許家豪，耿夢(mèng)雅，劉海軍，裴文俊，顧靜，漆夢(mèng)湘，章堯，呂坤，宋迎迎，劉苗苗，胡鑫，余翠，何春玲，王李卓，高家林，2，，

皖南醫(yī)學(xué)院1弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，2弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病研究所，3臨床醫(yī)學(xué)院，4安徽省活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，6中心實(shí)驗(yàn)室，7重大疾病非編碼RNA轉(zhuǎn)化研究安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，8皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽蕪湖 241002

目前，溶酶體為細(xì)胞穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的角色［1］。作為溶酶體中眾多特殊蛋白質(zhì)的一種，溶酶體膜蛋白的作用與機(jī)制以及相應(yīng)的生理學(xué)功能在其維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用［2］。研究報(bào)道，人腎優(yōu)勢(shì)蛋白NCU-G1作為一種高度保守的蛋白質(zhì)，其缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠自發(fā)性的肝纖維化［3］。溶酶體相關(guān)膜糖蛋白3通過(guò)影響小鼠氣道阻力，在調(diào)節(jié)肺表面活性劑穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要［4］。在帕金森病相關(guān)的小鼠模型中，跨膜蛋白175能夠影響運(yùn)動(dòng)損傷和多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，而在帕金森病中起到重要作用［5］。因此，了解溶酶體膜蛋白參與的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)闡明其關(guān)鍵作用有重要價(jià)值。然而，盡管已有100多種溶酶體膜蛋白被發(fā)掘和深入研究［6］，但部分溶酶體膜蛋白的作用靶點(diǎn)和介導(dǎo)機(jī)制仍然未知。

作為細(xì)胞死亡的一種主動(dòng)機(jī)制，細(xì)胞凋亡同時(shí)也是眾多生物系統(tǒng)中的重要過(guò)程［7］。程序性細(xì)胞死亡可在溶酶體膜透化和內(nèi)容物的釋放過(guò)程中發(fā)生，這樣使得在溶酶體膜蛋白循環(huán)利用的同時(shí)，受損溶酶體功能也能得到逐漸恢復(fù)［8］。這種特殊的生理過(guò)程在溶酶體膜蛋白中有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)溶酶體相關(guān)多跨膜蛋白5水平的下調(diào)抑制了細(xì)胞增殖和其活力［8］，溶酶體跨膜蛋白192的缺乏也會(huì)激活細(xì)胞凋亡的發(fā)生［9］。可見(jiàn)溶酶體膜蛋白與凋亡密不可分的關(guān)系。

SID1跨膜家族成員2（Sidt2）被發(fā)現(xiàn)是一種新型多通道溶酶體膜蛋白［10］，已有研究發(fā)現(xiàn)Sidt2作為自噬-溶酶體降解途徑中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)維持同樣是富含溶酶體的腎臟組織具有重要作用［11］。研究指出Sidt2可通過(guò)調(diào)節(jié)終末期的自噬來(lái)影響肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝［12］和引發(fā)自噬受損［13］，但對(duì)于其凋亡的具體機(jī)制并未得到探究。溶酶體參與消化細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的物質(zhì)，是否涉及自噬調(diào)節(jié)和介導(dǎo)的相關(guān)步驟尚未知？因此，本研究旨在發(fā)掘Sidt2引起肝臟細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制，希望為相關(guān)疾病干預(yù)找到潛在的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

HL7702人肝臟細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)），用含有10%FBS(Excell Bio)的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度保持在37 ℃，CO2濃度保持在5%。CQ（Sigma），用DMSO 配制成CQ 工作液，4 ℃冰箱保存。細(xì)胞自噬染色檢測(cè)（MDC）試劑盒（碧云天）。

