤0.05的位點,得到127個位點;第三步過濾掉質(zhì)控數(shù)據(jù)較差的突變,剩余101個位點;第四步篩除Clinvar數(shù)據(jù)庫中已知的良性位點,剩下可能致病的或不確定的位點,同時選擇Disease Information中存在對應疾病的位點,剩余38個位點;第五步篩選突變頻率≥0.2,測序深度≥20的位點,得到32個位點;最后選擇其中符合臨床表型的致病基因,進行下一步分析。

1.2.2 Sanger測序 根據(jù)檢測得到的可疑致病突變位點,對先證者及其父母MITF基因第7號外顯子及其側(cè)翼序列進行PCR擴增。正向引物“CCGTTGTCATGACCTGGAG”,反向引物“GTTTCAGAAAGCCACCTCCTC”。PCR 反應條件:98℃預變性2 min;98℃變性10 s,64℃退火30 s,72℃延伸10 s,10個循環(huán);98℃變性10 s,55℃退火30 s,72℃延伸10 s,25個循環(huán);72℃延伸5 min。對擴增結(jié)果進行Sanger測序,并用Snapgene軟件將其與MITF基因參考序列進行比對。

2 結(jié)果

遺傳性皮膚病目標基因外顯子組測序結(jié)果顯示,先證者MITF基因第7號外顯子第649～651位核苷酸發(fā)生雜合性缺失突變(NM_000248,exon7,c.649_651delAGA),導致其編碼的第217位精氨酸缺失(p.R217del)。先證者父母均未檢出該突變,提示該突變?yōu)樾掳l(fā)突變(圖2)。該突變位點已有多例報道,已明確能夠?qū)е耊S[3,4]。該突變?yōu)榉侵貜托蛄袇^(qū)域框內(nèi)缺失,在正常人中頻率較低,突變與疾病表型符合共分離。根據(jù)ACMG指南,可判斷該突變是導致該患者出現(xiàn)WS的致病性突變[5]。

3 討論

隨著測序技術(shù)的進步,WS的發(fā)病機制逐漸被揭示。目前關(guān)于WS發(fā)病機制的學說較多,而較為公認的假說為胚胎時期神經(jīng)嵴的分化異常。在神經(jīng)嵴細胞遷移的過程中,其可分化成為外胚層和非外胚層兩部分。外胚層間質(zhì)衍生為骨、軟骨等組織,而非外胚層間質(zhì)可衍生為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和黑色素細胞等[6,7]。調(diào)控神經(jīng)嵴細胞發(fā)育或黑色素細胞形成、分化等過程的基因突變或表達異常,可引起皮膚、毛發(fā)等的色素改變及其他骨骼、肌肉等的異常。黑素細胞向皮膚遷移和分化過程發(fā)生異常,引起表皮基底層和毛囊黑素小體生成的黑色素減少,導致皮膚色素減退。當黑素細胞從神經(jīng)嵴向耳蝸血管紋遷移與分化過程中出現(xiàn)異常,會導致黑素細胞來源的中間細胞減少、毛細胞缺失和耳蝸結(jié)構(gòu)缺陷,影響內(nèi)耳結(jié)構(gòu)發(fā)育從而導致感音神經(jīng)性耳聾。

WS具有遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性,已明確的致病基因包括MITF、PAX3、SOX10、EDN3、EDNRB和SNAI2。研究表明WS1型和WS3型主要由PAX3基因突變導致,患者表現(xiàn)為皮膚、毛發(fā)、虹膜等色素改變,先天性耳聾以及特征性表現(xiàn)內(nèi)眥外移,WS3型還常合并肌肉、骨骼發(fā)育異常。30%的WS2型由MITF、SOX10、SNAI2基因突變引起,70%的WS2型患者病因不明,患者不表現(xiàn)為內(nèi)眥外移。WS4型患者主要由SOX10、EDN3、EDNRB突變引起,常伴有先天性巨結(jié)腸等消化道改變。其中MITF作為關(guān)鍵分子與其它基因共同參與神經(jīng)嵴的發(fā)育及黑色素細胞的形成和分化[8]。MITF基因位于3號染色體短臂p12.3-p14.1區(qū)域,存在9個可選擇的啟動子,能產(chǎn)生10種亞型的轉(zhuǎn)錄本,其中與黑色素細胞形成有關(guān)的是轉(zhuǎn)錄本MITF-M型[9]。該型包含9個外顯子,廣泛表達于黑色素細胞。其編碼的MITF蛋白含有419個氨基酸,是一種含有螺旋-環(huán)-螺旋堿性亮氨酸拉鏈(basic-helix-loop-helix leucine zipper,b-HLH-Zip)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。HLH結(jié)構(gòu)域由第201～261號的60個氨基酸組成,這一氨基酸序列高度保守并具有與DNA結(jié)合形成二聚體的功能。MITF以二聚體的形式激活色素細胞特異性基因TYR,使其表達黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶,從而調(diào)控黑色素的合成與代謝[10]。

MITF突變以雜合為主,目前僅報道過2個WS家系為MITF純合突變(純合c.33+5G>C突變和純合c.668G>A突變)。先證者為純合c.33+5G>C突變,其父母均為雜合攜帶者且為近親結(jié)婚,純合患者表型比家系中雜合患者更重。純合c.668G>A突變患者父母無癥狀,但先證者表現(xiàn)為比WS2型更為嚴重的WS4型[11,12]。在WS微型豬模型中,Mitf雜合突變表現(xiàn)為聽力喪失、色素減退等,而Mitf純合突變可導致更嚴重的無眼畸形[13]。此外,MITF純合突變導致COMMAND綜合征也有少量報道[14]。本例WS患者MITF基因7號外顯子第649～651位核苷酸發(fā)生缺失突變(NM_000248,exon7,c.649_651delAGA),導致其編碼的第217位精氨酸缺失,該突變位點已有多例報道,但尚無該位點的純合病例。由于患者父母均未檢測到該位點的突變,提示該突變?yōu)樾掳l(fā)突變。研究表明,MITF的突變熱點集中在7號和8號外顯子,與b-HLH-Zip所在的區(qū)域?qū)?為DNA結(jié)合區(qū)。b-HLH-Zip結(jié)構(gòu)的破壞會使得MITF與酪氨酸激酶啟動子區(qū)域CATGTG的結(jié)合能力下降。我國報道的WS突變中c.649_651delAGA(p.R217del)和c.640C>T(p.R21411X)均被多次報道,推測可能為熱點突變。p.R217del正好位于b-HLH-Zip結(jié)構(gòu)域內(nèi),有文獻報道該突變將影響MITF蛋白在細胞核中的定位,并產(chǎn)生顯性負效應,影響野生型MITF蛋白的功能[4,15]。此外,MITF突變還可導致Tietz綜合征和COMMAD綜合征[14,16],并提高機體對黑色素瘤的易感性。MITF突變引起多種疾病的原因尚不明確,可能是個體差異或臨床異質(zhì)性,故仍定期隨訪。

我國Waardenburg綜合征病例并不罕見,患者常因聽力喪失而首診于耳鼻喉頭頸外科,故常由耳鼻喉科醫(yī)師報道,皮膚科醫(yī)師若缺乏與此病相關(guān)的理論知識將導致誤診或漏診。由于WS2型患者常伴有先天性感音神經(jīng)性耳聾,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,因此一旦懷疑此病應當及時開展基因檢測以明確診斷。對于不伴有聽力障礙的WS其它亞型患者,其皮膚、毛發(fā)、虹膜色素改變等體征也有利于診斷此病,可建議患者及早進行聽力檢查、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等。