黃河銀 王江 張藍(lán)之 張勤修，5 吳小娟 龐銳

在近20 年“針刺治療變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis,AR）”的療效評價中，學(xué)界的共識是：針刺治療AR 能減輕癥狀，延長緩解期，降低復(fù)發(fā)率[1-3]。而用穴位埋線治療AR 是對針刺的優(yōu)化，因?yàn)槁窬€會在體內(nèi)液化，對周邊淋巴組織二度致敏[4，5]，對穴位的物理刺激和生化影響可達(dá)3 周[6]。但在近10 年“穴位埋線治療AR”的動物實(shí)驗(yàn)中，少有對AR 三個亞型（肺虛型、脾虛性、腎虛型）的研究。據(jù)此，本次實(shí)驗(yàn)制作復(fù)合性大鼠模型，先通過“硫磺艾條煙熏法”制作肺虛模型，再通過“卵清蛋白致敏法”建立AR模型。最后行穴位埋線3 周，通過“留針后作用”和“埋針后效應(yīng)”[7]觀察了大鼠噴嚏、流涕、揉鼻等行為學(xué)變化，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。

資料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

購置SPF 級SD 大鼠45 只，雌性，9 月齡，體重268～326g，來源并寄養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（川）2018-100。選擇隨機(jī)數(shù)字表，將大鼠分為三組，每組各15 只，A 組為埋線組（先造模后埋線），B 組為模型組（只造模不埋線），C 組為空白組（不造模不埋線）。

2 制作肺虛模型

參照陳小野[8]的方法建立實(shí)驗(yàn)動物肺氣虛證模型。通過在大鼠飼養(yǎng)筐上覆蓋透明有機(jī)玻璃板的方式自制煙熏造模箱，體積約80cm×60cm×60cm，底部放置墊料。自制煙熏艾條，內(nèi)含硫磺粉8g 和艾絨32g，長150mm，直徑20mm。煙熏箱內(nèi)每次只放6 只大鼠，每次煙熏30min，每天熏2 次，上午、下午各1次，至少間隔3h，連熏14d。

3 制作AR 模型

①基礎(chǔ)致敏。按卵清蛋白（ovalbumin,OVA，成都貝斯特試劑有限公司，批號B010720）1mg：氫氧化鋁（成都貝斯特試劑有限公司，批號B002615）30 mg∶生理鹽水（北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H50020010）1ml 配置致敏液。對A、B兩組行“五點(diǎn)注射法”[9]：腹腔+雙側(cè)腹股溝+雙側(cè)后足趾。每點(diǎn)注射0.2ml，隔日一次，共5 次。C 組以等量生理鹽水注射。②強(qiáng)化致敏。在基礎(chǔ)致敏結(jié)束后進(jìn)行，用1%OVA 對A、B 兩組每d 滴鼻1 次，每鼻孔各3 滴，C 組以等量生理鹽水滴鼻。滴鼻30min后，用1%OVA 霧化，每d1 次，每次45min。C 組以等量生理鹽水霧化。共7d。③維持致敏。在強(qiáng)化致敏結(jié)束后進(jìn)行，對A 組行穴位埋線3 周，期間用1%OVA 滴鼻：隔日一次，每鼻孔3 滴。B、C 兩組以等量生理鹽水滴鼻。

4 穴位選擇

①定位百會穴：先以雙眼后緣作一假想直線，再以雙耳前緣作一假想直線，兩線平行，和鼠身的中軸線會有兩個交點(diǎn)，兩個交點(diǎn)的中點(diǎn)即為百會穴[10]。埋線時，從前向后斜刺2mm 即可，夾角以30度為宜[11]。②定位肺俞穴和脾俞穴：先找“大椎”[12]，再依次數(shù)到T3 和T12 的棘突，向兩側(cè)旁開3mm。

5 穴位埋線

①消毒，選用規(guī)格為0.9 的一次性埋線針，退出針芯約2cm，在針尖處插入5mm 的000 號羊腸線。②針尖斜面向上，找準(zhǔn)穴位，定好角度，快速刺破皮膚，伴隨著落空感再深入5mm，即可突破脂肪層，到達(dá)皮下和肌肉之間的最佳埋線處[9]。③推針芯到底，將羊腸線送入，拔針，棉球按壓1min。

6 記錄行為學(xué)特征

從基礎(chǔ)致敏的第一天開始，即對三組大鼠的抓鼻、流涕、噴嚏的現(xiàn)象進(jìn)行記錄并按照下表標(biāo)準(zhǔn)打分。每天觀察1 次，每次觀察半小時。直至維持致敏結(jié)束后，計(jì)算出各組計(jì)分的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，見表1。

表1 大鼠AR 行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若樣本符合正態(tài)分布，用ANOVA 法作兩兩比較。不為正態(tài)則用秩和檢驗(yàn)。

結(jié)果

1 肺虛造模致死事件

2020 年8 月6 日，在行3 根灸條同時煙熏的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，一鼠突發(fā)抽搐死亡。解剖鼠尸：肺（圖1）和氣管（圖2）充血腫脹。圖3：雙肺氣腫，腸黏膜蒼白，胃中無內(nèi)容物。經(jīng)驗(yàn)：在煙熏中，大鼠的食欲下降，耐受力和抵抗力也下降。教訓(xùn)：3 根灸條的煙霧太大，應(yīng)減為2 根。

圖1

圖2

圖3

2 致敏后的變態(tài)反應(yīng)