1.2 使用CRISPR/Cas9基因編輯慢病毒載體系統(tǒng)剔除Sidt2基因

購(gòu)買(mǎi)Lenticrispr-v2（AddgenePlasmid49535）質(zhì)粒，利用sgRNA在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)靶向Sidt2的sgRNA，序列如下（F:5'-CACCGCAGGTG CCCCTAATCCTGCG-3'，R:5'-AAACCGCAGGATTA GGGGCACCTGC-3'），通過(guò)生物公司（SangonBiotech）進(jìn)行合成，使用CRISPR/Cas9 lentivirus system，將Lenticrispr-v2質(zhì)粒線性化，與退火的sgRNA雙鏈進(jìn)行連接，構(gòu)建Lenticrispr-v2-Sidt2重組質(zhì)粒。使用Vigofect（VigorousBiotechnology,China）轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染Lenticrispr-v2質(zhì)粒和Lenticrispr-v2-Sidt2重組質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒，將得到的慢病毒轉(zhuǎn)染HL7702細(xì)胞，48 h后使用嘌林霉素篩選72 h，生存下來(lái)的細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功的Sidt2+/+組和Sidt2-/-組。

1.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

將分組處理后的HL7702細(xì)胞，用冰PBS洗滌2次后加入含PMSF（碧云天）的細(xì)胞裂解液，收集全部細(xì)胞裂解液，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（新芝生物科技有限公司）裂解細(xì)胞2次，冰上靜置裂解細(xì)胞30 min，收集裂解液，放入預(yù)冷4 ℃的超高冷凍速離心機(jī)（Beckman）離心5～10 min，12 000g。分裝100 μL/管蛋白裂解液，加入25 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸10 min后進(jìn)行電泳。將電泳結(jié)束后分離的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用含有1 g脫脂奶粉和20 mL 1×TBST溶液的封閉液進(jìn)行封閉2 h。TBST輕柔漂洗后加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，兔抗LC3B（1∶1000;Cell signaling technology），鼠抗β-actin（1∶1000;Sigma-Aldrich），鼠抗P62（1∶1000;abcam），兔抗SIDT2（1∶1000;abnova），TBST清洗3次10 min/次后加入二抗中室溫孵育1.5～2 h，TBST清洗3次、10 min/次后使用ECL發(fā)光液和成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有結(jié)果均使用Image J軟件對(duì)蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取24孔板中各實(shí)驗(yàn)組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入用完全培養(yǎng)基1000∶1 稀釋后的試劑A，混勻后孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，5 min/次，加入150 μL/孔多聚甲醛，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整孵育時(shí)間，棄去固定液，每孔加入150 μL甘氨酸，孵育5 min后棄去，加入300 μL/孔PBS清洗5 min后棄去，加入300 μL/孔滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS），孵育10 min，PBS清洗1次，5 min，加入300 μL/孔的1×Apollo染色液，避光孵育30 min后棄去，加入300 μL/孔滲透劑脫色清洗2～3次，10 min/次，棄去，加入100 μL/孔1×Hoechst33342反應(yīng)液孵育0.5 h，PBS清洗3次，5 min/次，使用Olympus CKX53熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

取12 孔板中細(xì)胞數(shù)量不低于1×105的實(shí)驗(yàn)組，用不含有EDTA的胰酶對(duì)貼壁的HL7702細(xì)胞進(jìn)行消化收集，在預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中2000 r/min離心5 min收集懸浮細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞兩次后，以2000 r/min離心5 min收集1×105～5×105后，每個(gè)離心管中加入500 μL的Binding Buffer進(jìn)一步懸浮細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組加入5 μLAnnexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻后室溫避光孵育5～15 min，并在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀(Beckman cytoflex)的上機(jī)檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)

將細(xì)胞接種在玻底培養(yǎng)皿上，PBS清洗1次后加入MDC染液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育15 min后，吸凈MDC染色液，Assay Buffer清洗3次，再加入1 mL Assay Buffer，置于在激光共聚焦顯微鏡（Olympus,Japan)在激發(fā)波長(zhǎng)為330～360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510～540 nm觀察自噬體的染色熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究各實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Sidt2基因剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞增殖活性下降

