陳祎,楊太旺,王明生

(1.九江市第一人民醫(yī)院,江西 九江 332000;2.九江市中醫(yī)醫(yī)院,江西 九江 332002)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發(fā)癥,且伴隨著我國人口老齡化的加劇,糖尿病患者的日益增多,DN的發(fā)病率也逐年增加[1]。DN病理特征以腎小球濾過率增加、基底膜和系膜增厚以及晚期的腎小球硬化和腎小管纖維化為主,是終末期腎臟疾病的主要原因之一[2-4]。研究證實[5],持續(xù)的高血糖會導致活性氧簇的過度產(chǎn)生和炎癥介質的激活,引起氧化應激損傷,進而導致糖尿病患者的血管和腎臟受損。目前,由于氧化應激發(fā)生的相關通路復雜且靶點較多,所以DN發(fā)病的氧化應激機制仍未闡明。天然黃酮木脂素類化合物水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊中提取出來的一種生物活性的物質。研究表明[6],水飛薊素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒和抗腫瘤等作用。目前,國內外對于藥用植物對腎臟的保護作用給予了更多關注。研究表明[7]水飛薊素對糖尿病和抗腎小管間質纖維化和腎小球硬化也有預防和治療作用。本研究擬采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠動物模型探討水飛薊素通過共同抑制Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)和腫瘤壞死因子/活性氧簇/p38絲裂原活化蛋白激酶(TNF-α/ROS/P38MAPK)通路減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機制,為治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)、檸檬酸鹽緩沖液(福建飛凈)、水飛薊素(上海安博)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司)、AU640型全自動生化分析儀(Ltd公司)、F6/10型勻漿機(上海凈信)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成)、引物(Sangon公司)。

1.2 STZ誘導糖尿病大鼠模型的建立及分組

健康SD大鼠50 只,雌雄各25 只,8～12 周齡,體質量170～200 g。無特定病原體(SPF)級環(huán)境,光照、室溫、濕度符合要求,自由飲水,進食標準普通飼料,收集尿液檢測尿蛋白陰性,在九江學院實驗動物中心飼養(yǎng),動物福利和實驗程序均符合實驗動物倫理標準。

將50 只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為建模組40 只和對照組10 只。建模組大鼠在隔夜禁食后給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周后,通過腹腔注射溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)中新鮮制備的STZ(30 mg/kg)誘發(fā)糖尿病,對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。4 周后測24 h尿白蛋白排泄率>20 mg且尿糖陽性提示糖尿病腎病建模成功。建模成功后將建模大鼠40 只按隨機數(shù)字表法分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,每組10 只,分別用0,100,300,900 μg/kg水飛薊素治療8 周。所有動物均按照實驗室指南進行養(yǎng)殖。

1.3 生化分析

治療結束后24 h采集尾靜脈血,利用全自動生化分析儀測定各組大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、β2微球蛋白(β2-MG)水平。收集24 h大鼠尿液,測定24 h尿蛋白(UTP)。

1.4 腎臟指數(shù)

腹腔注射麻醉,于冰上迅速摘取大鼠雙側腎臟組織,以預冷的PBS清洗干凈后,用濾紙吸干、稱重,計算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=雙腎重之和(mg)/體質量(g)。

1.5 氧化應激指標測定

根據(jù)重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,稱取大鼠腎皮質剪碎,放入勻漿機,加入相應量的生理鹽水或PBS,勻漿機30 HZ×1 min×3 次進行勻漿后用高速離心機12 000 r/min離心10 min,取上清分裝,參照試劑盒說明書測定反映氧化應激水平的MDA,T-AOC等氧化應激指標。

1.6 RT-PCR檢測信號通路相關mRNA

測定TLR4,NF-κB,TNF-α和P38MAPK等mRNA的表達:Trizol法提取腎臟組織中RNA,應用反轉錄試劑盒進行互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成,按比例加入cDNA、引物和染料,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s循環(huán)40 次擴增,采用2-ΔΔCt方程計算目的基因的相對表達量[7]。mRNA的數(shù)量用內部參照標準化。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 水飛薊素對各組大鼠體質量及腎臟指數(shù)的影響

低、中、高水飛薊素組體質量均低于對照組,均高于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);低、中、高水飛薊素組腎臟指數(shù)均高于對照組,均低于模型組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠體質量及腎臟指數(shù)比較

2.2 水飛薊素對各組大鼠血糖及腎臟功能的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),高劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 各組血糖及腎臟功能比較

2.3 水飛薊素對各組大鼠氧化應激指標影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均高于對照組,T-AOC水平均低于對照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均低于模型組(P<0.05),T-AOC水平均高于模型組(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠氧化應激指標的比較

2.4 水飛薊素對各組大鼠腎組織中mRNA表達水平的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達水平均高于對照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達水平均高于對照組(P<0.05),高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達水平高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠腎組織中mRNA的表達水平比較

3 討 論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、遺傳因素和炎癥是參與DN發(fā)展的重要原因。目前臨床治療手段主要為早中期采用控制飲食、降糖藥、血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑等藥物進行治療,晚期治療方式為腎臟替代治療[8]。但目前的治療手段都不能改善終末期腎病患者的腎臟狀況,其生活質量往往較差。水飛薊素是一種類黃酮化合物,具有免疫調節(jié)、改善氧化應激等作用。Sheela等[9]利用STZ和煙酰胺誘導制備了DN大鼠模型,接受水飛薊素治療大鼠的血糖、糖化血紅蛋白和尿白蛋白水平顯著降低,組織病理學評估顯示病理損傷減少。有研究表明[10],水飛薊素可以降低糖尿病腎病患者尿蛋白,改善腎臟損傷,是糖尿病腎病潛在的治療藥物。但有關水飛薊素對DN氧化應激影響的作用機制研究較少。本研究采用STZ誘導糖尿病腎病大鼠動物模型,將大鼠分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,觀察水飛薊素對通過共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK信號通路,減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機制,以期為治療DN提供新思路。Scr,BUN是臨床評價腎功能損傷的常規(guī)指標。近年來研究表明[11-12],Cys-C,β2-MG在腎小球濾過功能下降早期即可變化,是反映腎小球濾過率的理想指標。張玉梅等[13]研究發(fā)現(xiàn),Hcy,Cys-C,β2-MG水平與DN的進展密切相關。本研究中模型組大鼠Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平明顯高于對照組,不同劑量水飛薊素治療大鼠的Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,表明水飛薊素可明顯減輕DN大鼠的腎臟損傷。TLR4/NF-κB通路是介導炎癥反應的關鍵信號通路,TLR4能誘導NF-κB活性增加,NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子的表達,同時TNF-α可在DN中特異表達,產(chǎn)生大量氧自由基,導致腎臟結構受損[14]。過量的ROS導致的氧化應激是DN發(fā)生的重要機制[15]。P38MAPK也可影響DN的進展[16]。本研究中,模型組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達及MDA水平明顯高于對照組,不同劑量水飛薊素組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達及MDA水平均低于模型組,T-AOC水平高于模型組并呈一定程度的濃度依賴性,提示水飛薊素可調控TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路,可通過抑制其激活減輕氧化應激,進而減輕DN大鼠的腎臟損傷。

本研究的證據(jù)效力還存在一定不足,后續(xù)還需通過激活和抑制該通路進行對照驗證,進而對水飛薊素治療DN的藥理機制進行更全面明確的闡釋。