A、B 兩組在致敏前，均未見抓鼻、揉眼、撓耳、脫毛、流涕、蹭身、噴嚏等表現(xiàn)，致敏后可見：左手抓鼻（圖4），右手抓鼻（圖5），雙手抓鼻（圖6），左手揉眼（圖7），右手揉眼（圖8），雙手揉眼（圖9），左手撓耳（圖10），右手撓耳（圖11），耳后脫毛（圖12），外鼻常濕（圖13），鼻癢蹭身（圖14）。

圖4

圖5

圖6

圖7

圖8

圖9

圖10

圖11

圖12

圖13

圖14

3 三組大鼠的行為學(xué)對比

①造模前后的呼吸頻率增幅：PAB＝0.084，PAC＜0.001，PBC＜0.001。②造模前后的體重質(zhì)量增幅：PAB＝0.205，PAC＜0.001，PBC＜0.001。

4 三組大鼠的行為學(xué)評分之“階段性總分”（圖15，表2）

表2 三組大鼠在造模各階段結(jié)束后的行為學(xué)總分（階段性總分,）

表2 三組大鼠在造模各階段結(jié)束后的行為學(xué)總分（階段性總分,）

圖15

分別于AR 大鼠模型制作中的各階段（基礎(chǔ)致敏、強(qiáng)化致敏、維持致敏）結(jié)束后，對三組大鼠三種癥狀（抓鼻、流涕、噴嚏）的行為學(xué)總分進(jìn)行單因素方差分析：A、B 兩組差異在維持致敏結(jié)束后出現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

5 三組大鼠的行為學(xué)評分之“終點(diǎn)因子分”（圖16，表3）

表3 維持致敏結(jié)束后三組大鼠的行為學(xué)因子評分（終點(diǎn)因子分，）

表3 維持致敏結(jié)束后三組大鼠的行為學(xué)因子評分（終點(diǎn)因子分，）

圖16

在維持致敏這一終點(diǎn)事件結(jié)束后，對三組大鼠噴嚏、流涕、抓鼻的三種行為分別進(jìn)行因子評分。方差比較結(jié)果顯示：A、B 兩組、A、C 兩組、B、C 兩組的每個因子的差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

關(guān)于“肺虛型AR 動物模型”制作成功的標(biāo)準(zhǔn)？①目前在知網(wǎng)上尚未查見對肺虛模型的判定方法，但陳小野在肺虛模型的制備過程中明確提出[8]：二氧化硫可以單獨(dú)熏制慢支炎的肺虛模型，二氧化硫加無載體I131可聯(lián)合熏制有內(nèi)分泌功能改變的慢支炎肺虛模型。反觀本次實(shí)驗(yàn)中用到的自制灸條，含8g 硫磺粉和32g 艾絨。硫磺在氧氣中燃燒產(chǎn)生二氧化硫，這和陳小野的理論是一致的。②本次實(shí)驗(yàn)中用到的自制灸條配方來源于何苗在2017 年博士論文中的經(jīng)驗(yàn)[13]，其造模方法和本次實(shí)驗(yàn)是相同的。③通過本次實(shí)驗(yàn)在煙熏過程中突發(fā)的致死事件，我們意外發(fā)現(xiàn)：亡鼠的肺和氣管充血腫脹，雙肺氣腫，符合肺氣虛證的表征。④通過行為學(xué)積分來判定AR模型：當(dāng)大鼠進(jìn)入維持致敏的階段后，需要每天計(jì)算行為學(xué)總積分，只要大于5 分即可判為AR 造模成功。

關(guān)于“五點(diǎn)注射法”（雙側(cè)腹股溝、雙側(cè)后足趾、腹腔正中）制作AR 動物模型的優(yōu)勢？2013 年，劉敏[9]發(fā)現(xiàn)：滴鼻激發(fā)組的行為學(xué)癥狀評分為5.38，霧化激發(fā)組為6.38，滴鼻加霧化激發(fā)組為8.12，空白組為0.62。這些數(shù)據(jù)優(yōu)化了制作AR 動物模型的認(rèn)知，證明“滴鼻加霧化”是最好選擇。楊莎莎認(rèn)為[14]：腹股溝注射可通過淋巴吸收，后足趾注射可通過肌肉和毛細(xì)血管吸收，腹腔注射可通過黏膜吸收；吸收方式多樣化，藥液濃度最大化，注射部位多變化，致敏效果最優(yōu)化。

關(guān)于AR 模型實(shí)驗(yàn)動物的選擇？本次實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)觀察比較全面，AR 的行為學(xué)表現(xiàn)也比較明顯，這說明大鼠是制作AR 動物模型的最佳選擇[15]：性狀穩(wěn)定，嗅覺靈敏，遲發(fā)效應(yīng)顯著，容易誘發(fā)過敏，對環(huán)境中的氣體極為敏感，具有高度可比性、參照性、追蹤性。反觀小鼠[16，17]：對環(huán)境的適應(yīng)較弱，對呼吸道疾病的抵抗力差，不能耐受煙熏反應(yīng)。反觀豚鼠[18]：不能耐受低溫和混濁空氣，否則會導(dǎo)致肺炎，且其變態(tài)反應(yīng)多由IgG 介導(dǎo)，與人類AR 的發(fā)病機(jī)制不同，無可比性。

就本次實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)研究而言，可知穴位埋線3 周對肺虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠已見明顯療效，但機(jī)體中的變態(tài)反應(yīng)仍在持續(xù)，故有必要延長穴位埋線的時間，跟進(jìn)治療觀察。但本次實(shí)驗(yàn)的復(fù)合性造模是否成功，單靠行為學(xué)判斷還不夠，另需免疫組化和免疫熒光分析，尋找組織學(xué)和病理學(xué)的有力證據(jù)。