對(duì)HL7702細(xì)胞使用Crispr-Cas9技術(shù)進(jìn)行Sidt2基因的敲除，挑取單克隆細(xì)胞后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示模型構(gòu)建成功。Western blot 結(jié)果顯示，Sidt2-/-組較Sidt2+/+組蛋白水平降低（P＜0.05，圖1A、B），模型構(gòu)建成功。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生對(duì)照組細(xì)胞相比較，Sidt2基因下調(diào)導(dǎo)致肝HL7702細(xì)胞增殖速率下降（圖1C、D）。

圖1 Sidt2剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞增殖活性下降Fig.1 Sidt2 knockout (Sidt2-/-) HL7702 cells exhibit decreased cell proliferation.A,B:Western blotting for detecting Sidt2 protein expression before and after Sidt2 knockout.C,D:EdU experiments for assessing cell proliferation rates in Sidt2+/+and Sidt2-/-HL7702 cells.*P＜0.05.

2.2 Sidt2基因剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡增加

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在野生對(duì)照組細(xì)胞中，晚期凋亡和早期凋亡細(xì)胞的比例是（2.80±0.50）%，而在Sidt2基因缺失組的細(xì)胞中，晚期凋亡和早期凋亡細(xì)胞的比例是（14.43±0.55）%，即與野生對(duì)照組細(xì)胞相比較，Sidt2基因下調(diào)導(dǎo)致肝HL7702細(xì)胞凋亡速率明顯升高（圖2，P＜0.001）。

圖2 Sidt2剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡增加Fig.2 Sidt2-/- HL7702 cells exhibit increased apoptosis.A:Detection of apoptosis rate of the cells by flow cytometry;B:Quantitative analysis of the results.***P＜0.001.

2.3 Sidt2基因剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出自噬紊亂

對(duì)Sidt2基因剔除HL7702細(xì)胞模型進(jìn)行基礎(chǔ)自噬水平的檢測(cè)（圖3A），顯示Sidt2-/-細(xì)胞比較其對(duì)照細(xì)胞，出現(xiàn)了自噬關(guān)鍵蛋白LC3B 和P62 的堆積的現(xiàn)象（P＜0.05，圖3B），Sidt2-/-細(xì)胞的熒光強(qiáng)度大于對(duì)照組（P＜0.01，圖3C、D），自噬小體含量較對(duì)照組增多。

圖3 Sidt2剔除HL7702細(xì)胞表現(xiàn)出自噬紊亂Fig.3 Sidt2-/- HL7702 cells exhibit autophagy disturbances.A,B:Western blotting for detecting the expression of the key autophagy proteins before and after Sidt2 knockout.C,D:Effects of Sidt2 on the formation of autophagosomes of HL7702 cells and quantitative analysis of the results.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.4 CQ可以糾正Sidt2下調(diào)引起的LC3B和P62的升高異常

通過(guò)設(shè)置0、10、25、50、100、200 μmol/L的不同CQ濃度梯度干預(yù)，結(jié)果顯示當(dāng)CQ作用濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，繼續(xù)增加CQ的作用濃度，LC3B和P62的相對(duì)表達(dá)量不再增加，即CQ的飽和濃度為50 μmol/L（圖4A～C）。經(jīng)過(guò)50 μmol/L飽和濃度的CQ處理16 h后，HL7702細(xì)胞中的LC3B的降解被充分阻斷。此時(shí)，發(fā)現(xiàn)Sidt2+/+和Sidt2-/-組間原有的LC3B豐度差異消失（圖4D～F）。

圖4 CQ可以糾正Sidt2下調(diào)引起的LC3B和P62的升高異常Fig.4 Chloroquine(CQ)can correct abnormal upregulation of LC3B and P62 expressions induced by Sidt2 knockout.A:Western blotting for detecting LC3B and P62 expressions in HL7702 cells incubated with 0,10,25,50,100,or 200 μmol/L CQ for 16 h;B:LC3B expression level in HL7702 cells;C:P62 expression level in HL7702 cells;D-F:Western blotting for detecting key autophagy proteins in HL7702 cells before and after Sidt2 knockout.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 CQ進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖，并使凋亡進(jìn)一步惡化

經(jīng)50 μmol/L飽和濃度的CQ處理16 h后，結(jié)果顯示，不管是對(duì)Sidt2+/+或Sidt2-/-細(xì)胞而言，飽和濃度的CQ作用下，兩組細(xì)胞的增殖活性均明顯受到抑制（P＜0.05，圖5A、B），其凋亡率均明顯受到促進(jìn)（P＜0.05，圖5C、D）。

圖5 氯喹會(huì)使其進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖，并使凋亡進(jìn)一步惡化Fig.5 Chloroquine(CQ)further inhibits cell proliferation and increases apoptosis of Sidt2-/-HL7702 cells.A,B:CQ-induced proliferation of HL7702 cells before and after Sidt2 knockout(EdU staining,Scar bar:50 μm).C,D:CQ-induced apoptosis in HL7702 cells before and after Sidt2 knockout.***P＜0.001.

3 討論

已有研究證據(jù)指出，溶酶體膜蛋白與肝臟功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)［3,14,15］。不僅如此，作為溶酶體膜蛋白，Sidt2還被證實(shí)在系膜細(xì)胞的炎癥通路［16］，糖脂代謝［17］以及骨骼肌中線粒體質(zhì)量控制［18］中都發(fā)揮了重要的作用。而在同為溶酶體膜蛋白相關(guān)的研究中，凋亡相關(guān)蛋白3參與到維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中［19］，溶酶體相關(guān)膜蛋白3通過(guò)介導(dǎo)溶酶體膜透化引發(fā)細(xì)胞死亡［20］，這些研究提示Sidt2可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。因此，本研究使用Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Sidt2敲除的人肝臟HL7702細(xì)胞模型，并且研究了Sidt2缺失對(duì)人肝臟細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響及作用機(jī)制。通過(guò)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的活性，本研究表明Sidt2缺失后可導(dǎo)致人肝臟細(xì)胞狀態(tài)有所下調(diào)，使其增殖活性下降和凋亡率的增加。

自噬作為細(xì)胞和身體代謝的關(guān)鍵參與者［21］，常見(jiàn)的自噬類(lèi)型有：巨自噬，伴侶介導(dǎo)的自噬以及微自噬［22,23］，巨自噬即為本文中的自噬。有研究發(fā)現(xiàn)自噬與溶酶體膜蛋白的關(guān)系也密不可分，例如跨膜7超家族成員1被證實(shí)是小鼠足細(xì)胞中重要的自噬調(diào)節(jié)蛋白［24］。對(duì)此，我們展開(kāi)了Sidt2對(duì)自噬影響的深入研究。結(jié)果顯示，自噬關(guān)鍵蛋白LC3B和自噬底物P62的水平在Sidt2敲除后升高，即Sidt2缺失后出現(xiàn)自噬體的積累，這可能意味著自噬體數(shù)量增加或通過(guò)自噬體和溶酶體的融合阻斷自噬溶酶體的形成［25］。在影響腎臟的結(jié)構(gòu)和自噬的研究中，Sidt2缺失后發(fā)現(xiàn)自噬體與溶酶體的融合以及自噬溶酶體的降解受損，結(jié)果充分揭示了Sidt2在自噬溶酶體過(guò)程中至關(guān)重要［11］。溶酶體作為自噬過(guò)程中的重要細(xì)胞器［26］，自噬的降解能力來(lái)自于溶酶體［27］。結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果［7］，通過(guò)完成對(duì)自噬小體及溶酶體標(biāo)記蛋白免疫熒光共定位的檢測(cè)和使用溶酶體示蹤劑LysoTracker對(duì)Sidt2基因缺失前后酸性溶酶體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組相比，LC3B 與LAMP1的皮爾森相關(guān)系數(shù)降低，自噬小體與溶酶體融合減少，同時(shí)酸性溶酶體數(shù)量也發(fā)生了減少。因此，為了進(jìn)一步探索阻斷自噬溶酶體途徑是否會(huì)是Sidt2介導(dǎo)肝臟細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，我們研究了靶向自噬藥物CQ通過(guò)抑制自噬下游以觀察自噬通量的變化情況，CQ通過(guò)影響溶酶體的功能來(lái)抑制自噬中自噬體和溶酶體融合的過(guò)程［28］，經(jīng)典氯喹翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sidt2缺失引起的自噬流減少是由于自噬晚期障礙導(dǎo)致的。而在癌癥研究中，溶酶體功能障礙和自噬阻斷會(huì)有助于癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡［29］。因此，本研究分別在對(duì)照組和Sidt2剔除組中加入了CQ，并且設(shè)置和使用不同的濃度梯度摸索在人肝臟細(xì)胞中CQ抑制自噬的飽和濃度，結(jié)果顯示，當(dāng)CQ的濃度在50 μmol/L的作用下，LC3B和P62的表達(dá)均達(dá)到飽和狀態(tài)，在飽和濃度的CQ作用下，由Sidt2缺失所引發(fā)的LC3B和P62的差異完全消失，說(shuō)明為自噬晚期清除障礙所致。同樣具有損害溶酶體功能和誘導(dǎo)自噬作用的吲哚利西啶生物堿Swainsonine，被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［30］。所以Sidt2缺失導(dǎo)致的自噬紊亂可能會(huì)引發(fā)凋亡的增加，這為我們的下一步研究指明了方向。

溶酶體作為自噬和細(xì)胞死亡的必要調(diào)節(jié)劑［31］，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)自噬體-溶酶體區(qū)室參與程序性細(xì)胞死亡［32］。與細(xì)胞凋亡相反，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)成分的溶酶體降解提供能量和營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程，自噬可促進(jìn)細(xì)胞的存活［33］。鑒于細(xì)胞凋亡和自噬之間復(fù)雜的功能關(guān)系以及溶酶體膜蛋白缺失可引起的細(xì)胞自噬和凋亡之間的串?dāng)_［9,34,35］，本研究對(duì)Sidt2剔除前后并阻斷自噬溶酶體途徑后的細(xì)胞凋亡的發(fā)生進(jìn)行探究，結(jié)果顯示，同樣在飽和濃度的CQ作用下，這種誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用更加明顯，這說(shuō)明二者可能有著同樣的分子機(jī)制基礎(chǔ)，進(jìn)而從自噬溶酶體途徑層面解釋了溶酶體膜蛋白Sidt2是一個(gè)重要的凋亡調(diào)控蛋白。

綜上所述，溶酶體膜蛋白Sidt2缺失后肝臟細(xì)胞的增殖受到抑制并凋亡水平上調(diào)，在抑制其自噬通量后可表現(xiàn)出增加的細(xì)胞毒性死亡和活性的減弱，從凋亡層面來(lái)揭示了Sidt2不通過(guò)抑制自噬溶酶體途徑介導(dǎo)凋亡。但本研究也存在不足之處，如缺乏對(duì)ATG12、ATG15等凋亡關(guān)鍵蛋白分子的檢測(cè)，自噬水平下調(diào)后溶酶體膜蛋白Sidt2在增殖和凋亡中的詳細(xì)機(jī)制和其他自噬誘導(dǎo)劑對(duì)于其增殖和凋亡的影響還有待進(jìn)一步深究，以及在研究過(guò)程中無(wú)法選擇相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照藥物。這些需要在后續(xù)的研究進(jìn)展中得出Sidt2調(diào)控肝臟細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制，從而為明確溶酶體膜蛋白Sidt2可能成為早期肝臟疾病診斷的新指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。